Name: Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Leer optische actiepotentiaalopnamen in ventriculaire cardiomyocyten afkomstig van menselijke iPS-cellen met fluorescentiegevoelige voltage-indicatoren. Deze methode verhoogt de doorvoer voor elektrofysiologisch onderzoek aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door subsidies uit de Duitse Research Foundation (Si 1747/1-1), het anders Kröner-Fresenius-Stiftung en de Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. bereiding van iPSC afkomstige Cardiomyocytes Imaging
Opmerking: Methoden voor iPSC cultuur en cardiale differentiatie zijn gepubliceerd vóór12,13,14 en worden niet hier in detail besproken. De zuivering van iPSC-CMs door handmatige microdissection, magnetische cel scheiding of lactaat selectie is aanbevolen, afhankelijk van het gebruikte protocol van differentiatie. Voor het volgende protocol werden microdissected explantaten uit gewonnen van gebieden, gegenereerd met behulp van een enkelgelaagde differentiatie protocol13, gegrepen op dag 15 van een cardiale differentiatie en gekweekt tot dag 30 op fibronectine beklede platen zoals beschreven vóór10.
<ol><li>Neem de cel cultuur platen uit de incubator en handmatig verzamelen van de cardiale explantaten in microcentrifuge buizen met behulp van een precisiepipet 200 µL. Na sedimentatie, gecombineerd de celcultuur supernatant en voorzichtig wassen de explantaten 2 x met Hank is evenwichtig zout oplossing (HBSS).</li>
	<li>Distantiëren van iPSC-CMs door toevoegen van collagenase type II (430 U/mL in HBSS) en hen Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Nadat de bezinking van de resterende grote cel samengeklonterd, verzamelen de bovendrijvende vloeistof waarin de gedissocieerde één iPSC-CMs en voeg dit toe aan verse CM onderhoud opslagmedium met een hoge foetale runderserum (FBS) concentratie (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 1:100 MEM niet-essentiële aminozuren, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 0.1 mM β-mercaptoethanol).</li>
	<li>Herhaal de dissociatie als grote cel bosjes blijven. Verzamel single iPSC-CMs van centrifugeren en resuspendeer hen in CM opslagmedium met een lage concentratie FBS (2% FBS).</li>
	<li>Opnieuw zaad één iPSC-CMs in een dichtheid waardoor de latere beeldvorming van afzonderlijke cellen op een 3,5 cm glas-onderste cel cultuur microdish die heeft zijn bekleed met fibronectine (2 µg/cm2). Optimaliseer de seeding dichtheid voor boeiende in high-throughput experimenten. Meestal zijn 5-10 cardiale explantaten per 3,5 cm schotel voldoende; echter afhankelijk dit sterk van de explant grootte en zuiverheid.</li>
	<li>De één iPSC-CMs cultuur na hun dissociatie in CM onderhoud medium met 2% FBS gedurende ten minste 48 uur om ervoor te zorgen een voldoende herstel. Opmerking: In de volgende stappen, de iPSC-CMs zijn getransduceerde met een lentivirus codering de GEVI VSFP-CR onder de controle van een MLC2v versterker10 om een ventriculaire-specifieke GEVI expressie. Anderzijds kunnen lentivirale constructies waardoor de GEVI specifiek in knooppunten - of atriale-achtige cellen uitspreken, of een aspecifieke construct herbergen de overal uitgedrukt PGK promotor, gebruikte10. Lentivirale plasmiden zijn beschikbaar op aanvraag. Let op: Bij het werken met lentivirale deeltjes, ervoor zorgen dat het arbeidsmilieu te bevorderen het voldoende bioveiligheidsniveau heeft, voldoen aan de veiligheidsvoorschriften voor het werken met potentieel besmettelijke agentia en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen.</li>
	<li>Bereid het medium van de infectie door het mengen van de lentivirus10-celkweek supernatant, die is geproduceerd in de HEK293 cellen zoals beschreven vóór15, met CMs onderhoud medium met (zie stap 1.3) in een 1:1 verhouding.</li>
	<li>Voeg hexadimethrine bromide (en) een eindconcentratie van 8 µg/mL tot verbeteren van de efficiëntie van de infectie. Opmerking: Als gevolg van de infectie van de hoge efficiëntie van iPSC-CMs voorafgaande concentratie van lentivirus via ultracentrifugatie is meestal niet nodig.</li>
	<li>De CM onderhoud worden overgedragen door de enkele iPSC-CMs gecombineerd en te vervangen door het medium van de infectie bereid tijdens stap 1.7 en 1.8. Cultuur van de besmette enkele iPSC-CMs in het medium van de infectie gedurende 12 uur bij 37 ° C. Vervolgens het medium gecombineerd en opnieuw vervangen met CM onderhoud medium. Opmerking: Een signaal van de fluorescentie van de GEVI verschijnt 48 h na de infectie. Een beeldvorming van de potentiële opnames van membraan wordt aanbevolen, 72 uur na infectie ten vroegste om ervoor te zorgen de sterkte van een goed signaal. Enkele geïnfecteerde iPSC-CMs kunnen worden gekweekt voor minstens 3 weken en opeenvolgend beeld. Als uitgebreide photobleaching tijdens een imaging-sessie optreedt, wordt het signaal van de fluorescentie herstelt na verloop van tijd.</li>
