Name: Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer hoe u schimmel- en plantmateriaal voorbereidt voor structurele analyse met DNP vaste-stof-NMR. Deze methode biedt atomaire resolutie in hun natuurlijke omgeving en ondersteunt onderzoek naar celwanden en antifungale therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation via NSF OIA-1833040. Het nationale laboratorium voor hoog magnetisch veld (NHMFL) wordt ondersteund door de National Science Foundation via het DMR-1157490 en de staat Florida. Het systeem van de MAS-DNP bij NHMFL wordt gedeeltelijk gefinancierd door de NIH S10 OD018519 en NSF CHE-1229170.

1. groei van 13C, 15N-geëtiketteerden Aspergillus fumigatus opgietvloeistof
<ol><li>Voorbereiding van labelloze en 13C, 15N-geëtiketteerden groeimedium Opmerking: Beide gist Extract pepton Dextrose medium (YPD) en de verbeterde minimaal middellange43 werden gebruikt voor het onderhoud van schimmel cultuur. Alle stappen na autoclaaf zijn uitgevoerd in een laminaire flow kap tot een minimum beperken van verontreiniging.<ol>
<li>Bereiding van labelloze vloeibaar medium: Los 6,5 g YPD poeder in 100 mL gedestilleerd water en vervolgens autoclaaf gedurende 25 minuten op 134 ° C.</li>
		<li>Bereiding van labelloze solide medium<ol>
<li>Voeg 1,5 g agar en 6,5 g YPD poeder in 100 mL gedestilleerd water.</li>
			<li>Autoclaaf het medium voor 25 min bij 121 ° C en vervolgens afkoelen tot ongeveer 50 ° C.</li>
			<li>Pipetteer van 13-15 mL van het medium in elke vooraf steriele kunststof petrischaal en betrekking hebben op de schotel met het gebruik van een deksel onmiddellijk.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voorbereiding van 13C, 15N-geëtiketteerden opgietvloeistof Opmerking: De groei oplossing om voor te bereiden isotoop etikettering, een minimale voedingsbodem met 13C-glucose en 15N-Natrium nitraat en een spoorelement oplossing zijn afzonderlijk bereid en dan gemengd vóór gebruik.<ol>
<li>Bereiden 100 mL van de isotoop-bevattende minimaal medium zoals vermeld in tabel 1. Breng de pH op 6.6 met NaOH (1 M) of zoutzuur (1M).</li>
			<li>Autoclaaf de minimale voedingsbodem voor 25 min bij 121 ° C.</li>
			<li>Bereiden van 100 mL (1, 000 x) ontbinden van sporenelementen oplossing, de zouten die zijn vermeld in tabel 2 in het gedestilleerd water. Autoclaaf de oplossing gedurende 25 minuten op 134 ° C. Afkoelen en bewaar de oplossing bij 4 ° C voor kortstondig gebruik. De pH zal ongeveer 6.5 en kan worden gecontroleerd met behulp van een pH-meter.</li>
			<li>Toevoegen van sporenelementen 0,1 mL tot 100 mL 13C, 15N-geëtiketteerden minimaal medium zoals vermeld in tabel 2 vóór gebruik.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Groei van de schimmel materialen<ol>
<li>Een kleine hoeveelheid schimmels overbrengen van de opslag op een bord van de YPD met behulp van een inoculating lus in een laminaire flow-kap. Houd de cultuur bij 30 ° C voor 2 dagen in een broedmachine.</li>
		<li>Gebruik een inoculating lus over te dragen van een actieve, groeiende schimmel rand voor de 13C,15N-labeling oplossing in een laminaire flow-kap. Houd de cultuur bij 30 ° C gedurende 3-5 dagen bij 220 rpm in een schudden incubator.</li>
		<li>Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 20 min. Verwijder het supernatant en verzamelen de pellet.</li>
