Name: Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer een kalibratievrije methode voor kwantificering van eiwit homo-oligomerisatie in vitro met fluorescentiefluctuatiespectroscopie. Deze techniek maakt drugscreening mogelijk met minimale hoeveelheden gelabelde eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust 105278/Z/14/2 toekennen R.N. De Wellcome Trust centrum voor menselijke erfelijkheid wordt gefinancierd door Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2. Werk in de groep C.S. wordt ondersteund door het Cancer Research UK (C20724/A14414) en de European Research Council van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma Grant 647278.

1. FKBP12 F36V - mVenus zuivering
<ol><li>Tover het geluid (DE3) pLysS cellen met pET22b vector met monomerized menselijke FKBP12F36V12 en N-terminal His6 en mVenus tags (vector beschikbaar op aanvraag). De cellen van de plaat op LB agar aangevuld met 50 µg/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol.</li>
	<li>Pipetteer getransformeerde kolonies in 100 mL LB starter cultuur en groeien voor 16-20 uur bij 37 ° C met schudden.</li>
	<li>Verdun dichte starter cultuur (OD600 > 1) 1:100 in LB medium (2 x 500 mL partijen) en groeien voor 2-3 uur tot OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).</li>
	<li>Cool culturen op het ijs. Met 250 µM IPTG veroorzaken en groeien voor 16-20 uur bij 21 ° C, 200 rpm.</li>
	<li>Oogsten van cellen door centrifugeren op 2.000 x g gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 40 mL IMAC buffer (20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazool 3 mM, 1 mM β-mercaptoethanol) aangevuld met EDTA-vrije proteaseinhibitors (1 tablet per cel pellet).</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten cellen (500 watt, 20 kHz, 40% amplitude, 9 s op, 11 s uit voor 15 min) op ijs en oogst oplosbaar materiaal door centrifugeren op 20.000 x g.</li>
	<li>Overdracht oplosbare lysate over in een erlenmeyer en voeg 2 mL hars (Zie Tabel van materialen). Incubeer gedurende 1 uur met 105 rpm rotatie Opmerking: Nikkel sepharose kan ook worden gebruikt voor deze stap van de IMAC.</li>
	<li>Oogsten van hars en wassen met 250 mL IMAC buffer A gevolgd door 500 mL IMAC buffer B (imidazol 7 mM, 20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoethanol). Opmerking: Oplopen tot 50 mM imidazool als nikkel sepharose hars gebruikt.</li>
	<li>Elueer His6-gelabeld eiwit met IMAC buffer C (20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazool 300 mM, 1 mM β-mercaptoethanol).</li>
	<li>Injecteren op de uitsluiting van een grootte kolom (Zie Tabel van materialen) geëquilibreerd in 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V heeft haar piek elutie bij 87.71 mL op de kolom die we gebruikten.</li>
	<li>Beoordelen van zuiverheid via SDS-pagina en zwembad en concentreren zoals vereist.</li>
</ol>2. voorbereiding van Multiwell plaat Array
<ol><li>Het gezuiverde FKBP12F36V ontdooien (of het label van de proteïne van belang) van-80 ° C.</li>
	<li>Bereiden van een oplossing van 100 nM gezuiverd FKBP12F36V (middellange, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Bewerk ultrasone trillingen ten samen en centrifugeer (snelle spin voor 13.000 rpm) om te voorkomen dat de vorming van aggregaten.</li>
	<li>Pipetteer 100-200 µL in een kamer 8 goed observatie met een glazen bodem.</li>
	<li>De BB-dimerizer aan de eindconcentraties van 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 en 500 nM12,13toevoegen.</li>
	<li>Als referentie, bereid een oplossing van 100 nM van mVenus alleen om te evalueren van potentiële effecten van de globalisatie en neerslag en een helderheidswaarde voor het monomeer met dezelfde overname-instellingen herstellen.</li>
</ol>3. kalibratie-gratis Confocal overname
<ol><li>Beginnen met de confocal systeem (Figuur 1). Geen licht scanning microscoop confocal systeem voorzien van digitale detectoren of goed gekarakteriseerd analoge detectoren8, en staat houden een constante Nadruktijd voor elke pixel verworven zou werken.</li>
	<li>Het pad van de lichtbundel van de excitatie instellen:<ol>
<li>Zet de 514 nm laser en reeks het op 20-100 nW macht bij de uitgang van de doelstelling (voor FKBP12F36V-mVenus).</li>
		<li>Selecteer het 63X1.4NA doel of een kraag correctie water onderdompeling doel ontworpen voor FCS.</li>
		<li>Zet één HyD, APD of gekalibreerde bet detector. Detectoren staat foton-tellen zijn te verkiezen boven, zoals in dit geval, berekening van S, offset en σ02 zijn overbodig.</li>
		<li>Selecteer het venster van de emissie van 520-560 nm</li>
		<li>Het gaatje vastgesteldop 1 luchtige eenheid voor de overeenkomstige emissie ~ 545 nm.</li>
		<li>De overname-modus instellen op 16 x 16 pixels</li>
		<li>De pixel Nadruktijd tijd twonen zo ingesteld dat het voldoet aan tframe >> TD >> twonen, waar D de verblijftijd van de diffusing eiwitten en t is frame wordt de framerate. Dit kwam overeen met het instellen van de nadruktijd op ~ 13 µs. Opmerking: Sommige commerciële fabrikanten had scanners die niet constant te de nadruktijd per pixel houden waren. Deze standvastigheid is cruciaal voor de methode om te werken.</li>
		<li>De pixelgrootte vastgesteldop ~ 120 nm.</li>
