Name: Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer CLEM-microscopie voor het visualiseren van virus-geïnduceerde structuren in cellen met behulp van high-pressure freezing. Deze methode combineert licht- en elektronenmicroscopie voor inzicht in virus-gastheerinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn zeer dankbaar aan de personeelsleden van het elektronenmicroscopie Core voorzieningen (EFMS) op EMBL (Heidelberg) en aan de Universiteit van Heidelberg. Wij ook bedank Ulrike Herian, Stephanie Kallis en Andrea Hellwig (Universiteit van Heidelberg), evenals Eberhardt Schmidt en Renate Kunz (Universiteit van Ulm) voor deskundige technische bijstand. Werk van R.B. en zijn team (U.H. en IR-B.) werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 en TRR83, TP13.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier voorgestelde om te bestuderen van de impact van een virale eiwituitdrukking op celmembranen CLEM-methodologie is met succes gebruikt voordat om te verhelderen van het HCV replicatie-geassocieerde structuren, vooral dubbel membraan blaasjes (DMVs)21, alsook om te het bepalen van de kritische bouwstenen die nodig zijn om te vormen van deze structuren HCV-geïnduceerde23. Merk op dat in onze eerste werk met behulp van CLEM te bestuderen van HCV replicatie21, een enigszins gewijzigde versie van het protocol hier beschreven werd toegepast. In die studie, conventionele 0,05 mm dik saffier schijven, zonder alfanumeriek patroon, werden gebruikt waarin een verwijzing patroon is gemaakt door carbon coating hen met een rooster van de finder op de top (Zie Tabel van materialen). Deze versie van het huidige protocol kan uiteindelijk worden toegepast, met het voordeel dat de "A" vervoerder voor HPF rechtstreeks, zonder de noodzaak voor het kappen zoals in Figuur 3Akan worden gebruikt. Als alternatief, zoals vermeld in het protocol, een dikkere "A" vervoerder kan worden gebruikt (Zie Tabel van materialen) met gedessineerde saffier schijven, zonder de behoefte aan een "B" luchtvaartmaatschappij.
Interessant, kan dit protocol worden toegepast, niet alleen om te studeren van BSL-1 monsters, zoals cellen transfected met virale eiwitten zoals beschreven hier en elders19,23, maar ook aan de studie van virus-geïnfecteerde cellen. Hoewel werken met menselijke pathogenen meestal beperkt tot BSL-2 en3 BSL laboratoria is, in sommige landen is het nog steeds mogelijk om uit te voeren cryo-immobilisatie onder deze omstandigheden inzake bioveiligheid. In die BSL-2 en de BSL-3 laboratoria waar verglazing niet mogelijk, als gevolg van de plaatselijke regelgeving of het ontbreken van een machine HPF is, kunnen virus-geïnfecteerde cellen nog steeds bereid worden met behulp van deze methode als chemische fixatie met aldehyden van tevoren, wordt uitgevoerd namelijk verlaten voordat de BSL-2 of BSL-3 faciliteiten. Bovendien dienen aldehyden te worden uitgeblust onmiddellijk na fixatie te houden van de fluorescentie, terwijl de rest van het protocol identiek aan de hier beschreven is. Deze techniek kan worden beschouwd als overbodig omdat de cellen zijn vaste tweemaal, chemisch en via verglazing. Dit protocol dubbele fixatie leidt echter inderdaad tot een veel beter behoud van de HCV-geïnduceerde DMVs in vergelijking met de DMVs gevonden in cellen die zijn blootgesteld aan chemische fixatie alleen21.
Voor verdere wijzigingen en het oplossen van problemen met de lezer wordt verwezen naar de toelichting in het protocol deel van dit manuscript. Deze nota's beschrijven valkuilen te vermijden, evenals alternatieven voor vermeende problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van deze methode.