		<li>Een pincet gebruiken voor het verzamelen van ~0.5 g van goed gehydrateerd pellet (> 50 wt % hydratatie) voor NMR studies. Verlies van hydratatie op enig moment zal de spectrale resolutie aanzienlijk verergeren. Opmerking: Indien nodig, een kleine hoeveelheid (0,1 g) de gehydrateerd mycelia kan worden gescheiden en volledig gedroogd onder N2 gasstroming in een kap of een lyophilizer de droge massa percentage berekenen te schatten van de hydratatie niveau. Meestal een pellet met ~0.3 g droge massa kan worden verkregen na 3 dagen. Als de NMR experiment plaatsvinden lang (> 7 dagen) en/of als de staat van de schimmels worden vastgesteld moet, de schimmel materiaal diep kan worden ingevroren in vloeibare N2 voor 10-20 min vóór verdere verwerking. Als het experiment korte zullen (3-6 dagen), de bevriezing kan worden overgeslagen zodat het monster verse kan blijven.</li>
		<li>Meng het overtollig materiaal met 20% (v/v) glycerol in een centrifugebuis en bewaar deze in een vriezer-80 ᵒC voor langdurige opslag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van A. fumigatus Solid-state NMR en DNP Studies
<ol><li>Voorbereiding van A. fumigatus voor Solid state NMR experimenten<ol>
<li>Dialyze de 13C, 15N-geëtiketteerden schimmel monster (stap 1.2.4.) tegen 1 L van 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) bij 4 ° C met behulp van een zak van de dialyse met een 3,5 kDa moleculair gewicht cutoff kleine moleculen verwijderd in het groeimedium voor een totale duur van 3 dagen. De buffer tweemaal dagelijks veranderen. Opmerking: U kunt ook het monster kan worden gewassen voor 6 - 10 keer met gedeïoniseerd water te verwijderen van de resterende kleine moleculen.</li>
		<li>Breng het monster in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 min (10.000 x g) met behulp van een benchtop centrifuge. Verwijder het supernatant en verzamelen van de resterende schimmel materialen.</li>
		<li>Pak van 70-80 mg van het uniform 13C-gelabeld en goed gehydrateerde monster plakken in een 4-mm ZrO2 rotor of 30-50 mg te 3.2 mm remschijven voor NMR experimenten. Herhaaldelijk knijp het voorzichtig met een metalen staaf monster en absorberen het overtollige water met behulp van papier.</li>
		<li>Strak cap van de rotor en invoegen van het monster in de spectrometer voor Solid state NMR karakterisering. Opmerking: De gloednieuwe rotors worden voorgesteld om te minimaliseren de mogelijkheid van rotor crash en proef van de lekkage in de NMR spectrometer. Indien nodig kan een wegwerp Kel-F invoegen met het afdichten van de schroeven worden gebruikt om te dienen als een secundaire container binnen de rotor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de monsters van de A. fumigatus voor DNP experimenten<ol>
<li>Voorbereiden op 100 µL van DNP oplosmiddelen29,44 (ook bekend als de DNP-matrix) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge 13C,15N-geëtiketteerden schimmel monsters. Deze DNP matrix bevat een mengsel van d8-glycerol/D2O/H2O (60/30/10 Vol %). Opmerking: Als labelloze monsters worden onderzocht, dan bereiden de DNP-matrix met 13C-verarmd d8-glycerol (12C3, 99,95%; D8, 98%) en D2O en H2O te vermijden 13C signaal bijdrage van de oplosmiddelen.</li>
		<li>Los 0.7 mg AMUPol45 in 100 µL van DNP oplosmiddelen op formulier 10 mM radicale stamoplossing. Vortex gedurende 2-3 minuten om ervoor te zorgen dat de radicalen volledig worden opgelost in de oplossing.</li>
		<li>Geniet van 10 mg van de dialyzed 13C, 15N-geëtiketteerden schimmel materialen zoals wordt beschreven in de voorafgaande stappen (stap 2.1.1 en 2.1.2) naar 50 µL van AMUPol oplossing, en mild vermalen het mengsel met behulp van een stamper en een mortier om te zorgen voor een penetratie van de radicalen in de poreuze celwanden. Opmerking: Verklein de snelheid van hydratatie verlies en het slijpen kan ook plaatsvinden in een buis van de microcentrifuge met behulp van een micropestle.</li>
		<li>Voeg een andere 30 µL van de radicale oplossing aan de gemalen pellet aan verdere hydraat het schimmel monster.</li>
