Long fixatie onder constante druk voor de evaluatie van emfyseem bij muizen
26 september 2019
Hier gepresenteerd is een nuttig protocol voor Long fixatie die een stabiele aandoening creëert voor histologische evaluatie van Long specimens uit een muismodel van emfyseem. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het veel longen met dezelfde constante druk kan oplossen zonder longcollaps of deflatie.
De constante druk in het fixatieapparaat behoudt de longen in een redelijk opgeblazen toestand, waardoor een histologisch longexemplaar ontstaat dat geschikt is voor de evaluatie van milde sigarettenrook geïnduceerde emfyseem. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het veel longen tegelijkertijd kan repareren met dezelfde constante druk zonder instorting of deflatie van de longen. Het aantonen van de procedure zal Naoko Arano een afgestudeerde student van mijn laboratorium.
Na bevestiging van een gebrek aan reactie op reflexbeweging maak een incisie in de huid en spierweefsel langs de mediale lijn van de muis, gericht op de kopvormige regio, en lateraal gesneden om een bredere werkruimte te creëren. Na het blootstellen van de middenriflaag doorboren het weefsel met tangen en open de thoracale ruimte. Snijd het achterstevengebied waardoor de longen en het hart kunnen worden gevisualiseerd.
En snijd het linker atrium en de rechter hartkamer. Steek een 24-meter canule aangesloten op een perfusiepomp in het rechter ventrikelgebied en richt de canule naar het cephalic gebied totdat het de longslagader bereikt. Zet vervolgens de pomp aan en doorsnijd het weefsel met ongeveer 200 milliliter PBS gedurende een uur totdat al het longweefsel is veranderd in een witte kleur.
Aan het einde van de perfusie snijd het bindweefsel rond de luchtpijp, longen en hart, en gebruik een hechting af te binden van de juiste belangrijkste bronchus. Oogst vervolgens alle individuele lobben van de rechterlong en plaats het hart en de kwabben van de linkerlong in individuele 10 milliliter spuiten met een geschikte fixatief. Trek de zuiger in waardoor een vacuüm in de spuit ontstaat om de longen op te blazen en de long uit de spuit te verwijderen.
Steek een canule van 20 meter in de luchtpijp en gebruik een hechting om de canule op zijn plaats te zetten. Sluit een een milliliter spuit gevuld met fixatief op de canule en vul de long met extra fixatief om te controleren op lekken. Zorg ervoor dat de invoegplaats is beveiligd om te voorkomen dat het longmonster tijdens de fixatie loskomt van het longbord.
Breng het weefsel vervolgens over naar de drukapparatuur voor longfixatie, verwijder het monster en bindt de luchtpijp aan het einde van de fixatieperiode met een knoop. De onderste component van de longfixatiedrukapparatuur waarin het longmonster wordt ingebracht, wordt via 20 meter cannula verbonden met het puntje van de formaline stroom met een driewegstopcock. Druk wordt gegenereerd door de verschillende oppervlakteniveaus van het fixatief tussen de onderste en bovenste compartimenten.
Het drukverschil is 25 centimeter water, maar de hoogteverstellingsknop kan worden gebruikt om de druk aan te passen aan 25 tot 30 centimeter water. Een pomp verbindt de onderste en bovenste containers, het behoud van een 25 centimeter verschil in de fixatieve oppervlakte hoogte, en stuurt de stroom van het middel. Na 48 uur fixatie vertonen de longen van SMP30 knock-out muizen die zijn blootgesteld aan omgevingslucht geen duidelijke luchtruimuitbreiding.
Significante luchtruim uitbreiding en alveololerende muur vernietiging, echter, worden waargenomen in SMP30 knock-out muizen blootgesteld aan chronische sigarettenrook. Bovendien zijn de gemiddelde lineaire onderschepping en destructieve index van de longmonsters aanzienlijk groter in de rook blootgestelde SMP30 knock-out muizen dan in de lucht blootgestelde dieren. Ons lab maakt gebruik van 10% formaline, maar onderzoekers kunnen gebruik maken van andere fixatie middelen op basis van hun experimentele behoeften.
Zoals we hebben gemeld met behulp van de aangetoonde fixatie systeem longmonsters kunnen worden geoogst uit verschillende muis emfyseem modellen voor hun morfometrische evaluatie. Aangezien bevestigingsmiddelen gevaarlijk kunnen zijn, moet u altijd de juiste beschermingsmiddelen voor het personeel dragen en in een goed geventileerde ruimte werken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor longfixatie die stabiele omstandigheden waarborgt voor de histologische evaluatie van longmonsters uit een muismodel voor emfyseem. De techniek maakt het mogelijk om meerdere longen gelijktijdig te fixeren zonder dat deze inklappen of leeglopen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Histologie
Achtergrond
- Emfyseem is een longaandoening die vaak wordt veroorzaakt door sigarettenrook.
