Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen
7 september 2018
Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.
Deze methode helpt om belangrijke vragen in het biologieveld te beantwoorden over hoe bio-eiwitten die zich in celmembranen bevinden, omgevingen creëren die bio-replicatie en assemblage bevorderen.De twee technische hoekstenen die hier worden gecombineerd zijn ten eerste de correlatie tussen levende celbeeldvorming en elektronenmicroscopie, en ten tweede hogedrukvriestechniek.Hoewel deze methode is ontworpen en succesvol is gebruikt om virusbroninteracties aan te pakken, kan het gemakkelijk worden gegeneraliseerd naar een reeks toepassingen in de celbiologie.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat er veel stappen zijn die praktische ervaring vereisen om succesvol te zijn, vooral Cryo-immobilisatie door hogedrukvriestechniek en de daaropvolgende stappen.Begin met het plaatsen van gepatroneerde saffier schijven met een alfanumeriek patroon geëtst op een van hun oppervlakken in een conische centrifugeerbuis van 15 milliliter, en was de schijven grondig met ethanol.Plaats de gewassen saffierschijven in een petrischaal bekleed met filterpapier om te drogen, en gebruik lange, slanke pincetten om de gedroogde saffierschijven over te brengen naar glazen plaatjes.Bevestig met behulp van een omgekeerde microscoop met 4x vergroting dat het patroon van coördinaten op elke saffier schijf leesbaar is.Steriliseer vervolgens de schijven gedurende vijf minuten met een ultraviolette crosslinker.Plaats in een bioveiligheidskast de helft van het celkweekmedium in een celkweekschaal, en gebruik lange pincetten om de saffierschijven voorzichtig in de schaal over te brengen.Vervolgens 1x10
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor correlatieve licht-elektronenmicroscopie (CLEM) om door virussen geïnduceerde intracellulaire structuren te visualiseren. Door lichtmicroscopie (LM) en elektronenmicroscopie (EM) te integreren, kunnen onderzoekers inzicht verkrijgen in virus-gastheerinteracties.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
- Virus-gastheerinteracties
Achtergrond
- De methode combineert live-cell imaging met elektronenmicroscopie.
- Hogedrukvriesen is een cruciaal onderdeel van de techniek.
- De methode is succesvol toegepast bij het bestuderen van virusinteracties.
- De methode kan worden gegeneraliseerd naar diverse toepassingen in de celbiologie.
Doel van de studie
- Om door virussen geïnduceerde structuren in cellen te visualiseren.
- Om het begrip van bio-eiwitinteracties in cellulaire membranen te verbeteren.
- Om een praktische handleiding te bieden voor onderzoekers die deze methode gebruiken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van gestructureerde saffierschijven voor beeldvorming.
- Gebruik van geïnverteerde microscopie voor bevestiging van het patroon.
- Sterilisatie van schijven met behulp van ultraviolette crosslinking.
- Celkweektechnieken voor het uitzaaien van cellen op saffierschijven.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van door virussen geïnduceerde intracellulaire structuren.
- Demonstratie van de effectiviteit van CLEM bij het bestuderen van virus-gastheerinteracties.
- Beschrijving van de praktische stappen voor de implementatie van de methode.
- Potentiële toepassingen in bredere contexten van de celbiologie.
Conclusies
- De CLEM-methode biedt waardevolle inzichten in de virusbiologie.
- Het overbrugt de kloof tussen licht- en elektronenmicroscopie.
- Verdere toepassingen in de celbiologie worden aangemoedigd.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Correlatieve Licht-Elektronenmicroscopie (CLEM) pakt een kritiek knelpunt in virologisch onderzoek aan door gerichte analyse van zeldzame getransfecteerde of geïnfecteerde celpopulaties mogelijk te maken. Door fluorescentie-gebaseerde live-cell imaging te combineren met hoogresolutie ultrastructurele preservatie via high pressure freezing, vergroot deze methode het voorspellend vertrouwen in mechanistische studies naar virus-gastheerinteracties. Het ondersteunt vroege target-validatie en assay-ontwikkeling door correlatieve gegevens te leveren die functionele fenotypen verbinden met de subcellulaire architectuur, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in pipelines voor de ontdekking van antivirale middelen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de expressie van fluorescentielabelled virale eiwitten te koppelen aan ultrastructurele veranderingen in cryo-immobiliseerde cellen.