		<li>De pellet in een sapphire rotor van 3.2 mm pak, knijp voorzichtig uit te drukken en verwijder het overtollige DNP oplosmiddel. Voeg een stekker 3.2-mm siliconen om te voorkomen dat het verlies van hydratatie. Meestal kan 5-30 mg van het monster worden verpakt aan de rotor. Het exacte bedrag moet worden bepaald door de eis van de gevoeligheid van de NMR experimenten te worden uitgevoerd.</li>
		<li>Invoegen en spin van het monster in een DNP spectrometer, meet een spectrum van DNP-enhanced onder magnetron bestraling en vergelijk het met het spectrum magnetron-off. Dit zal leiden tot een verhoging van de factor εaan/uit, die 20-40 voor deze complexe materialen moeten worden. Voer de ontworpen experimenten om te bepalen van de structuur van de celwand.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bereiding van plantaardige biomassa NMR en DNP Studies
<ol><li>Voorbereiding van plantaardig materiaal voor Solid state NMR<ol>
<li>Produceren van uniform 13C-gelabeld planten in-house met behulp van 13CO2 leveringen in een kamer of 13C-glucose groeimedium zoals eerder beschreven46,47 of rechtstreeks kopen gelabelde materialen uit isotoop-labeling bedrijven. Opmerking: 13C-glucose kan alleen worden gebruikt in donkere groei om te voorkomen dat de invoering van 12C door fotosynthese.</li>
		<li>Snijd de uniform 13C label plantaardig materiaal in kleine stukjes (meestal 1-2 mm in afmeting) met behulp van een scheermesje laboratorium. Opmerking: Afhankelijk van het doel, de uitgepakte celwanden worden soms gebruikt voor structurele karakterisering en de gedetailleerde protocollen worden gemeld in vorige studies21,46.</li>
		<li>Als het monster was vooraf gedroogd, 100 ÂµL van water toevoegen tot 30 mg van plantaardig materiaal in een 1,5 mL microcentrifuge buis, vortex, equilibreer bij kamertemperatuur gedurende 1 dag. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het overtollige water met behulp van een precisiepipet.</li>
		<li>Als het monster nooit gedroogd op elk moment was, direct gebruik te maken van het monster zonder verdere behandeling.</li>
		<li>Pak de resulterende plantaardig materiaal in 3.2- of 4-mm ZrO2 rotoren voor Solid state NMR experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van plantaardig materiaal voor DNP studies<ol>
<li>Bereiden 60 µL stockoplossing van 10 mM AMUPol radicaal als beschreven stappen 2.2.1 en 2.2.2.</li>
		<li>Snijd de uniform 13C label plantaardig materiaal in kleine stukjes (1-2 mm in afmeting) worden bestudeerd met behulp van een scheermesje laboratorium en weeg 20 mg van het plantaardig materiaal.</li>
		<li>Hand-grind de plant stukken in kleine deeltjes (~ 1-2 mm in grootte) met behulp van een mortier en een stamper. De definitieve poeders hebben een homogene uitstraling.</li>
		<li>Voeg 40 µL van de stockoplossing van DNP voorbereid in de voorgaande stap (2.2.2) aan het plantmateriaal en mild voor 5 min om homogeen mengen met de radicale slijpen.</li>
		<li>Voeg een ander 20 µL van de stockoplossing om verder het plantmateriaal hydrateren na fijnmaken.</li>
		<li>Pak de plant geëquilibreerd monster in een 3.2-mm saffier rotor voor DNP experimenten. Steek de stekker van een siliconen om te voorkomen dat het verlies van hydratatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. standaard solid state NMR experimenten voor eerste karakterisering van koolhydraat-rijke biomaterialen
Opmerking: Een kort overzicht van de NMR experimenten vindt u in deze sectie. Structurele opheldering vereist echter meestal een uitgebreide expertise. Gezamenlijke inspanningen met NMR spectroscopists wordt daarom aangeraden.