		<li>De xyt acquisitie-modus selecteren en selecteer het aantal frames aan te schaffen per acquisitie en goed (bijvoorbeeld 5000).</li>
		<li>Als het systeem is uitgerust met high-throughput modus, nemen de coördinaten van elk putje en het aantal overnames per putje om het proces te automatiseren. Opmerking: Wees voorzichtig om de aanwezigheid van een water dispenser voor als een streven naar onderdompeling.</li>
		<li>Als het systeem is uitgerust met een systeem van perfusie, laden de BB-oplossing en program de perfusie om te beginnen rechts-na het 5000th frame te evalueren van de kinetiek van dimerisatie terwijl bijvoorbeeld 10.000 afbeeldingen ophalen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg een druppel olie in de olie-immersie-doelstelling / water als met behulp van een kraag correctie water onderdompeling doel ontworpen voor FCS.</li>
	<li>Monteer de zaal 8 goed observatie in het werkgebied.</li>
	<li>Selecteer de juiste bron en zich richten op de oplossing. Opmerking: Belangrijk: voorkomen gericht dicht bij het onderste glas om reflectie en verstrooiing te voorkomen. Bij het scherpstellen dieper in de oplossing, ontkoppel de optie Automatische focus.</li>
	<li>Start van de overname en de resulterende stapel afbeeldingen opslaan in TIFF-indeling.</li>
</ol>4. detrend en helderheid analyse met behulp van de nandb R Package
<ol><li>Als een pre-processing kwaliteitscontrole, gebruikt u ImageJ14 Neem een kijkje op de beelden en het herstellen van het profiel van de intensiteit, zoals weergegeven in Figuur 2een. Dit is handig om te bepalen al dan niet teveel photobleaching opgetreden. Als er teveel bleken, zijn de gegevens niet geschikt voor verdere analyse. Opmerking: ImageJ kan ook bruikbaar om afbeeldingen te converteren naar TIFF van commerciële formaten. De software van de nandb hieronder beschreven kan alleen functioneren met TIFF-bestanden.</li>
	<li>Download en installeer R en RStudio15,16. Het is het beste om te downloaden en installeren van R eerst, dan RStudio. Opmerking: Wat volgt is een beschrijving van het gebruik van de nandb R-pakket. Kennis van de taal R is niet verplicht te gebruiken nandb, maar het zal het leven makkelijker maken.</li>
	<li>Installeer het pakket nandb.<ol>
<li>Open RStudio en typ install.packages("nandb") in de console en wacht tot de installatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak kennis met nandb<ol>
<li>Bekijk de handmatige17.</li>
		<li>Bekijk de ingebouwde RStudio help voor verschillende functies. De meest waarschijnlijke functie worden gebruikt zal worden met behulp van brightness() zal worden. Het help-bestand voor deze functie weergeven door te typen? Brightness() bij de console.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berekenen van de helderheid<ol>
<li>Men moet zeggen een image-bestand op het bureaublad genaamd img001.tif (merk op dat 'nandb' alleen met de TIFF-bestanden werkt). Men kan de helderheid van dat beeld berekenen: b <-helderheid ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")<ol>
<li>Dit wordt de helderheid van de afbeelding toegewezen aan de variabele b in R. De tau = "auto" zorgt ervoor dat de afbeelding voorafgaand aan helderheid berekening correct is detrended. De meest voorkomende ding te doen vanaf hier is het berekenen van het gemiddelde of de mediaan helderheid van de afbeelding. Men kan dit doen door mean(b) of median(b) te typen. Men kan ook de helderheid afbeelding naar de desktop gebruiken schrijven ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zeggen een map vol afbeeldingen images_folder op het bureaublad heeft en men moet berekenen van de helderheden van deze beelden en de beelden van de helderheid als TIFF-bestanden schrijven. Dan zien? brightness_folder(). Deze functie verwerkt ineens een hele map: brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto") Dit is met name goed voor degenen die hebben een software die zij te R verkiezen, omdat alle bestanden worden verwerkt in één enkele opdracht, en vervolgens een blijven met de output helderheid TIFF-afbeeldingen in hun gekozen software werken kunt, worden het ImageJ14 , Python of iets anders.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+fluorescence+lifetime+correlation+spectroscopy+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell.</a> Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Tramier, M., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+imaging+microscopy+for+homo-FRET+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).</li>
<li>Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein+aggregation+and+interaction+in+live+cells%3A+A+guide+to+number+and+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. , (2017).</li>
<li>Hur, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Brightness+from+Living+Cells+in+the+Presence+of+Photodepletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).</li>
<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
<li>RStudio: Integrated Development Environment for R. <a target="_blank" href="http://web.warwick.ac.uk/statsdept/useR-2011/abstracts/180111-allairejj.pdf">R Team</a>. , (2016).</li>
<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