De belangrijkste voorwaarde voor het toepassen van deze techniek is een HPF machine. Wanneer de cellen via HPF is niet haalbaar (als gevolg van het ontbreken van een machine HPF) of niet verplicht is (wanneer het membraan behoud hoeft niet te worden optimaal), cryo immobilizing cellen kan worden chemisch vaste en vervolgens voorbereid en geanalyseerd door EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Deze optie hoeft niet het gebruik van sapphire schijven, maar cel cultuur gerechten met gerasterde patronen voor het verplaatsen van cellen of cel clusters. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze gerechten is hun grotere diameter in vergelijking met saffier schijven, waardoor de screening van grotere oppervlaktes. Dus, de toepassing van dit protocol CLEM is met succes toegepast te bestuderen van het effect van een antivirale samengestelde tegen HCV15 of te visualiseren de membraan herschikkingen geïnduceerd door de nonstructural eiwitten van norovirussen19. Een andere kwestie die de prestaties van deze methode beperken kan is het ontbreken van een commerciële FS-apparaat. Basissystemen zelfgemaakte FS kunnen in dit geval in plaats daarvan worden gebruikt. Hoewel automatische FS apparaten behandeling ongelukken verminderen kunnen, worden zelfgemaakte apparaten gebruikt met succes bijvoorbeeld bij Kent McDonald's30 en Paul Walther de labs.
Met betrekking tot chemische fixatie, het protocol beschreven hier zorgt voor een optimaal behoud van de intracellulaire structuren20. Daarom, in het geval dat de bovengenoemde HPF en FS apparaten beschikbaar zijn, de cellen van belang vitrifying zou de voorkeur.
Toekomstige alternatieven voor deze aanpak CLEM omvatten de mogelijkheid van het gebruik van deze methode niet alleen om 2D informatie op ultrastructureel niveau te verwerven, maar ook om te krijgen 3D-informatie over de architectuur van membraan en organel wijzigingen veroorzaakt door virussen. De 3D-EM-methoden, met inbegrip van Elektronentomografie (ET) en gerichte ion beam-scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) (uitgebreid beschreven in29), kunnen ook worden toegepast op cellen die zijn opgesteld na deze huidige protocol21, 31. Daarnaast kon 3D-informatie worden ook verkregen op het niveau van de LM, bij het gebruik van een confocal microscoop, waarmee de verwerving van z-stacks. Deze optie wordt echter nadrukkelijk aanbevolen wanneer een precieze correlatie tussen LM en EM datasets is gewenste (zie bijvoorbeeld17). De informatie opgenomen in 3D z-stacks aids ter verbetering van de correlatie met de 2D TEM beelden. Dus, in zulk een scenario, de best passende LM en EM afbeeldingen kunnen worden geselecteerd en vervolgens onderworpen aan een van de correlatie software beschikbaar, zoals de EG-CLEM plugin van ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 of de Landmark correspondenties plugin van Afbeelding J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resulterend in de generatie van overlappende LM-EM beelden.
Wanneer temporele informatie is nodig om te begrijpen van de kinetiek van een bepaalde gebeurtenis, kan time-lapse beeldvorming worden gebruikt om te controleren van de dynamiek van levende cellen in combinatie met EM. Tijdens het evenement van belang, cellen vastliggen onmiddellijk, het genereren van een "bevroren momentopname" die later kan worden geanalyseerd via EM, gedetailleerde ultrastructurele voorlichting over dat moment op het moment van immobilisatie. Het verkrijgen van die "bevroren momentopname", na de observatie in real-time, kunnen cellen chemisch vaste33 of cryo-geïmmobiliseerd6. Aangezien veel cellulaire processen er sneller dan de processen van de verspreiding van chemische fixatie voorkomen, indien mogelijk, moet Ultra snelle invriezen worden uitgevoerd. Het is echter belangrijk om rekening te houden dat de HPF machines in hun effectieve tijd resolutie34verschillen.