<ol><li>Maatregel 1D 13C Cross polarisatie (CP), 13C directe polarisatie (DP) met 2-s en 35-s recycle vertragingen, en 1H -13C ONBEHOLPEN48,49 spectra te verkrijgen van een algemeen begrip van de dynamische distributie van celbestanddelen (Figuur 1a). De celwanden zijn meestal het relatief rigide gedeelte en dominante signalen in het spectrum van CP vertonen.</li>
	<li>Een reeks standaard 2D 13C -13C correlatie experimenten voor resonantie toewijzingen van 13C signalen meten. Beginnen met heroriëntatie onvoldoende50,51 te verkrijgen van koolstof connectiviteit, die moet worden bijgestaan door een reeks van door-ruimte-experimenten zoals 1.5-ms RFDR52 (Figuur 1b) en 50-ms SNOER/DARR53 experimenten. Opmerking: Als het is van belang voor het vinden van een monster rijk in een bepaald onderdeel, bijvoorbeeld de primaire of secundaire celwanden, meerdere segmenten of meerdere planten kunnen moet afzonderlijk worden gemeten om te zoeken naar het monster met de optimale samenstelling.</li>
	<li>Uitvoering van 2D 15N -13C correlatie experimenten die ter vergemakkelijking van de toewijzingen van de resonantie van eiwitten en koolhydraten nitrogenated kunnen worden gemeten. Opmerking: De toewijzing van resonantie is meestal tijdrovend. Momenteel wordt een methode ontwikkeld om de toewijzing van de resonantie van koolhydraten signalen voor die wetenschappers zonder voorafgaande ervaring.</li>
	<li>Meten van meer gespecialiseerde experimenten om de ruimtelijke proximities (Figuur 1 c, d), hydratatie en mobiliteiten van complexe biomoleculen om te bepalen van de driedimensionale structuur van de koolhydraat-rijke materialen als te bepalen eerder beschreven systematisch22,29.</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Vergeleken met de biochemische methoden, heeft Solid state NMR voordelen als een niet-destructieve en hoge resolutie techniek. NMR is ook kwantitatieve samenstelling analyse, en in tegenstelling tot de meeste andere analytische methoden, doet niet hebben de onzekerheden ingevoerd door de beperkte oplosbaarheid van biopolymeren. Oprichting van het huidige protocol vergemakkelijkt toekomstige studies op koolhydraat-rijke biomaterialen en matiemaatschappij polymeren. Echter moet worden opgemerkt dat de resonantie-toewijzing...

Koolhydraten spelen een centrale rol in verschillende biologische processen zoals energieopslag, structurele gebouw, en cellulaire erkenning en hechting. Ze zijn verrijkt in de celwand, die is een fundamentele component in planten, schimmels, algen en bacteriën1,2,3. De celwand fungeert als een centrale bron voor de productie van biobrandstof en biomaterialen, evenals een veelbelovende doelgroep voor antimicrobiële therapie4,5,6,7,8 , 9.
Het moderne begrip van deze complexe materialen heeft aanzienlijk door decennia van inspanningen die werden gewijd aan de structurele karakterisering met behulp van vier belangrijke biochemische of genetische methoden naar voren geschoven. De eerste belangrijke methode berust op opeenvolgende behandelingen met behulp van agressieve chemicaliën of enzymen te breken de celwanden in verschillende delen, die wordt gevolgd door de samenstelling en analyse van de koppeling van suikers in elke fractie10. Deze methode werpt licht op het domein distributie van polymeren kan, maar de interpretatie misleidend zijn als gevolg van de chemische en fysische eigenschappen van biomoleculen. Bijvoorbeeld, is het moeilijk om te bepalen of de alkali-extraheerbare fractie afkomstig uit één domein van minder strak gestructureerde moleculen of ruimtelijk gescheiden moleculen met vergelijkbare oplosbaarheid is. Ten tweede, de uitgepakte gedeelten of hele celwanden kan ook worden gemeten met behulp van oplossing NMR om te bepalen van de covalente verbanden, ook aangeduid als crosslinking, tussen verschillende moleculen11,12,13, 14,15. Op deze manier de gedetailleerde structuur van covalente ankers gesondeerd kon worden, maar beperkingen kunnen bestaan als gevolg van de lage oplosbaarheid van polysacchariden, het relatief kleine aantal crosslinking sites en de onwetendheid van de niet-covalente effecten die stabiliseert polysaccharide verpakking, met inbegrip van de waterstof-bonding, van der Waals force, elektrostatische interactie en polymeer entanglement. Ten derde, de bindende affiniteit is vastbesloten in vitro met behulp van geïsoleerde polysacchariden16,17,18,19, maar de reiniging procedures kunnen ingrijpend wordt gewijzigd de structuur en eigenschappen van deze biomoleculen. Deze methode mislukt ook de geavanceerde afzetting en assemblage van macromoleculen na biosynthese wilt repliceren. Ten slotte het fenotype, cel morfologie en mechanische eigenschappen van genetische mutanten met verzwakte productie van bepaalde celwand component werpen licht op de structurele functies van polysacchariden, maar meer moleculaire bewijs is nodig om deze brug macroscopische waarnemingen met de gemodificeerde functie van eiwit machineries20.
Recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van de multidimensionale Solid state NMR spectroscopie hebben ingevoerd een unieke gelegenheid om deze structurele puzzels op te lossen. 2D/3D solid state NMR experimenten inschakelen met een hoge resolutie onderzoek naar de samenstelling en architectuur van koolhydraat-rijke materialen in de geboortestaat zonder grote perturbation. Structurele studies zijn met succes uitgevoerd op zowel de primaire als de secundaire celwanden van planten, de catalytically behandelde biomassa, bacteriële biofilm, het pigment geesten in schimmels en, onlangs door de auteurs, de intact celwanden in een pathogene schimmel Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. de ontwikkeling van dynamische nucleaire polarisatie (DNP)32,33,34,35,,36,,37,38 , 39 , 40 , 41 , NMR structurele opheldering vergemakkelijkt 42 aanzienlijk als de verhoging van de gevoeligheid door DNP aanzienlijk de experimentele tijd op deze complexe biomaterialen verkort. Het protocol hier beschreven details over de procedures voor de schimmel A. fumigatus isotoop-labeling en voorbereiden van schimmel en plant monsters voor Solid state NMR en DNP karakterisering. Soortgelijke labeling procedures gelden andere schimmels met gewijzigde medium, en de monsterbereidingsprocedures gelden over het algemeen andere koolhydraatrijke biomaterialen.

<table><tbody><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Analytical weighing balance</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Model PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>BDH9222</td><td>bewaar bij 15-30 &deg;C</td></tr><tr><td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td><td>Honeywell|Fluka</td><td>60820</td><td>&ge;98 %</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge;98 %</td></tr><tr><td>Corning LSE shaking incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99.9 atom % D</td></tr><tr><td>d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99.9 atom % D</td></tr><tr><td>d8-glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge;99 atom % D</td></tr><tr><td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Dipotassium Phosphate</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge;98 %</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge;99.5 %</td></tr><tr><td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Maximum RCF 25,830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge;99+ %</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>bewaar bij 18-26 &deg;C</td></tr><tr><td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge;99 %</td></tr><tr><td>Monopotassium Phosphate</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge;99 %</td></tr><tr><td>pH Meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge;99.5 %</td></tr><tr><td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge;98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-glycerol</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-glucose</td><td>Sigma Alrdrich</td><td>364606</td><td>&ge;99 % (CP)</td></tr><tr><td>15N-sodium nitrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge;98 % 15N, &ge;99 (cp)</td></tr><tr><td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3.2 mm Silicone plug</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4 mm MAS Rotor Kit</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zirconia</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie solid state nmr

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Dit protocol laat zien hoe uniform 13C, 15N-geëtiketteerden schimmel materialen kunnen worden geproduceerd en hoe deze zachte materialen moeten worden voorafgegaan voor Solid state NMR en gevoeligheid-enhanced DNP experimenten. De monster veredeling van plantaardige biomassa is ook gedetailleerd. Met deze methode kan de meting van een reeks van 1D en 2D 13C -13C /15N correlaties spectra, waarmee de hoge resolutie structurele opheldering van complexe biomaterialen in hun oorspronkelijke staat, met minimale verstoring. De isotoop-labeling kan door het kwantificeren van de intensiteit in 1D spectra en het spuitrendement polarisatie in 2D correlatie spectra worden onderzocht. Het succes van de bereiding van de monsters van de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) kan worden geëvalueerd door de factor van de verhoging van de gevoeligheid. Verdere experimenten onderzoeken de structurele aspecten van de polysacchariden en eiwitten zal leiden tot een model van de driedimensionale architectuur. Deze methoden kunnen worden gewijzigd en aangepast om te onderzoeken van een breed scala van koolhydraat-rijke materialen, met inbegrip van de natuurlijke celwanden van planten, schimmels, algen en bacteriën, evenals gesynthetiseerd of ontworpen koolhydraten polymeren en hun complex met andere moleculen.

De isotoop labeling aanzienlijk verbetert de gevoeligheid van de NMR en maakt het mogelijk voor het meten van een reeks 2D 13C -13C en 13C -15N correlatie spectra voor het analyseren van de samenstelling, hydratatie, mobiliteit en verpakking van polymeren, die zal worden geïntegreerd om te bouwen van een driedimensionaal model van de celwand het platform (Figuur 1). Als de uniforme etikettering slaagt, moet een comp...