- Histologische evaluatie is essentieel voor het begrijpen van longpathologie.
- Het behouden van de longexpansie tijdens de fixatie is noodzakelijk voor een nauwkeurige beoordeling.
- Dit protocol behandelt de uitdagingen bij longfixatietechnieken.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode voor longfixatie te presenteren.
- Om de evaluatie van longmonsters in onderzoek te vergemakkelijken.
- Om de consistentie bij de histologische analyse van emfyseemmodellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een fixatieapparaat dat een constante druk handhaaft.
- Incisie langs de mediale lijn van de muis om toegang te krijgen tot de borgholte.
- Doorprikken van het diafragma om de borstholte te openen.
- Visualisatie van de longen en het hart voor de afname van monsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle handhaving van de longopblaasing tijdens de fixatie.
- Mogelijkheid om meerdere longen gelijktijdig te fixeren.
- Stabiele histologische monsters die geschikt zijn voor evaluatie.
- Demonstratie van de procedure door een promovendus.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de fixatie van de longen.
- Het verbetert de kwaliteit van histologische evaluaties in onderzoek.
- Deze techniek kan worden toegepast in diverse studies naar longpathologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Consistente longfixatie onder constante druk pakt een kritieke uitdaging aan in preklinische modellen voor longaandoeningen door een reproduceerbare histologische evaluatie van emfyseem bij muizen mogelijk te maken. Deze methode ondersteunt een betrouwbare morfometrische analyse, waardoor de variabiliteit wordt verminderd en het voorspellend vertrouwen bij vroege target-validatie voor COPD-onderzoek wordt vergroot. De mogelijkheid om meerdere monsters gelijktijdig te verwerken stroomlijnt vergelijkende studies en ondersteunt robuuste beslissingen bij de triage van portfolio's.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt gestandaardiseerde morfometrische beoordeling van de ernst van emfyseem in muismodellen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van kandidaat-targets door reproduceerbare weefselarchitectuur te bieden.
- Faciliteert biologische risicoreductie door fixatie-geïnduceerde artefacten te minimaliseren.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het koppelen van histologische eindpunten aan mechanistische hypothesen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde longspecimens voor voor daaropvolgende kwantitatieve histologische analyses.
- Waarborgt de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen experimentele cohorten.
- Ondersteunt de schaalbare verwerking van meerdere monsters onder identieke omstandigheden.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van de effecten van verbindingen op de longstructuur mogelijk in screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische longpathologiemodellen uit met ziekte-relevante eindpunten voor translationele studies.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door standaardisatie van de weefselpreparatie.
- Vermindert het risico op artefacten die biomarker- of effectiviteitsbeoordelingen kunnen beïnvloeden.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van robuuste histologische gegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze fixatiemethode bij constante druk is geïntegreerd in het continuüm van vroege ontdekking en preklinische validatie, ter ondersteuning van zowel targetvalidatie als leadidentificatie in modellen voor respiratoire aandoeningen.
- Ontdekkingsbiologie: Biedt een betrouwbare weefselarchitectuur voor hypothesetesten en padanalyse in emfyseemmodellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve histologische resultaten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Maakt morfometrische metingen mogelijk, zoals de gemiddelde lineaire intercept en de destructie-index voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van preklinische bevindingen met de klinische emfyseempathologie waar relevant.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Biedt een gestandaardiseerde fixatiecapaciteit die aanpasbaar is voor diverse muismodellen van longziekten.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en de targetvalidatie door fixatievariabiliteit te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer en standaardisatie door gelijktijdige fixatie van meerdere monsters mogelijk te maken.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door robuuste histologische eindpunten te ondersteunen.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor respiratoire aandoeningen op basis van betrouwbare weefselgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in chirurgische procedures bij muizen en het behandelen van longweefsel.
- Vereist gespecialiseerde fixatieapparatuur die in staat is om een constante druk te handhaven.
- Vereist standaardisatie van fixatieparameters tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende fixatiemiddelen op basis van de experimentele vereisten.
- Moet voldoen aan veiligheidsprotocollen voor het omgaan met gevaarlijke fixatiemiddelen.