	<li>Voor imaging, wisselen het kweekmedium cel door de Tyrode oplossing aangevuld met Ca2 + (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl2MgCl 1 mM, 10 mM glucose, 1,8 mM CaCl2en 10 mM HEPES; pH 7,35).</li>
</ol>2. optische membraan potentiële opnames
<ol><li>Plaats de imaging cupje met de iPSC-CMs in het werkgebied van een omgekeerde epifluorescence Microscoop voorzien van een afbeelding splitter, de juiste filter sets, en een camera in (bijvoorbeeld, een sCMOS camera) staat voor snelle imaging op een hoog gevoeligheid. Opmerking: bijvoorbeeld, gebruik een excitatie van 480/40 nm band pass filter gecombineerd met een 500 nm long pass dichroïde spiegel in de Microscoop, en een 568 nm long pass dichroïde spiegel gecombineerd met 520/28 nm en 630/75 nm band pass emissie filters in de afbeelding splitter. Voor eencellige imaging biedt een high-vergroting, hoog-numerieke-diafragma olie-immersie-doelstelling de beste signaal-/ ruisverhouding.</li>
	<li>Als elektrische pacing vereist is, installeert u pacing elektroden in de beeldvorming zaal en sluit ze aan op een stimulans generator. Opmerking: We gebruikten een pacing inzet die twee platina-elektroden opgenomen en gemonteerd in de 3,5 cm glas-onderste cel cultuur gerechten. De cellen gelegen tussen de elektroden zijn beeld. Typische pacing parameters zijn rechthoekige pulsen van 5 ms in duur, met een amplitude van 10 V/cm elektrode afstand.</li>
	<li>Gebruik eventueel een verwarmde Microscoop stadium om een stabiele temperatuur van de iPSC-CMs tijdens imaging, of zelfs een Microscoop incubatie kamer set-up als op lange termijn imaging is bedoeld.</li>
	<li>Brengen van de cellen te concentreren en plaats een cel de GEVI uitdrukken in het midden van het veld bekijken. Opmerking: Dit gebeurt meest gunstig door gebruik te maken van de oculairs van de microscoop met behulp van een groen fluorescente proteïne (GFP) of een rood fluorescerende eiwit (RFP) filter ingesteld op de cellen, uiting geven aan de GEVI opsporen.</li>
	<li>De optische weglengte zodat uitgestraalde licht is doorgestuurd naar de afbeelding splitter instellen Overschakelen van de filter kubus in de Microscoop naar degene worden gecombineerd met de filters in de afbeelding splitter (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>In de software controle van de camera, de overname-instellingen zodanig instellen dat snelle beeldvorming (bijvoorbeeld, 100 beelden per seconde, met een belichtingstijd van 10 ms per frame) mogelijk is. Let op: Meestal, hierbij het weggooien van camera pixels (bijvoorbeeld8 x 8 pixels van de camera chip zijn weggegooid voor het genereren van één pixel in de time-lapse film).</li>
	<li>Instellen van de afbeelding splitter volgens de instructie van de fabrikant. De twee beelden die de twee verschillende emissie golflengte bands vertegenwoordigen moeten naast elkaar, elk bezetten een helft van het beeld. Opmerking: Deze stap moet slechts 1 x aan het begin van elke imaging sessie uitgevoerd.</li>
	<li>Controleer en pas indien nodig de focus van het beeld geproduceerd door de camera.</li>
	<li>De helderheid van de verlichting-lichte zodat een verzadiging van de pixels wordt vermeden; Dit kan het gemakkelijkst worden gedaan met behulp van een kleurenpalet waarin verzadigde pixels worden vertegenwoordigd door een unieke kleur. Opmerking: Tijdens al deze voorbereidingen voor de beeldvorming, beperken de blootstelling van het monster aan de excitatie lichte tot het noodzakelijke bedrag (dat wil zeggen, niet laten het licht op voor uitgebreid perioden) om te voorkomen dat photobleaching van de GEVI.</li>
	<li>Instellen van de verwerving van de tijdreeks (b.v., 5.000 beelden bij 100 kaders per seconde voor de duur van een serie van 50 s). Dim het licht in de kamer (met inbegrip van computer-monitoren) om te voorkomen dat strooilicht de meting beïnvloeden. Als de excitatie lichte sluiter is niet gecontroleerd door de denkbaar software, open het net voordat de overname.</li>
	<li>Beginnen met de overname van de foto-serie. Desgewenst elektrische pacing is, beginnen de pacing volgorde op het juiste tijdstip, tenzij het wordt automatisch geïnitieerd door de beeldbewerkingssoftware. Als de toepassing van een farmacologische agent wordt gezocht, dit ook handmatig doen (bijvoorbeelddoor pipetting 100 µL van de agent in een tienvoudige einde concentratie aan de kamer van de opname met 900 µL van buffer en voorzichtig mengen met de pipet) of met behulp van een constante-flow perfusie systeem.</li>
	<li>Wanneer de verwerving is voltooid, sluit u de excitatie lichte sluiter indien nodig. De opname op te slaan op de harde schijf.</li>
	<li>Het verlaten van de opname-instellingen ongewijzigd (d.w.z., belichtingstijd, framesnelheid en lichtintensiteit), uitvoeren van een opname van de fluorescentie van de achtergrond (zoals in stap 2.11) over een gebied van het dekglaasje aan niet met cellen of via een ander dekglaasje aan waarop niet cellen hebben is uitgezaaid. Opmerking: Als opeenvolgende metingen worden uitgevoerd zonder de overname-instellingen te wijzigen, is slechts één achtergrond fluorescentie opname is noodzakelijk voor alle deze metingen.</li>