Bovendien, hoewel dit protocol is ontworpen voor het insluiten van cellen in een epoxyhars, cellen kunnen worden ook ingebed in lage viscositeit harsen, zoals Lowicryls, LR wit of LR goud. Het gebruik van deze insluiten media stelt voor het behoud van de antigenicity35,36, evenals de fluorescentie37,38 en daarom worden meestal gebruikt voor het insluiten van post op-sectie immunolabeling39 , 40 en op-sectie CLEM41,42,43,44, waar de LM wordt gedaan na de insluiten. Beide benaderingen (immuno-EM en op-sectie CLEM) moeten worden cruciaal voor die experimenten in die niet-karakteristieke structuren kunnen gemakkelijk worden gevonden via TEM en/of als een besturingselement tegen miscorrelation tussen LM en EM signalen. Ook labelen met antilichamen die kunnen worden gevisualiseerd door beide beeldvormende modaliteiten (LM en EM) kan worden uitgevoerd45 om, bijvoorbeeld, het identificeren van transfected cellen in LM (vooraf insluiten fase) en bereiken een veel nauwkeurigere lokalisatie van de GFP signaal via haar specifieke etikettering door immuno-EM (post inbedden fase). Er moet rekening worden gehouden, echter, dat permeabilization wordt uitgevoerd voordat LM voor de toegang tot van de antilichamen tegen de intracellulaire ruimte, die in een suboptimale behoud van de architectuur van de cel op het niveau van de EM resulteren kan. Interessant is dat dit protocol is ook geschikt voor Multi-Color die experimenten met het gebruik van andere fluorescerende tags, dan GFP kan worden bereikt (zoals hier). Kortom, zijn er vele putatief mogelijkheden van aanpassing van dit protocol, zowel op de LM en/of op de zijkanten van de EM, afhankelijk van de vragen die worden aangepakt. Voor een uitgebreide beschrijving van andere alternatieve protocollen wordt de lezer verwezen naar5,46. Ongeacht hoe de microscopie modaliteiten worden gecombineerd, is het resultaat samen een winst van informatie, zodat we beter begrijpen hoe virussen en hun eiwitten interactie met hun legers in het echte leven.
De meest kritische stap binnen deze methode is de verzameling van seriële secties uit de cellen van belang. Zoals benadrukt in de sectie representatieve resultaten vereist dit deskundige medewerkers, evenals veel geduld. Nog belangrijker is, is deze stap is essentieel om te vinden de cellen terug op het niveau van de EM om twee redenen. Ten eerste, in dit soort CLEM protocol gebruikt vooraf te embedding LM, de coördinaten zijn alleen zichtbaar op de LM-niveau en op het gezicht van de blok hars na de insluiten. Echter, zij zal niet zichtbaar zijn op de trajecten door TEM. Gerichte trimmen op het blok naar beneden naar de regio's van belang (ROIs) moet daarom zorgvuldig worden uitgevoerd met een scheermesje om ervoor te zorgen dat de secties die vervolgens worden verkregen de cellen worden, uiting geven aan een bepaalde FP. Ten tweede is het noodzakelijk te vinden van de beste overlay tussen de LM en de overnames van EM "scannen" verschillende secties. In tegenstelling tot methoden waar LM in de post te embedding stadium wordt uitgevoerd, is in dit geval de LM-EM-overlay niet zo nauwkeurig. De lage overlay nauwkeurigheid is te wijten aan verschillen in axiale resolutie tussen LM en EM, krimp tijdens de verwerking van de steekproef van EM, en tijdens het segmenteren van42gecomprimeerd. Toch helpen efficiënt bijhouden methoden, zoals het gebruik van bezienswaardigheden, de cellen terug te vinden. Het gaat hierbij om de positie van één cel naar de andere, evenals de vorm van de cellen en hun kern. In dit opzicht zoals uiteengezet in het protocol, geven DIC-afbeeldingen "anatomische" informatie van de cellen die essentieel zijn voor het verbeteren van de correlatie. Als alternatief, de kernen of andere organellen goed herkenbare cel (zoals mitochondriën of lipide druppels) kunnen worden gekleurd voor LM en gebruikt als monumenten.
