Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van drugsscreening, zoals het verhelderen van het effect van kleine molecuulremmers op zeer lage concentraties voor eiwit-eiwitinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kalibratievrij is, het kan worden geïmplementeerd in elke confocale microscoop en gebruikt zeer kleine hoeveelheden gelabelde eiwitten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van kankermedicijnen, kleine molecuulremmers en verschillende fusie-remmers, omdat het kwantitatieve informatie biedt over eiwit-eiwitinteracties.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitinteracties en aggregaties in vitro, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals dynamische eiwitten in levende cellen en cel-celinteracties. Om te beginnen, transformeer pLysS-cellen met een pET-22b-vector die gemonomeriseerd humaan FKBP12 en N-terminaal His6 en mVenus-tags bevat. Nadat de cellen zijn hersteld van het incuberen en hitteschok, plateer ze op LB-agar aangevuld met antibiotica.

Breng de getransformeerde kolonies over naar een 100-milliliter LB-startcultuur en kweek ze gedurende 16 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met schudden. Na incubatie, verdun de dichte startcultuur een op honderd in LB-medium in twee batches van 500 milliliter. Laat vervolgens twee tot drie uur groeien tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,6 tot 0,8.

Nadat de culturen op ijs zijn afgekoeld, induceer de eiwitproductie met 250-micromolar IPTG. Laat de culturen gedurende 16 tot 20 uur groeien bij 21 graden Celsius en 200 rpm. Vervolgens, verzamel de cellen door centrifugatie bij 2.000 g gedurende 20 minuten.

Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet in 40 milliliter IMAC-buffer A aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmers. Soniseer vervolgens de cellen bij 500 watt, 20 kilohertz en 40% amplitude bij negen seconden aan, elf seconden uit gedurende 15 minuten op ijs. Na sonicatie, verzamel het oplosbare materiaal door centrifugatie bij 20.000 g gedurende een uur bij vier graden Celsius.

Breng het oplosbare lysate over naar een conische kolf en voeg twee milliliter TALON-hars toe. Laat de suspensie een uur incuberen met rotatie van 105 rpm. Verzamel nu de hars en was het met 250 milliliter IMAC-buffer A gevolgd door 500 milliliter IMAC-buffer B. Elueer His6-getagd eiwit met behulp van IMAC-buffer C. Injecteer het eluaat op een vooraf geëquilibreerde grootte-exclusiekolom en verzamel de FKBP12-piek, die elueert bij ongeveer 87,7 milliliter.

Beoordeel de zuiverheid van het eiwit via SDS-PAGE en pool en concentreer zo nodig. Om de multiwell plate array op te zetten, bereid eerst een oplossing van 100-nanomolar gezuiverd FKBP12 in dezelfde buffer die voor grootte-exclusiechromatografie werd gebruikt. Soniseer en centrifugeer met een snelle spin van 13.000 rpm om de vorming van aggregaten te voorkomen.

Pipetteer nu 100 tot 200 microliter van de verdunde eiwit in een acht-well observatiekamer met een glazen bodem. Voeg de BB-dimerizer toe tot eindconcentraties van 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 en 500 nanomolar. Als referentie, bereid een oplossing van 100-nanomolar mVenus alleen om mogelijke aggregatie- en precipitatie-effecten te evalueren en om een helderheidswaarde voor de monomeer met dezelfde acquisitie-instellingen te herstellen.

Elk lichtscannend confocale microscoopsysteem uitgerust met digitale detectoren of goed gekarakteriseerde analoge detectoren en in staat om een constante verblijftijd te behouden voor elke verkregen pixel kan worden gebruikt. Selecteer de waterimmersieobjectief met kraagcorrectie ontworpen voor fluorescentiecorrelatiespectroscopie. Voeg nu een druppel water toe aan het waterimmersieobjectief met kraagcorrectie.

Monteer de acht-well observatiekamer in de stage. Stel de excitatiebundelpad in door de 514-nanometer laser aan te zetten en deze in te stellen op 20 tot 100 nanowatt vermogen bij de uitgang van het objectief. Zet een HyD-detector aan.

Detectoren die in staat zijn tot fotontelling zijn preferabel. Selecteer het emissievenster van 520 tot 560 nanometer. Gebruik voor de acquisitiemodus 16 bij 16 pixels.

Stel de pixelverblijftijd zo in dat de frametijd langer is dan de eiwitdiffusie en de pixelverblijftijd veel korter is. Dit kwam overeen met het instellen van de verblijftijd op ongeveer 13 microseconden voor het systeem dat in deze demonstratie werd gebruikt. Stel de spletenopening op één Airy-eenheid voor de overeenkomstige emissie van ongeveer 545 nanometer.

Selecteer de xy tijdverwervingsmodus en selecteer het aantal frames dat per verwerving en put moet worden verkregen. Stel nu de pixelgrootte in op ongeveer 120 nanometer. Als het systeem is uitgerust met een doorvoersysteem, introduceer de coördinaten van elke put en het aantal verwervingen per put om het proces te automatiseren.

Als het systeem is uitgerust met een perfusiesysteem, laad de BB-oplossing en programmeer de perfusie om direct na de 5.000e frame te beginnen om de kinetica van dimerisatie te evalueren terwijl 10.000 afbeeldingen worden verkregen. Selecteer de juiste put en focus op de oplossing. Start vervolgens de verwerving en sla de resulterende stapel afbeeldingen op in TIFF-formaat.

Sequenties van 20.000 afbeeldingen van gezuiverd FKBP12 mVenus in 100-nanometer oplossing werden verkregen zoals gespecificeerd in de protocolsectie. De intensiteit van het eerste frame wordt weergegeven samen met het gemiddelde intensiteitsprofiel van het gedetrendde beeld. De helderheid zonder en met gladde filtering is ook getoond.

Nadat 10.000 frames zijn verkregen, werd het homodimerisator medicijn BB aan de oplossing toegevoegd terwijl verkregen werd. Elke opeenvolgende reeks van 5.000 frames werd geanalyseerd. De gemiddelde helderheid vijf minuten na BB-toevoeging was 1.01