	<li>Desgewenst voeren extra experimenten (stappen 2.4 – 2.13) op verschillende iPSC-CMs, gelegen op de dezelfde dekglaasje aan. Wees ervan bewust dat alle CMs op het dekglaasje aan zal worden beïnvloed, in het geval dat een drug werd toegepast.</li>
</ol>3. analyse
> Opmerking: Afhankelijk van de imaging software gebruikt (dat is meestal een propriëtaire softwarepakket geboden door de fabrikant van de camera of de hele fluorescentie imaging systeem), het uitvoeren van de analyse van de verworven beelden deels of zelfs mogelijk volledig binnen dit softwarepakket. Echter, hier een werkstroom voor beeldanalyse die kan worden uitgevoerd met open bronsoftware (dat wil zeggen, het beeld analyse platform ImageJ)16, die gemakkelijk kan worden geïnstalleerd met behulp van een distributie zoals Fiji17, en de R-pakket voor statistische computing18 worden beschreven. Kort, regio's van belang (ROIs) vertegenwoordigen cellen of achtergrond worden getekend in ImageJ en de gemiddelde fluorescentie in deze ROIs na verloop van tijd wordt geëxporteerd naar een bestand worden, vervolgens verder geanalyseerd in R of, als alternatief, met spreadsheet-software.
<ol><li>In de beeldbewerkingssoftware, opslaan of exporteren van de tijdreeks verworven afbeelding (de opname met de cellen en de bijbehorende achtergrond opname) naar een indeling (bijvoorbeeldTIF) die kan worden gelezen door ImageJ. Ook gebruiken de BioFormats-plugin (https://imagej.net/Bio-Formats), waarin de routines inschakelen ImageJ om te lezen oorspronkelijke bestandsindelingen uit verschillende merken van imaging systeem fabrikanten. Opmerking: De volgende stappen wordt ervan uitgegaan dat de beeldvorming intervallen hetzelfde tijdens de opname. Als dit niet het geval, wellicht de timing informatie vanuit de beeldbewerkingssoftware exporteren en opnemen in de verdere analyse.</li>
	<li>Open de TIF-stack met de cellen die in ImageJ.</li>
	<li>Gebruik het gereedschap freehand selecteren om te tekenen van een ROI over een fluorescerende cardiomyocyte in het rode kanaal. Zorg ervoor dat de ROI groot genoeg, is zodat de cel niet uit de ROI terwijl de aanbestedende verplaatst.</li>
	<li>Open de ROI manager plugin ('analyseren | Tools | ROI Manager') en druk op de knop 'Add [t]' toe te voegen van deze ROI als ROI1.</li>
	<li>Sleep de ROI over dezelfde cel staan in het groene kanaal en voeg deze ROI als ROI2.</li>
	<li>In de ' analyseren | Instellen van metingen menu, Deselecteer alle opties met uitzondering van 'Mean grijswaarde'. Opmerking: Dit moet worden gedaan slechts 1 x in een ImageJ sessie.</li>
	<li>In de manager van de ROI, drukt u op de ' meer | Multi maatregel ' knop. Selecteer de opties 'Meten alle segmenten' en 'Één rij per segment' en druk op 'OK'. Er wordt een venster geopend met een werkblad met drie rijen (het Segmentnummer en de gemiddelde fluorescentie in de twee ROIs de cel in het rood en het groene kanaal, respectievelijk).</li>
	<li>Gebruik ' bestand | Opslaan als het werkblad opslaan in een bestand met door komma's gescheiden waarden (CSV).</li>
	<li>Sluit het venster met de afbeeldingsstapel en het spreadsheetvenster zonder te sluiten van het venster van de manager van de ROI. Open de TIF-stack met de meting van de achtergrond.</li>
	<li>In de manager van de ROI, drukt u op de ' meer | Multi maatregel' knop. Selecteer de opties 'Meten alle segmenten' en 'Één rij per segment' en druk op 'OK'.</li>
	<li>Gebruik ' bestand | Opslaan als het werkblad met de achtergrondgegevens opslaan in een ander CSV-bestand. Opmerking: De volgende berekeningen kunnen worden gedaan met spreadsheet-software. We gebruikten de R software18. Een eenvoudig voorbeeldscript dat wordt gelezen en de cel en achtergrond gegevens uit de bestanden "cell.csv" en "background.csv" de berekeningen, en plots het tijdsverloop van het membraan potentiële signaal wordt geleverd als aanvullende Code bestand 1.</li>
	<li>Bereken uit de opname van de achtergrond, de gemiddelde intensiteit in het rood en in het groene kanaal. Deze achtergrond signaal van de signalen die de cel in de rode en groene kanaal voor het berekenen van de achtergrond-gecorrigeerde RFP en GFP signalen, respectievelijk aftrekken.</li>
	<li>Als een surrogaat voor de membraanpotentiaal, berekenen de verhouding RFP/GFP. Opmerking: Deze verhouding is dimensieloze. Het kan als alternatief worden genormaliseerd naar de oorspronkelijke waarde (dat wil zeggen, ΔR/R0). Belangrijker, bevindt nuttige informatie zich in de temporele veranderingen in plaats van de absolute waarden van deze verhouding. Als gevolg van ongelijke photobleaching van het GFP en de RFP, kan een verschuiving van de basislijn in deze verhouding optreden. Indien nodig, kan deze een verschuiving van de basislijn worden gecorrigeerd door een basislijn curve en het af te trekken van het RFP/GFP verhouding10.</li>
</ol>