Tot slot is het opmerkelijk te noemen dat hoewel dit manuscript is gericht op het gebruik van deze techniek voor Virologie studies, het toepassingsgebied van deze proefopzet kan worden uitgebreid om aan te pakken van de meer algemene vragen van de biologische.

Het idee van het combineren van twee microscopie modaliteiten te verkrijgen van een beter beeld van een specifieke biologisch proces is vrij oud. Dus, de allereerste studie over virussen met behulp van "oereenstemming microscopie" werd gepubliceerd in 1960 als twee aparte publicaties1,2. In deze studie analyseerde de auteurs de veranderingen in de morfologie van de kern geïnduceerd door adenovirussen door middel van twee microscopie technieken. In de eerste publicatie waren elektronenmicroscopie (EM) opmerkingen met een beschrijving van de morfologische details adenovirus infectie gekoppeld gerapporteerde1. In een tweede publicatie, werden de verschillende structuren waargenomen door EM gecorreleerd met lichte microscopie (LM) beelden van histochemische kleuring patronen, vast te stellen van de aard van de structuren die eerder waargenomen door EM2.
In deze vroege studies, werden hun opmerkingen echter uitgevoerd met behulp van verschillende geïnfecteerde cellen bereid als onafhankelijke experimenten. De "correlatie" was, inderdaad, bedoeld als de combinatie van informatie die afkomstig is uit twee beeldvormende modaliteiten te begrijpen van een bepaalde verschijnsel, alle bevindingen die zijn verkregen met verschillende testen om te begrijpen van een bepaalde biologische vergelijken proces.
Tegenwoordig wordt de term oereenstemming microscopie, ook bekend als oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), toegepast op een toenemend aantal methoden (herzien in verwijzingen3,4,,5), met de gemeenschappelijkheid dat beide beeldvormingstechnieken (LM en EM) worden uitgevoerd op de zeer dezelfde steekproef. De combinatie van beide methoden resulteert daardoor in een multimodale Multi-Scale en multi-dimensionale analyse van dat monster3. De voordelen zijn dat LM een breed overzicht van vele verschillende cellen bieden kan, waardoor de identificatie van cel subpopulaties uiting van een eiwitten of proteïnen van belang in een heterogene-celpopulatie. EM overwint de resolutie limiet van LM, bieden een hogere resolutiebeeld van een bepaalde intracellulaire gebeurtenis. EM maakt bovendien de visualisatie van de niet-belichting fluorescerende subcellular context, met inbegrip van alle membraan gebonden organellen, grote macromoleculaire complexen (bijvoorbeeld ribosomen, centrioles, enz.) en cytoskeletal elementen, waardoor aanvullende ruimtelijke informatie, de zogenaamde "verwijst naar ruimte",6, en geven context naar de fluorescerende plek gedetecteerd door LM.
Tijdens de laatste jaren, CLEM is uitgegroeid tot een krachtig instrument, niet alleen voor cel biologen5, maar ook voor virologen (herzien in referentie7) bereid zijn om te begrijpen van de complexe virus-cel interactie die tot een succesvol virus verspreiding leiden. Begrijpen hoe virussen wijzigen celmembranen en organellen in hun eigen voordeel is dus essentieel voor het ontwikkelen van antivirale middelen voor de uitroeiing van pathogene virussen.