N & B is een techniek voor het detecteren van multimerization met behulp van commerciële licht scannen confocal microscopen uitgerust met digitale detectoren. Deze aanpak is heel aantrekkelijk in vergelijking met aanspreekpunt FCS, FCCS en smFRET omdat het gratis kalibratie en de berekening van de helderheid is eenvoudig en concentratie onafhankelijke6. Het is van groot belang, echter om te corrigeren voor bleken en lange termijn intensiteit schommelingen voordat u helderheid berekeningen<sup clas...

Eiwit-eiwit interacties Ik n Vitro
Traditioneel, zijn kristallografie en nucleaire magnetische resonantie experimenten in combinatie met cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) de technologieën gekozen om te nauwkeurig beschrijven de driedimensionale structuur van eiwitten en hun functie door afleiden onderzoekend hun structurele details in hoge resolutie. Eiwitten, echter zijn niet statisch structuren en een scala aan conformationele wijzigingen en trillingen kunnen ondergaan in tijd en ruimte. Daarom is het structurele informatie uit kristallografische of CryoEM gegevens moet worden aangevuld met andere technieken (bijvoorbeeld moleculaire dynamica simulaties en enkel molecuul technieken): de functie van een eiwit is gerelateerd aan de conformationele wijzigingen en interacties, en deze informatie is niet aanwezig in een statische-structuurdiagram. Om de sonde voor intra moleculaire dynamica, zijn technieken op basis van één molecuul Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) zeer effectief1. Deze benaderingen zijn in staat om te beoordelen van verschillende subpopulaties van moleculen in complexe media. Dit is zeer belangrijk, aangezien deze veranderingen snelle zijn en tijdens de overname van de gegevens (dat wil zeggen, een nanoseconde naar tweede bereik optreden).
Twee van de belangrijkste benaderingen vaak werkzaam zijn voor het detecteren en kwantificeren van deze wijzigingen: eiwitten in oplossing en oppervlakte-immobilisatie. Voor de detectie van Inter moleculaire interacties en in het bijzonder, het proces van dimerisatie geïnduceerd door liganden, is smFRET niet altijd het beste instrument. Inderdaad, FRET niet alleen hangt af van de afstand (≈10 nm) maar ook op de oriëntatie van de twee dipolen (donor en acceptor, χ2) en de overlapping van de emissie van de donor met van de acceptor absorptiespectra2, maar misschien deze laatste voorwaarde is minder mits het Vejle kunt koos belangrijk de juiste FRET paar. Een bijzonder nadeel van smFRET voor het sonderen van homo-dimerisatie komt uit de etikettering van de proteïne van belang: voor hetero smFRET, dimerisatie kan alleen worden gedetecteerd tot 50% (dat wil zeggen, hetero-FRET zullen uitsluitend kundig voor speurder donor-acceptor en acceptor-donor homo-Dimeren maar niet donor-donor of acceptor-acceptor, die de overige 50% van de Dimeren). Het gebruik van fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) en derivaten (FCCS, etc.3) vast te stellen eiwit diffusie constanten en bindende constanten in vitro is een ander alternatief. Deze benaderingen zijn niet kundig voor homo-dimerisatie ofwel volledig te kwantificeren, zoals FCS één maatregelen concentratie en verspreiding, en de straal en diffusie coëfficiënt van een diffusing deeltje zijn zeer slecht afhankelijk van het molecuulgewicht; bijvoorbeeld zal een 10-fold verhoging van het molecuulgewicht alleen impliceren een verandering 2.15 vouwen in de diffusie coëfficiënt4. In het geval van twee kleuren FCS of FCCS, zal slechts 50% van de homo-Dimeren blijken om dezelfde reden als hierboven. De meest praktische en kwantitatieve benaderingen voor het detecteren van homo-dimerisatie in vitro en in vivo zijn homo-FRET5 en nummer en helderheid (N & B)6. Gezien het feit dat homo-FRET vereist specifieke instrumentatie herstel van de anisotropie waarde (bijvoorbeeld optische elementen/analysers om te herstellen van de parallelle en loodrechte polarisatie), N & B wordt gepresenteerd als een gunstige techniek om hier het detecteren van eiwitten homo-dimerisatie en aggregatie. Het kan worden gebruikt zowel in vitro als in vivo met een commerciële set-up.
Aantal en helderheid
