Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

Cardiomyocyten gegenereerd uit geïnduceerde Pluripotente Stam of IPS cellen worden steeds vaker gebruikt om een verscheidenheid aan biologische vragen op het gebied van cardiale elektrofysiologie te beantwoorden. De belangrijkste voordelen van deze technologie zijn dat het een dramatische toename van de doorvoer mogelijk maakt, evenals subtypespecifieke actie potentiële opnames in ventriculaire zoals myocyten, met behulp van een ventriculaire specifieke promotor element. De introductie van genetisch gecodeerde spanningssensoren door lentivirale transductie maakt de optische beeldvorming van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide cardiomyocyten actiemogelijkheden mogelijk.

Begin met het mengen van lentivirus-bevattende celcultuur supernatant met cardiomyocyte onderhoudsmedium, bij een verhouding één op één. Voeg hexadimetherine bromide met een uiteindelijke concentratie van 8 microgram per milliliter, om de infectie efficiëntie te verbeteren. En vervang het cardiomyocyte onderhoudsmedium in de IPS cel-afgeleide cardiomyocyten cultuurschotel, met het infectiemedium.

Kweek de geïnfecteerde cardiomyocyten gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius en vervang het infectiemedium door vers cardiomyocyten onderhoudsmedium. Voor beeldvorming wissel je het celkweekmedium uit met de oplossing van Tyrode, aangevuld met calcium. Plaats vervolgens de cardiomyocyten in een beeldkamer op het podium van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een beeldsplinator.

Als elektrische pacing nodig is, installeer pacing elektroden in de beeldkamer en sluit de elektroden aan op een stimulus generator. Breng de cellen in beeld en zoek een cel die de genetisch gecodeerde spanningsindicator in het midden van het kijkveld uitdrukt. Stel het optische pad zo in dat het uitgezonden licht naar de beeldsplin wordt gerouteerd en schakel de filterkubus in de microscoop over op het pad dat moet worden gecombineerd met de filters in de beeldspl splitter.

Stel in de software die de camera bestuurt de acquisitie-instelling zo in dat snelle beeldvorming mogelijk is en stel de beeldsplitser in volgens de instructies van de fabrikant. De twee beelden die de twee verschillende emissiegolflengtebanden vertegenwoordigen, moeten naast elkaar liggen, die elk de helft van het beeld bezetten. Controleer en pas de focus van het beeld dat door de camera wordt geproduceerd indien nodig aan.

En pas de helderheid van het verlichtingslicht aan, zodat pixelverzadiging wordt vermeden. Stel de verwerving van de tijdreeks in en dim het licht in de ruimte om strooilicht te voorkomen dat de meting beïnvloedt. Open vervolgens de excitatielichtluiter en begin met de aankoop van de beeldreeks, waarbij de elektrische pacing op het juiste tijdstip begint, als experimenteel geschikt.

Wanneer de overname is voltooid, sluit u de excitatielichtluis indien nodig en slaat u de opname op de harde schijf. Als u vervolgens de opnameinstelling ongewijzigd laat, neemt u de achtergrond op over een gebied van de coverslip zonder cellen. Voor analyse van de optische membraan potentiële opnames, open de tiff stack met de cellen in ImageJ, en gebruik maken van de vrije hand selectie tool om een regio van belang te trekken over een fluorescerende cardiomyocyte, in het rode kanaal, zorg ervoor dat het gebied groot genoeg is dat de cel niet zal bewegen uit de regio, terwijl contracting.

Selecteer vervolgens Analyseren, Extra's, Regiobelang manager en selecteer T toevoegen, om de regio toe te voegen als Regio van Belang 1. Sleep het interessegebied over dezelfde cel in het groene kanaal en voeg deze regio toe als Regio van Belang 2. Schakel onder de menu's Metingen analyseren en instellen alle opties uit, behalve de gemiddelde grijswaarde.

Klik in de Regio van belang manager op Meer en meer meten om de opties Meten alle segmenten en Één rij per segment te selecteren en klik op OK. Er wordt een venster geopend met een spreadsheet met de drie rijen. Gebruik Bestand en Opslaan als om de spreadsheet op te slaan in een door komma's gescheiden waardebestand. Sluit het venster met de afbeeldingsstapel en het spreadsheetvenster zonder het venster Regio van Belangbeheer te sluiten en open de tiff-stapel met de achtergrondmeting.

Klik in de regio van belang manager op de meer en meerdere meting om de opties Alle segmenten en Één rij per segment te selecteren en klik op OK. Sla vervolgens de achtergrondgegevens op in een apart csv-bestand. Hier wordt een representatieve cardiomyocyte van één IPS-cel afgebeeld met de witte stippellijnen die de interessegebieden markeren, die zijn getrokken tijdens de beeldvormingsanalyse in de RFP- en GFP-kanalen. Het signaal van het RFP-kanaal toont een periodieke toename van fluorescerende intensiteit tijdens elk actiepotentieel als gevolg van een toenemende gedwongen of resonantie-energieoverdracht veroorzaakt door veranderingen in het membraanpotentieel.

Concordantly vertoont het GFP-signaal een periodieke afname van fluorescerende intensiteit. De RFP/GFP-verhouding is het biologische signaal dat wordt gebruikt in downstream-analyses, zoals actiepotentieelsduur 50- en 90-metingen. Bijvoorbeeld, met behulp van deze methode, 30-dagen oude ventriculaire zoals IPS cel-afgeleide cardiomyocyten geplaatst op 0,5 Hertz, toonde een gemiddelde actie potentiële duur 50 van 439 milliseconden, en een gemiddelde actie potentiële duur 90 van 520 milliseconden.

Elektrische stimulatie van de IPS-cel-afgeleide cardiomyocyten bij toenemende stimulatie tarieven om de vijf slagen, toonde een geleidelijke verkorting van de actie mogelijkheden als het pak slaag tarief toegenomen. Bovendien leidde de behandeling van de spontaan kloppende IPS-cel-afgeleide cardiomyocyten met isoproternol, een niet-selectieve bèta-adrenoreceptor agonist, tot een snelle toename van het afstraffingspercentage, dat verder kan worden verhoogd met toenemende doses van de agonist. Hoewel deze methode een superieure doorvoer biedt in vergelijking met klassieke elektrofysiologische metingen, moet men zich bewust zijn van de beperkingen ervan, inclusief een temporele resolutie die wordt beperkt door de intrinsieke kinetische eigenschappen van de tl-spanningssensor.