Hier, wordt een CLEM methode beschreven waarmee de detectie door LM van cellen uiten van virale eiwitten gesmolten aan een fluorescente proteïne (FP). Deze cellen zijn vervolgens cryo-geïmmobiliseerd en verder voorbereid voor Ultrastructurele analyse via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) te krijgen van nieuwe inzichten in hoe de expressie van deze proteïnen herschikken intracellulaire membranen (Figuur 1). CLEM is uitgevoerd met chemisch vaste cellen in de meeste van de virologie studies gepubliceerd naar datum8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Dit is voornamelijk te wijten aan de noodzaak van het inactiveren van besmettelijk materiaal voor bioveiligheid redenen in biosafety level-2 en -3 (BSL-2 en BSL-3) laboratoria, waar cryo-immobilisatie van cellen meestal niet mogelijk is. Deze vragen vereisen een optimaal behoud van de celmembranen, is, verglazing via hogedruk bevriezing (HPF) echter raadzaam20. In deze gevallen, kan het protocol van de CLEM hier beschreven worden toegepast. Interessant, met name bij het werken met infectieuze specimens, kan HPF worden uitgevoerd op monsters die eerder chemisch geïnactiveerd, bijvoorbeeld in BSL-2 en3 BSL laboratoria zijn. De combinatie van chemische fixatie gevolgd door HPF is een mogelijkheid om op zijn minst gedeeltelijk profiteren van de voordelen van cryo-behoud methoden21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Figuur 1 : Schematische weergave van de workflow voor de analyse van cellen via CLEM. Cellen groeien op patroon saffier schijven worden eerst geanalyseerd door LM te lokaliseren cellen uiten FPs vóór de verwerking ervan voor EM. Zodra gevonden, worden cellen meteen opgelost door HPF en FS vervolgens in de hars ingesloten. Bij de polymerisatie van de hars, de steun waar de cellen groeiden (= saffier schijven) moeten worden verwijderd uit het blok hars. Het blok met de ingesloten cellen is bijgesneden tot een kleine trapezium waaruit de resterende cellen, uiting van FPs, met een mes van de diamant worden gesegmenteerd. Uiterst dunne secties worden verzameld op slot rasters en verder onderzocht door TEM ultrastructurele informatie verkrijgen van deze cellen. Dit cijfer is aangepast en bewerkt met toestemming van referentie29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Stratalinker 1800, 230 Vac, uitgerust met 254-nm UV-lampen, 8 Watt/stuk.</td></tr><tr><td>Geëtste saffierschijven</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Zwitserland</td><td>627</td><td>Ze hebben een diameter van 0,3 mm en een dikte van 0,16 mm, evenals een geëtst alfanumeriek patroon om de cellen opnieuw te lokaliseren. Ze kunnen alleen per e-mail worden besteld: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Slanke en lange pincetten</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72919-SS</td><td>'Style SS', voor het hanteren van saffierschijven.</td></tr><tr><td>Cellenkweekmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>41965-062</td><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 2 mM L-glutamine, niet-essentiële aminozuren, 100 eenheden penicilline per ml, 100 µg streptomycine per ml en 10% foetaal runder serum (DMEM compleet, zie hieronder). Pakket met 10 flessen, 500 ml/stuk.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>25030-123</td><td>Pakket met 20 flessen van 100 ml/stuk.</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11140-068</td><td>Pakket met 20 flessen van 100 ml/stuk.</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140-163</td><td>Pakket met 20 flessen van 100 ml/stuk.</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>F7524</td><td>Fles van 50 ml</td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Olympus Deutschland, Hamburg, Duitsland</td><td>CKX41</td><td>Het is een omgekeerd microscoop met opties voor een trinoculare kop en mogelijkheid voor upgrade naar fluorescentie.</td></tr><tr><td>Huh7-Lunet cellen die stabiel de T7 RNA-polymerase tot expressie brengen</td><td>Beschikbaar bij het laboratorium van Prof. Dr. Ralf Bartenschlager</td><td>Niet beschikbaar</td><td>Neem contact op met Prof. Bartenschlager op: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td></tr><tr><td>Mirus TransIT-LT1 Transfectiereagens</td><td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td><td>MIR 2304</td><td>Breed spectrum, lage toxiciteit, DNA-transfectiereagens. Flesje van 0,4 ml</td></tr><tr><td>Omgekeerd bredeveld fluorescentiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Duitsland</td><td>Zeiss Observer.Z1</td><td>Omgekeerd fluorescentiemicroscoop voor experimenten met levende celculturen.