N & B is onlangs herziene7. Die herziening gericht op de toepassing van de techniek in levende cellen. Het is de moeite waard om te reproduceren het wiskundig formalisme hier als deze vergelijkingen worden toegepast op de gegevens verzameld in vitro. Eerste plaats is het noodzakelijk om enkele voorwaarden en wiskundige hoeveelheden te definiëren:
<ul><li>Een entiteit is een verzameling van moleculen die met elkaar zijn verbonden.</li>
	<li>De helderheid ε van een entiteit is het aantal fotonen die het stoot per tijdseenheid (per frame).</li>
	<li>
n is het aantal entiteiten aanwezig.</li>
	<li>Voor een bepaalde pixel in de loop van een beeld-serie is dat zijn gemiddelde intensiteit en σ2 is de afwijking in de intensiteit.</li>
</ul>Vervolgens met het foton tellen detectoren en uitgaande mobiele entiteiten en geen achtergrond,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
waarbij N staat voor het schijnbare aantal en B is de schijnbare helderheid. Dit resulteert in
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Dalal et al. 8 bleek dat met analoge apparatuur, drie correctietermen moet: de S-factor, de verschuivingvan de achtergrond en de uitlezing lawaai σ0-2. Vervolgens, wederom ervan uitgaande dat mobiele entiteiten,
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
geven
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
Merk op dat de bovenstaande vergelijking voor verschillende dat gegeven in Dalal et al. 8 en een latere toetsing. 7 in Dalal et al. de S in de noemer als gevolg van een typfout werd weggelaten en deze fout werd gereproduceerd in de review. De bovenstaande vergelijking is de juiste is. Instructies voor het meten van S, offset en σ02 - samen met een verklaring van hun betekenis - worden gegeven door Dalal et al. 8
De helderheid ε is evenredig aan de oligomere staat voor de diffusing entiteiten: ε zullen twee keer zo groot voor Dimeren als voor monomeren, driemaal zo groot voor trimeren als voor monomeren, tweemaal zo groot voor hexamers als voor trimeren, enzovoort. Op deze manier, meten de helderheid ε, kan een het kwantificeren van elk type multimerization.
Als er een mengsel van oligomere Staten aanwezig, nummer en helderheid is niet geschikt voor het herstellen van de individuele oligomere Staten aanwezig. Dit is een beperking van de techniek.
Detrend-algoritme en nandb software
Het belang van het corrigeren van photobleaching geweest eerder benadrukt9. Photobleaching onvermijdelijk optreedt tijdens de lichte microscopie van experimenten in time-lapse modus; zowel in levende cellen en in vitro. Vele benaderingen zijn beschreven in de literatuur om te corrigeren voor het bleken van7. De exponentiële filteringtechniek met automatische keuze van detrending parameter T is de huidige beste. Het is geïntegreerd in de gratis, open source software nandb9. Inderdaad, software die de gebruiker handmatig kiezen hun detrending parameter vereist kan leiden tot onjuiste resultaten omdat deze parameter keuze waarschijnlijk willekeurige en onjuist zullen. De automatische algoritme inspecteert de gegevens en de juiste parameter bepaalt, zonder de noodzaak voor gebruiker interventie9. Zelfs met de beste keuze van smoothing parameter, detrending heeft zijn beperkingen en werkt alleen goed met photobleaching percentages lager is dan 25%, zoals met simulaties9. Interessant is dat bij het gebruik van de automatische detrending routine, de juistheid ervan is zodanig dat men met lage helderheidswaarden werken kan (zelfs B < 1.01), en dus lage intensiteit, en nog steeds nauwkeurig genoeg om het kwantificeren van homo-dimerisatie.
Photobleaching veroorzaakt ook een ander probleem: de aanwezigheid van photobleached fluorophores in een complexe multimer. Dit maakt bijvoorbeeld een trimeer verschijnen als een dimeer wanneer één van de drie units in de trimeer is niet-belichting fluorescerende. Hur en Mueller10 toonde hoe te corrigeren voor dit en deze correctie werd ook benadrukt in een latere herziening7. De software van de nandb bevat deze correctie9.
De FKBP12 F36V systeem
FKBP12F36V is een proteïne die doet natuurlijk niet oligomerize, maar is bekend dat bij de toevoeging van de AP20187 drug (gemeenzaam bekend als de BB dimerizing ligand)11,12dimerize. Dit maakt het een ideale testcase voor nummer en helderheid: met gelabelde FKBP12F36V, een verdubbeling van de oligomere staat moet worden nageleefd bij toevoeging van BB.