- Operationele waarde: Verhoogt de efficiëntie bij het bestuderen van transfectie- of infectiegebeurtenissen met een lage efficiëntie door middel van voorafgaande screening via lichtmicroscopie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het mechanistisch beperken van risico's door het visualiseren van virus-geïnduceerde membraanveranderingen en assemblageplaatsen die relevant zijn voor replicatiecomplexen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gecorreleerde fluorescentie- en elektronendichtheid-uitlezingen die een kwantitatieve beoordeling van de lokalisatie van virale eiwitten en structurele verstoringen mogelijk maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding met behulp van gepatteerde saffierdiscs, wat reproduceerbare correlatie tussen experimenten en gebruikers faciliteert.
- Klaarheid voor assay: Produceert ultrastructureel behouden monsters die geschikt zijn voor downstream imaging en morfometrische analyse in screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt structurele getrouwheid van live-cell imaging tot elektronenmicroscopie, wat fenotypische screening op basis van biomarkers ondersteunt in ziekterelevante systemen.
- Preklinische modellering: Maakt gedetailleerde karakterisering mogelijk van door virussen geïnduceerde cytopathische effecten in bijna-natuurlijke toestanden, wat het vertrouwen in translationele extrapolatie vergroot.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Levert ultrastructureel bewijs om werkingsmechanismen van antivirale kandidaten te ondersteunen of te weerleggen.
Integratie van Pipeline & Workflow
CLEM past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesegeneratie in de vroege virologie tot mechanistische validatie bij lead-optimalisatie, met name wanneer structurele correlaten van eiwitfuncties vereist zijn.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door directe visualisatie van structuren geassocieerd met virale eiwitten in gedefinieerde cellulaire subpopulaties mogelijk te maken.
- Screening: Verhoogt de betrouwbaarheid van assays door gestandaardiseerde cellokalisatie en cryopreservatie, waardoor variabiliteit in structurele resultaten wordt verminderd.
- Analytics: Levert gecorreleerde licht- en elektronenmicroscopie-datasets die kwantitatieve vergelijking van condities mogelijk maken op basis van fluorescentie-intensiteit en ultrastructurele kenmerken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen functionele beeldvorming en structurele data met hoge resolutie, wat de continuïteit ondersteunt van celgebaseerde assays naar mechanistische validatie.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van virus-gastheerinteracties dat toepasbaar is op meerdere targets en virale families.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door direct correlatief bewijs te leveren van de lokalisatie van virale eiwitten en geïnduceerde structurele veranderingen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerd gebruik van gepatroneerde substraten en hoogdrukvriezen, waardoor artefacten door chemische fixatie worden geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Faciliteert betere go/no-go-beslissingen door target-interactie op ultrastructureel niveau te valideren, wat het risico op falen in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van antivirale kandidaten mogelijk op basis van bevestigde effecten op virale replicatiecompartimenten of assemblageplaatsen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in live-cell fluorescentie-imaging, hoogdrukbevriezing, vriessubstitutie en transmissie-elektronenmicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot hoogdrukvriezers, ultramicrotomen en gecorreleerde licht- en elektronenmicroscopie-beeldvormingssystemen.
- Necessiteert standaardisatie van fiduciale markers (bijv. gepatronde saffierdiscs) en coördinatenmapping-protocollen tussen teams.
- Aanpassing aan verschillende celtypen of virale systemen kan optimalisatie van de transfectie-efficiëntie, fluorescentielabeling en bevriezingsparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten een lage doorvoer vanwege gespecialiseerde apparatuur en de noodzaak van correlatieve software-uitlijning, zoals vermeld in het bronmateriaal.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