</td></tr><tr><td>1-hexadeceen</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>8220640100</td><td>Fles van 100 ml</td></tr><tr><td>"A" aluminium houders voor hogedrukvriesen (HPF)</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Zwitserland</td><td>241</td><td>Dit is de houder die voor dit protocol is gebruikt en heeft 2 verschillende diepten van 0,1 en 0,2 mm. Het kan alleen per e-mail worden besteld: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>"B" aluminium houders voor HPF</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Zwitserland</td><td>242</td><td>Dit is de houder die voor dit protocol is gebruikt. Het is 0,3 mm dik. Ze kunnen alleen per e-mail worden besteld: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>"A" aluminium houder voor HPF (speciaal voor het werken met geëtste saffierschijven)</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Zwitserland</td><td>737</td><td>Dit is de houder die alleen kan worden gebruikt met de geëtste saffierschijf (als alternatief voor het huidige protocol), zonder de noodzaak van een "B" houder of de editie van de "A" houder. Het is 0,84 mm dik. Het kan alleen per e-mail worden besteld: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Saffierschijven</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Zwitserland</td><td>405</td><td>Deze saffierschijven zijn de 'conventionele', met een diameter van 0,3 mm en een dikte van 0,05 mm. Ze kunnen ook worden gebruikt voor CLEM als alternatief in plaats van geëtste saffierschijven.</td></tr><tr><td>Zoekroosters</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td><td>LF135-Cu</td><td>Deze 135-mazige roosters worden gebruikt om een alfanumeriek patroon op 'conventionele' saffierschijven (hierboven beschreven) te creëren via koolstoflaag, zodat ze kunnen worden gebruikt voor CLEM. 100 roosters/vial.</td></tr><tr><td>HPF-machine</td><td>ABRA Fluid AG, Widnau, Zwitserland</td><td>HPM 010</td><td>Deze HPF-machine is gebruikt voor dit protocol.</td></tr><tr><td>HPF-machine</td><td>Leica Microsystems, Wenen, Oostenrijk</td><td>EMPACT 2</td><td>'EMPACT 2', als alternatief voor het gebruik van de HPM-machine die in dit protocol is gebruikt (hierboven beschreven).</td></tr><tr><td>Cryo-buizen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Z763667-500EA</td><td>Voor langdurige opslag van cryo-geïmmobiliseerde monsters in vloeibare stikstof. Pakket met 500 cryobuisjes.</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstofdewar</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Duitsland</td><td>GZ-05094-60</td><td>Voor langdurige opslag van cryo-geïmmobiliseerde monsters in vloeibare stikstof, uitgerust met cryo-rekken met een capaciteit van 1600 cryobuisjes.</td></tr><tr><td>Automatische vriessubstitutie (AFS) machine</td><td>Leica Microsystems, Wenen, Oostenrijk</td><td>EM AFS2</td><td>Deze machine voert vriessubstitutie en progressieve temperatuurverlaging (PLT) technieken uit en maakt lage temperatuur inbedding en polymerisatie van harsen mogelijk.</td></tr><tr><td>Osmiumtetroxide (OsO4)</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>19150</td><td>4% waterige oplossing, een doos met 10 x 2 ml ampullen.</td></tr><tr><td>Uranyl-Acetaat (UA)</td><td>Serva, Heidelberg, Duitsland</td><td>77879.01</td><td>Fles met 25 grs (UA)-2 H2O.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin Electronic, Berlijn, Duitsland</td><td>329</td><td>'Sonorex Super RK 31' is een krachtige ultrasone reinigingsbad voor waterige reinigingsoplossing die in dit protocol wordt gebruikt om OsO4 en

oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (clem) voor het bijhouden en imaging virale eiwitten verbonden structuren in cryo-geïmmobiliseerd cellen

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Als gevolg van de hoge resolutie is elektronenmicroscopie (EM) een onmisbaar hulpmiddel voor virologen. Een van de belangrijkste problemen bij het analyseren van virus-geïnfecteerde of transfected cellen via EM zijn echter de lage efficiëntie van infectie of transfectie, het onderzoek van deze cellen belemmeren. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan de lichte microscopie (LM) eerst worden uitgevoerd om de subpopulatie van besmette of transfected cellen toewijzen. Zo profiteren van het gebruik van fluorescente proteïnen (FPs) gesmolten aan virale eiwitten, LM wordt hier gebruikt om op te nemen van de standpunten van de "positieve-transfected" cellen, uiting geven aan een FP en groeien op een ondersteuning met een alfanumeriek patroon. Vervolgens cellen worden verder verwerkt voor EM via hogedruk bevriezing (HPF), bevriezen van substitutie (FS) en hars inbedding. De ultra snelle bevriezing stap zorgt voor uitstekende membraan behoud van de geselecteerde cellen die kunnen vervolgens worden geanalyseerd op ultrastructureel niveau door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Hier, wordt een stapsgewijze oereenstemming licht-elektronenmicroscopie (CLEM) workflow verstrekt, bereiding van de monsters, beeldvorming en correlatie in detail beschrijven. De proefopzet kan ook worden toegepast om aan te pakken veel cel biologie vragen.