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) pLysS cellen</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB-startcultuur</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-medium</td><td>QIAGEN</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID 329815691</td><td></td></tr><tr><td>IMAC-buffer</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-vrije proteaseremmers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON-hars</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikkel-sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 kolom</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observatiebak met glazen bodem en 8 putjes</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

kalibratie-gratis in vitro kwantificering van eiwit homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en software van de analyse van de helderheid van gratis, open source

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Aantal en helderheid is een kalibratie-vrije fluorescentie schommelingen spectroscopie (FFS) techniek voor het opsporen van eiwit homo-oligomerisatie. Het kan worden gebruikt met behulp van een conventionele confocal microscoop uitgerust met digitale detectoren. Een protocol voor het gebruik van de techniek in vitro wordt weergegeven door middel van een use-case waar nummer en helderheid te nauwkeurig het kwantificeren van de oligomere Braziliaanse deelstaat mVenus-gelabelde FKBP12F36V voor en na de toevoeging van de dimerizing drug AP20187 kunnen worden gezien. Het belang van het gebruik van de juiste Microscoop verwerving parameters en de juiste gegevens voorbewerken en analysemethoden worden besproken. In het bijzonder wordt het belang van de keuze van photobleaching correctie benadrukt. Deze goedkope methode kan worden gebruikt om te studeren van eiwit-eiwitinteractie in veel biologische contexten.