<ol><li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li>
<li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23(2017).</li>
<li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li>
<li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells%3A+A+state-of-art%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li>
<li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229(2017).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2865973/">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.R-project.org">http://www.R-project.org</a> (2008).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li>
<li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464(2017).</li>
<li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode kunt een optische recording van APs van een specifiek subtype (d.w.z., ventriculaire-achtige cellen) van CMs gegenereerd op basis van menselijke iPSCs. Menselijke iPSC-CMs een opkomende instrument om een grote verscheidenheid aan biologische en medische problemen, en de differentiatie naar verschillende subtypen van CM is een belangrijke bron van experimentele variabiliteit. Met behulp van specifieke promotor elementen, wordt de expressie van een GEVI specifiek bereikt in CMs die het s...

Cardiomyocytes (CMs) afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een opkomende hulpmiddel om te ontleden van moleculaire mechanismen van hart-en vaatziekten, onderzoeken van nieuwe therapieën, en scherm voor bijwerkingen van geneesmiddelen cardiale effecten1,2 ,3. Vanaf het begin zijn arrhythmogenic ziekten zoals channelopathies een belangrijk aandachtspunt van dit onderzoek gebied4. Daarom zijn de methoden te onderzoeken elektrische fenotypes van CMs, zoals hartritmestoornissen of veranderingen in actiepotentiaal (AP) morphologies, in het hart van deze technologie.
Een belangrijke overweging bij de toepassing van iPSC-CMs is dat huidige cardiale differentiatie protocollen niet leiden een homogene bevolking van cellen tot. Integendeel, ze zijn eerder een mengsel van cellen die lijkt op de sinusknoop, atriale, en ventriculaire CMs op verschillende niveaus van rijping5,,6,,7,8. Deze heterogeniteit kunnen een relevante bron van experimentele variabiliteit, vooral als parameters zoals AP duur (APD) worden onderzocht, die intrinsiek verschillen tussen CM subtypen (bijvoorbeeldde APD is korter in atriale dan in ventriculaire CMs). De conventionele aanpak van dit probleem is te onderzoeken enkele iPSC-CMs met behulp van de methode van de klem patch en classificeren van elke cel als knooppunten-, atriale-, of ventriculaire-achtige, gebaseerd op de AP morfologie9. Een latere analyse kan vervolgens worden beperkt tot de cellen vertegenwoordigt het CM-subtype van belang. Het grote nadeel van deze strategie is de beperkte gegevensdoorvoer en de afwezigheid van schaalbaarheid. Het invasieve karakter van patch klem electrofysiologie staat bovendien geen de beeldvorming van dezelfde cellen sequentieel over langere tijd.
Wij bieden hier, experimentele details op een10 van de methode ontwikkeld om het beeld optisch APs in specifieke subtypen van iPSC-CMs. Dit overwint het probleem van de subtype heterogeniteit en drastisch verhoogt de doorvoer in vergelijking met conventionele methoden, zodat de snelle fenotypering voor iPSC-CMs uitvoering van genetische varianten of worden blootgesteld aan farmacologische agenten.
Overzicht van de subtype-specifieke optische beeldvorming aanpak
Een genetisch-gecodeerde voltage indicator (GEVI), waarvan fluorescentie-eigenschappen op de depolarisatie en repolarisatie van de celmembraan wijzigen, wordt gebruikt om het beeld optisch veranderingen van het membraanpotentiaal van CMs. De hier toegepast GEVI is de spanning detecterende fluorescent proteïne VSFP-CR11, die uit een spanning-sensing transmembraan domein gesmolten aan een combinatie van een groene (klaver) en een rode (mRuby2) TL proteïne (figuur 1A bestaat). Als gevolg van de nabijheid van de twee fluorophores, de excitatie van de groen fluorescente proteïne in een fractie van de energie van de excitatie worden overgebracht naar de rode fluorescerende eiwit via Förster resonance energy transfer (FRET) resultaten. Daarom is de excitatie van de groen fluorescente proteïne resulteert in een emissie van zowel de groene en de rode fluorescerende eiwitten (figuur 1A, bovenste deelvenster). Wanneer de cel depolarizes, een structurele omlegging van de voltage-sensor gebeurt dat vertaalt zich in een heroriëntering van de twee fluorescente proteïnen, verhoging van de efficiëntie van de FRET. Dus wordt nog meer van de excitatie-energie overgebracht van het groen aan de rode fluorescente proteïne (figuur 1A, lagere paneel). Dientengevolge, in