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd (Figuur 1), Huh7-Lunet cellen stabiel uiten de T7-RNA-polymerase werden zaadjes op patroon saffieren schijven en vervolgens transfected met een plasmide uiten twee domeinen van het Hepatitis C-virus (HCV) nonstructural eiwit NS5A, gelabeld met GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Figuur 4). De volgende dag, werden het patroon saffier schijven, waar de cellen groeiden, genomen uit de cel cultuur gerechten en beeld door middel van LM (Figuur 4, Figuur 2). Die cellen uiten van de AH-D1-GFP werden geïdentificeerd door de aanwezigheid van groene fluorescentie in het cytosol en geregistreerd om op te slaan hun posities binnen het coördinaat-patroon van de saffier schijven (cijfers 5A, 5B). Onmiddellijk na hun LM-onderzoek, de sapphire schijven met de cellen die van belang waren tussen twee aluminium dragers (Figuur 3) is geassembleerd en onderworpen aan cryo-immobilisatie door HPF. Cellen werden vervolgens blokkeert gesubstitueerde en vervolgens ingesloten in een epoxyhars.
Na verwijdering van de saffier schijven uit de gepolymeriseerde hars blokken was de opdruk van de alfanumerieke patroon zichtbaar op het gezicht van het blok, waardoor het ophalen van de gebieden waar de cellen van belang gelegen waren. De rest van de hars blok was weg geknipt voor het genereren van een kleine trapezium herbergen van de cellen van belang. Seriële uiterst dunne secties verkregen is van deze trapezium, verzameld op EM sleuf rasters en verder geanalyseerd door TEM (Figuur 5C). Opmerking dat verkrijgen van handmatig seriële opeenvolgende secties, hoewel haalbaar28 is intensieve arbeid en goed opgeleide en geschoolde personeel vereist. Het is ook belangrijk dat de cellen een lage confluentie hebben wanneer onderworpen aan dit protocol CLEM (Figuur 5A) teneinde een snelle herkenning van dezelfde cel eerder aangeduid door LM. Anders, met hogere cel confluentie kan dramatisch vertragen de succesvolle lokaliseren van cellen op het niveau van de EM.