Detrending en monomeer helderheid
Zodra de gegevens heeft verkregen, kan men beginnen de helderheid berekeningen om te bepalen van de oligomere staat voor de proteïne van belang in de oplossing. Zelfs als het effect van bleken in oplossing mogelijk niet zo drastisch kan als het in vivo, de intensiteit trace zal waarschijnlijk niet nog stationaire bedoel, mogelijk als gevolg van fotofysische effecten aan...

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van drugsscreening, zoals het verhelderen van het effect van kleine molecuulremmers op zeer lage concentraties voor eiwit-eiwitinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kalibratievrij is, het kan worden geïmplementeerd in elke confocale microscoop en gebruikt zeer kleine hoeveelheden gelabelde eiwitten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van kankermedicijnen, kleine molecuulremmers en verschillende fusie-remmers, omdat het kwantitatieve informatie biedt over eiwit-eiwitinteracties.Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitinteracties en aggregaties in vitro, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals dynamische eiwitten in levende cellen en cel-celinteracties. Om te beginnen, transformeer pLysS-cellen met een pET-22b-vector die gemonomeriseerd humaan FKBP12 en N-terminaal His6 en mVenus-tags bevat. Nadat de cellen zijn hersteld van het incuberen en hitteschok, plateer ze op LB-agar aangevuld met antibiotica.Breng de getransformeerde kolonies over naar een 100-milliliter LB-startcultuur en kweek ze gedurende 16 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met schudden. Na incubatie, verdun de dichte startcultuur een op honderd in LB-medium in twee batches van 500 milliliter. Laat vervolgens twee tot drie uur groeien tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,6 tot 0,8.Nadat de culturen op ijs zijn afgekoeld, induceer de eiwitproductie met 250-micromolar IPTG. Laat de culturen gedurende 16 tot 20 uur groeien bij 21 graden Celsius en 200 rpm. Vervolgens, verzamel de cellen door centrifugatie bij 2.000 g gedurende 20 minuten.Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet in 40 milliliter IMAC-buffer A aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmers. Soniseer vervolgens de cellen bij 500 watt, 20 kilohertz en 40% amplitude bij negen seconden aan, elf seconden uit gedurende 15 minuten op ijs. Na sonicatie, verzamel het oplosbare materiaal door centrifugatie bij 20.000 g gedurende een uur bij vier graden Celsius.Breng het oplosbare lysate over naar een conische kolf en voeg twee milliliter TALON-hars toe. Laat de suspensie een uur incuberen met rotatie van 105 rpm. Verzamel nu de hars en was het met 250 milliliter IMAC-buffer A gevolgd door 500 milliliter IMAC-buffer B. Elueer His6-getagd eiwit met behulp van IMAC-buffer C. Injecteer het eluaat op een vooraf geëquilibreerde grootte-exclusiekolom en verzamel de FKBP12-piek, die elueert bij ongeveer 87,7 milliliter.Beoordeel de zuiverheid van het eiwit via SDS-PAGE en pool en concentreer zo nodig. Om de multiwell plate array op te zetten, bereid eerst een oplossing van 100-nanomolar gezuiverd FKBP12 in dezelfde buffer die voor grootte-exclusiechromatografie werd gebruikt. Soniseer en centrifugeer met een snelle spin van 13.000 rpm om de vorming van aggregaten te voorkomen.Pipetteer nu 100 tot 200 microliter van de verdunde eiwit in een acht-well observatiekamer met een glazen bodem. Voeg de BB-dimerizer toe tot eindconcentraties van 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 en 500 nanomolar. Als referentie, bereid een oplossing van 100-nanomolar mVenus alleen om mogelijke aggregatie- en precipitatie-effecten te evalueren en om een helderheidswaarde voor de monomeer met dezelfde acquisitie-instellingen te herstellen.Elk lichtscannend confocale microscoopsysteem uitgerust met digitale detectoren of goed gekarakteriseerde analoge detectoren en in staat om een constante verblijftijd te behouden voor elke verkregen pixel kan worden gebruikt. Selecteer de waterimmersieobjectief met kraagcorrectie ontworpen voor fluorescentiecorrelatiespectroscopie. Voeg nu een druppel water toe aan het waterimmersieobjectief met kraagcorrectie.Monteer de acht-well observatiekamer in de stage. Stel de excitatiebundelpad in door de 514-nanometer laser aan te zetten en deze in te stellen op 20 tot 100 nanowatt vermogen bij de uitgang van het objectief. Zet een HyD-detector aan.Detectoren die in staat zijn tot fotontelling zijn preferabel. Selecteer het emissievenster van 520 tot 560 nanometer. Gebruik voor de acquisitiemodus 16 bij 16 pixels.Stel de pixelverblijftijd zo in dat de frametijd langer is dan de eiwitdiffusie en de pixelverblijftijd veel korter is. Dit kwam overeen met het instellen van de verblijftijd op ongeveer 13 microseconden voor het systeem dat in deze demonstratie werd gebruikt. Stel de spletenopening op één Airy-eenheid voor de overeenkomstige emissie van ongeveer 545 nanometer.Selecteer de xy tijdverwervingsmodus en selecteer het aantal frames dat per verwerving en put moet worden verkregen. Stel nu de pixelgrootte in op ongeveer 120 nanometer. Als het systeem is uitgerust met een doorvoersysteem, introduceer de coördinaten van elke put en het aantal verwervingen per put om het proces te automatiseren.Als het systeem is uitgerust met een perfusiesysteem, laad de BB-oplossing en programmeer de perfusie om direct na de 5.000e frame te beginnen om de kinetica van dimerisatie te evalueren terwijl 10.000 afbeeldingen worden verkregen. Selecteer de juiste put en focus op de oplossing. Start vervolgens de verwerving en sla de resulterende stapel afbeeldingen op in TIFF-formaat.Sequenties van 20.000 afbeeldingen van gezuiverd FKBP12 mVenus in 100-nanometer oplossing werden verkregen zoals gespecificeerd in de protocolsectie. De intensiteit van het eerste frame wordt weergegeven samen met het gemiddelde intensiteitsprofiel van het gedetrendde beeld. De helderheid zonder en met gladde filtering is ook getoond.Nadat 10.000 frames zijn verkregen, werd het homodimerisator medicijn BB aan de oplossing toegevoegd terwijl verkregen werd. Elke opeenvolgende reeks van 5.000 frames werd geanalyseerd. De gemiddelde helderheid vijf minuten na BB-toevoeging was 1.01