een depolarized cel, de uitstoot van groene fluorescentie is minder scherp, en de rode fluorescentie-emissie is helderder dan in een cel in rust membraanpotentiaal (figuur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figuur 1: optische beeldvorming van de membraanpotentiaal met VSFP-CR. (A) A schematische voorstelling afgebeeld van de actie van de spanning-gevoelige fluorescent proteïne DIE VSFP-CR wordt weergegeven. Bij de depolarisatie van de celmembraan, een structurele herschikking in het spanning-sensing transmembraan domein vertaalt zich in een heroriëntering van de groene (GFP) en rode (RFP) TL proteïne, verhoging van de efficiëntie van de intramoleculaire Förster resonance energy transfer (FRET). (B) de emissie spectra van een VSFP op de excitatie van de GFP in cellen bij de rustpotentiaal membraan (bovenste deelvenster) en depolarized cellen (lagere paneel) worden afgebeeld. De spectrale verandering op depolarisatie is overdreven voor de duidelijkheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De veranderingen in de efficiëntie van de FRET spiegeling van de schommelingen van de membraanpotentiaal zijn beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop voorzien van een afbeelding splitter, die scheidt van de rode en groene fluorescentie emissies en projecteert ze op twee aangrenzende gebieden van de chip van een sCMOS camera (Figuur 2). Met deze set-up, kan de emissie van de fluorescentie bij twee verschillende golflengte bands opgenomen worden gelijktijdig, waardoor de berekening van een ratio van rood-tot-groen fluorescentie na te denken van de membraanpotentiaal in elk beeld van een time-lapse serie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figuur 2: configuratie van het imaging systeem. De belangrijkste componenten van de imaging systeem gebruikt om te afbeelding de spectrale veranderingen van de spanning-gevoelige fluorescent proteïne spiegeling van de mogelijke wijzigingen van de membraan met een hoge temporele resolutie worden afgebeeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De expressie van VSFP-CR in CMs wordt bereikt door lentivirale transductie. Directe uitdrukking aan het CM-subtype van belang, heeft de lentivirus een promotor element (de MLC2v -enhancer) die specifiek transcriptie in ventriculaire-achtige iPSC-CMs10 drijftbevat. Wanneer de iPSC-CMs waarmee een mengsel van cellen atriale-achtige, knooppunten-achtige en ventriculaire-achtige zijn getransduceerde met deze lentivirus, uit VSFP-CR zich alleen in de ventriculaire-achtige cellen. Aangezien de actiepotentiaal optische beeldvorming, hangt af van deze TL sensor, vertegenwoordigen de opgenomen actie potentials uitsluitend het CM-subtype van belang (Figuur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figuur 3: promotor-gedreven VSFP uitdrukking voor de potentiële imaging subtype-specifieke membraan. (een) dit schema toont hoe cardiomyocyte subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen worden bereikt. (b) iPSC-CMs besmet met een VSFP onder de controle van de ventriculaire-specifieke MLC2v-enhancer worden weergegeven. De expressie van de voltage-sensor wordt waargenomen alleen in ventriculaire-achtige CMs in het GFP-kanaal (linkerdeel). De fase contrast (middelste deelvenster) en het overlaybeeld (rechtervenster) zijn ook aanwezig. De witte stippellijnen mark celbegrenzing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>alternatief L-Glutamine</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>lentivirale infectie verbeteren</td></tr><tr><td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td><td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stand</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope objective</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor Technology, Belfast, UK</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>Microscope filter cube: excitation filter</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>ET480/40X</td><td>bandpass 480/40</td></tr><tr><td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>T505lpxr</td><td>longpass 505 nm</td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>&nbsp;Cairn Research, Faversham, UK</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml;bingen, Germany</td><td>568LPXR</td><td>longpass 568 nm</td></tr><tr><td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml;bingen, Germany</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>bandpass 520/28 nm</td></tr><tr><td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml;bingen, Germany</td><td>630/75 ET Bandpass</td><td>bandpass 630/75 nm</td></tr><tr><td>Pacing inset</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire cardiomyocytes