TEM analyse van verschillende uiterst dunne secties van de cel van belang (cijfers 5D, 5E), de aanwezigheid in de intracellulaire ruimte van grote opeenhopingen van blaasjes van variabele morfologie gescheiden van uiting van de AH-D1-GFP, bleek de Omringende cytosol door een enkele lipide dubbelgelaagde (Figuur 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Figuur 4 : Schematische weergave van de werkstroom gevolgd voor het uitvoeren van het afgebeelde CLEM voorbeeld Figuur 5 . Huh7-Lunet cellen transfected stabiel uiten de T7-RNA-polymerase werden met een DNA plasmide codering de amphipathic helix (AH) en het domein 1 (D1) van de eiwitten van het HCV NS5A, tagged op de C-terminal met GFP (pTM_AH-D1-GFP). De uitdrukking van dit deel van het NS5A-eiwit wordt transcriptionally gecontroleerd door een T7 promotor (T7 Pm) en translationally door een encefalomyocarditis virus (EMCV) IRES (interne ribosome entry site) element, aangegeven door een secundaire structuur. Vierentwintig uur na transfectie (24 hpt) cellen groeien op patroon saffier schijven en uiten van de AH-D1-GFP werden gedetecteerd door LM en onmiddellijk onderworpen aan HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Figuur 5 : Voorbeeld van een procedure van CLEM. (A) Huh7-Lunet cellen stabiel uiten de T7 polymerase geanalyseerd door fluorescentie microscopie GFP-positieve cellen geteeld op patroon saffier schijven, 24 uur na de transfectie met de plasmide pTM_AH-D1-GFP toewijzen. (B) hogere vergroting afbeelding van een enkele cel binnen de witte onderbroken rechthoek geselecteerd om te worden geanalyseerd door CLEM. (C) TEM afbeelding van een uiterst dunne sectie van dezelfde cel na HPF, FS en hars inbedding. (D) schematische weergave van seriële 70-nm uiterst dunne secties op een grid van de sleuf EM met de cel van belang. (E) aan de linkerkant: TEM overzichten van twee secties van de cel van belang. Aan de rechterkant: hoge vergroting TEM beelden van de intracellulaire gebieden geselecteerd in gele rechthoeken aan de linkerkant, hoge aantal blaasjes gescheiden van het cytosol via een één membraan onthullen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Deze methode helpt om belangrijke vragen in het biologieveld te beantwoorden over hoe bio-eiwitten die zich in celmembranen bevinden, omgevingen creëren die bio-replicatie en assemblage bevorderen.De twee technische hoekstenen die hier worden gecombineerd zijn ten eerste de correlatie tussen levende celbeeldvorming en elektronenmicroscopie, en ten tweede hogedrukvriestechniek.Hoewel deze methode is ontworpen en succesvol is gebruikt om virusbroninteracties aan te pakken, kan het gemakkelijk worden gegeneraliseerd naar een reeks toepassingen in de celbiologie.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat er veel stappen zijn die praktische ervaring vereisen om succesvol te zijn, vooral Cryo-immobilisatie door hogedrukvriestechniek en de daaropvolgende stappen.Begin met het plaatsen van gepatroneerde saffier schijven met een alfanumeriek patroon geëtst op een van hun oppervlakken in een conische centrifugeerbuis van 15 milliliter, en was de schijven grondig met ethanol.Plaats de gewassen saffierschijven in een petrischaal bekleed met filterpapier om te drogen, en gebruik lange, slanke pincetten om de gedroogde saffierschijven over te brengen naar glazen plaatjes.Bevestig met behulp van een omgekeerde microscoop met 4x vergroting dat het patroon van coördinaten op elke saffier schijf leesbaar is.Steriliseer vervolgens de schijven gedurende vijf minuten met een ultraviolette crosslinker.Plaats in een bioveiligheidskast de helft van het celkweekmedium in een celkweekschaal, en gebruik lange pincetten om de saffierschijven voorzichtig in de schaal over te brengen.Vervolgens 1x10

correlative-light-electron-microscopy-clem-for-tracking-imaging-viral

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Tonen we de fabricage van een low-cost cryogene trap is ontworpen om de meeste gereflecteerde licht microscopen te passen. Dit lab-built cryogene stage maakt een efficiënte en betrouwbare correlatieve beeldvorming tussen de cryo-licht-en cryo-elektronenmicroscopie.

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (&lt;1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Leer CLEM-microscopie voor het visualiseren van virus-geïnduceerde structuren in cellen met behulp van high-pressure freezing. Deze methode combineert licht- en elektronenmicroscopie voor inzicht in virus-gastheerinteracties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen (Video) | JoVE Journal

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Meer video's verkennen