calibration-free-vitro-quantification-protein-homo-oligomerization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

This video demonstrates the technique of fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) to study protein homo-oligomerization. Fluorescently-labeled proteins in a sample are dimerized using an agent when studying protein oligomerization using FFS. Using a confocal microscope, as the proteins move in and out of the small observation volume, the analysis of the fluctuations in the brightness of the fluorescent molecules is performed to determine the oligomeric state of the proteins.

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Homo-Oligomerization

Hier beschrijven we protocollen om endogene en exogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te detecteren en deze eiwitniveaus op centromeren-kinetochoren te kwantificeren door indirecte immunofluorescente kleuring door het gebruik van fixatie (paraformaldehyde, aceton of methanol fixatie).

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

We beschrijven een beeldvormings aanpak voor de bepaling van de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor oligomeren geïnduceerd door ligand binding in het plasma membraan van levende cellen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N &amp; B) analyse.

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Hier beschrijven we protocollen voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS) waarbij de ubiquitine-ligases Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) en Cereblon (CRBN) betrokken zijn.  Biofysische methoden die hierin worden geïllustreerd, zijn onder meer oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC).

De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

Dit protocol combineert massafotometrie met een nieuw microfluïdica-systeem om eiwit-eiwitinteracties met een lage affiniteit te onderzoeken. Deze aanpak is gebaseerd op de snelle verdunning van sterk geconcentreerde complexen in oplossing, wat metingen met een lage affiniteit mogelijk maakt en de toepasbaarheid van massafotometrie verbreedt.

Analyse van de vorming van eiwitcomplexen bij micromolaire concentraties door microfluïdica te koppelen aan massafotometrie

Leer een kalibratievrije methode voor kwantificering van eiwit homo-oligomerisatie in vitro met fluorescentiefluctuatiespectroscopie. Deze techniek maakt drugscreening mogelijk met minimale hoeveelheden gelabelde eiwitten.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source (Video) | JoVE Journal

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Meer video's verkennen