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Cardiomyocytes gegenereerd op basis van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-CMs) zijn een opkomende hulpmiddel bij cardiovasculair onderzoek. In plaats van een homogene bevolking van cellen, de iPSC-CMs gegenereerd door huidige differentiatie protocollen vertegenwoordigen een mengsel van cellen met ventriculaire-, atriale-, en knooppunten-achtige fenotypen, die compliceert fenotypische analyses. Hier, wordt een methode om optisch record actie potentials specifiek van ventriculaire-achtige iPSC-CMs gepresenteerd. Dit wordt bereikt door lentivirale transductie met een constructie waarin een genetisch-gecodeerde voltage-indicator onder de controle van een ventriculaire-specifieke promotor-element is. Wanneer iPSC-CMs zijn getransduceerde met deze constructie, wordt de voltage-sensor uitgedrukt uitsluitend in ventriculaire-achtige cellen, waardoor potentiële opnames subtype-specifieke optische membraan met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie.

In figuur 4a, is een representatieve één iPSC-CM afgebeeld met de witte stippellijnen markering van de ROI getrokken tijdens de imaging analyse in de RFP (links) en het kanaal GFP (rechts). Het signaal van het RFP kanaal toont een periodieke verhoging in fluorescerende intensiteit tijdens elke actiepotentiaal (figuur 4b, bovenste deelvenster). Zoals beschreven in de inleiding, is dit te wijten aan een toenemende FRET veroorzaakt ...

Hier presenteren we een methode om optisch beeld actie potentieel, specifiek in ventriculaire-achtige geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes. De methode is gebaseerd op de promotor-gedreven uitdrukking van een spanning-gevoelige fluorescent proteïne.

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Cardiomyocyten gegenereerd uit geïnduceerde Pluripotente Stam of IPS cellen worden steeds vaker gebruikt om een verscheidenheid aan biologische vragen op het gebied van cardiale elektrofysiologie te beantwoorden. De belangrijkste voordelen van deze technologie zijn dat het een dramatische toename van de doorvoer mogelijk maakt, evenals subtypespecifieke actie potentiële opnames in ventriculaire zoals myocyten, met behulp van een ventriculaire specifieke promotor element. De introductie van genetisch gecodeerde spanningssensoren door lentivirale transductie maakt de optische beeldvorming van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide cardiomyocyten actiemogelijkheden mogelijk.Begin met het mengen van lentivirus-bevattende celcultuur supernatant met cardiomyocyte onderhoudsmedium, bij een verhouding één op één. Voeg hexadimetherine bromide met een uiteindelijke concentratie van 8 microgram per milliliter, om de infectie efficiëntie te verbeteren. En vervang het cardiomyocyte onderhoudsmedium in de IPS cel-afgeleide cardiomyocyten cultuurschotel, met het infectiemedium.Kweek de geïnfecteerde cardiomyocyten gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius en vervang het infectie

subtype-specific-optical-action-potential-recordings-human-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Hier beschrijven we de voorbereiding van levensvatbare ventriculaire plakjes van volwassen muizen en hun gebruik voor scherpe elektrodeactiepotentiële opnamen. Deze multicellulaire preparaten leveren een geconserveerde in vivo weefselstructuur, waardoor ze in vitro een waardevol model vormen voor elektrofysiologische en farmacologische studies.

Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

We presenteren een protocol voor de evaluatie van de elektromechanische effecten van GtACR1 activering bij konijnencardiomyocyten. We geven gedetailleerde informatie over celisolatie, kweek- en adenovirale transductie, en over functionele experimenten met de patch-clamp en koolstofvezel technieken.

Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

De combinatie van laserporosatie en micro-elektrode arrays (MEA) maakt actiepotentiaalachtige opnames van gecultiveerde primaire en stamcel-afgeleide cardiomyocyten mogelijk. De golfvorm biedt superieur inzicht in het werkingsmechanisme van teststoffen dan standaardopnamen. Het koppelt patch-clamp en MEA-uitlezing om cardioveiligheidsonderzoek in de toekomst verder te optimaliseren.

Laser-geïnduceerde actiepotentiaal-achtige metingen van cardiomyocyten op micro-elektrode arrays voor verhoogde voorspelbaarheid van veiligheidsfarmacologie

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Hier wordt een gevestigde methode beschreven om contractiliteits- en calciummetingen uit te voeren in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een op optica gebaseerd platform. Dit platform stelt onderzoekers in staat om het effect van mutaties en de reactie op verschillende stimuli op een snelle en reproduceerbare manier te bestuderen.

Real-time metingen van calcium- en contractiliteitsparameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Leer optische actiepotentiaalopnamen in ventriculaire cardiomyocyten afkomstig van menselijke iPS-cellen met fluorescentiegevoelige voltage-indicatoren. Deze methode verhoogt de doorvoer voor elektrofysiologisch onderzoek aanzienlijk.

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

Meer video's verkennen