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Dit protocol kan worden gebruikt om schimmel- en plantenmaterialen voor te bereiden op vaste nucleaire magnetische resonantie, of NMR, en dynamische nucleaire polarisatie, of DNP, experimenten voor complexe biosysteemkarakterisering. Deze techniek stelt ons in staat om biomaterialen te onderzoeken tot een atomair resolutieniveau in hun eigen omgeving, bijvoorbeeld in hele cellen. De verwerving van structurele informatie over schimmelmaterialen met hoge resolutie zal helpen bij de ontwikkeling van schimmeldodende geneesmiddelen.De methode geeft inzicht in de samenstelling en structuur van complexe koolhydraten in schimmelcelwanden en kan worden toegepast op vele koolhydraatrijke organismen, waaronder planten, schimmels, algen en bacteriën. Sommige onderzoekers kunnen worstelen met schimmelverontreiniging in hun cellulaire culturen. Mijn advies is om het medium en de apparatuur grondig te steriliseren voor gebruik om deze besmetting te voorkomen.Deze demonstratie zal onderzoekers met weinig ervaring in NMR of celcultuur helpen om te leren hoe deze technieken in schimmel- en installatiesystemen te implementeren. Om ongelabeld vloeibaar groeimedium voor te bereiden, los 6,5 gram gistextract peptone dextrose of YPD-poeder op in 100 milliliter gedestilleerd water en vervolgens de resulterende oplossing gedurende 25 minuten bij 134 graden Celsius. Om ongelabeld vast groeimedium voor te bereiden, voeg 6,5 gram YPD agarpoeder toe aan 100 milliliter gedestilleerd water en autoclave het medium gedurende 25 minuten bij 121 graden Celsius, voordat het medium afkoelt tot ongeveer 50 graden Celsius.Breng vervolgens 13 tot 15 milliliter van het gesmolten vaste groeimedium over in individuele steriele plastic petrischaaltjes en plaats de deksels onmiddellijk op de borden. Voor de bereiding van koolstof-13, stikstof-15-gelabelde vloeibare groeimedium, past u een volume van 100 milliliter aan isotoopbevattend minimaal medium aan een pH van 6,6 met zuur of basis indien nodig. Los vervolgens de in de tabel vermelde zouten op in 100 milliliter gedestilleerd water, voeg toe aan het koolstof-13, stikstof-15-label vloeibare groeimedium en beklad de resulterende oplossing gedurende 25 minuten bij 121 graden Celsius.Wanneer de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg 100 microliter spoorelementen oplossing aan het gehele volume van koolstof-13, stikstof-15-gelabelde minimale medium. Om de schimmelmaterialen te kweken, gebruikt u een inentrentlus om een kleine hoeveelheid schimmels uit opslag over te brengen op een YPD-plaat en de schimmel twee dagen lang te kweken in een couveuse van 30 graden Celsius. Gebruik aan het einde van de incubatie een nieuwe inentingslus om een actieve groeiende schimmelrand over te brengen naar het koolstof-13, stikstof-15-label vloeibare groeimedium, en plaats de cultuur op 30 graden Celsius en 220 rotaties per minuut gedurende drie tot vijf dagen in een schuddende incubator.Wanneer grote hoeveelheden van de schimmel de kolfbodem bedekken en in de vloeistof zweven, verzamel je de schimmels door centrifugatie en gooi je de supernatant weg. Hydrateer de pellet met een geschikte oplossing en gebruik tangen om ongeveer 0,5 gram van de goed gehydrateerde pellet te verzamelen voor NMR- en DNP-analyses. Meng vervolgens het resterende materiaal met een 20%glyceroloplossing in een conische buis en plaats het schimmelmonster op min 80 graden Celsius voor langdurige opslag.Om de A.fumigatus voor te bereiden op de NMR-analyse met vaste toestand, gebruikt u eerst een dialysezak met een 3,5 kilodalton moleculair gewichtsafsnede om de 0,5-gram koolstof-13, stikstof-15-gelabelde schimmelmonster te dialyseren tegen een liter fosfaatbuffer van 10 millimolar bij vier graden Celsius gedurende drie dagen om kleine moleculen uit het groeimedium te verwijderen. Breng het monster aan het einde van de dialyse over in een buis van 15 milliliter voor centrifugatie en verpak 70 tot 80 milligram van de gelijkmatig koolstof-13-gelabelde en goed gehydrateerde monsterpasta in een vier millimeter zirconiumdioxidetortor. Gebruik een metalen staaf om voorzichtig en herhaaldelijk knijp het monster, met behulp van papier om het overtollige water te absorberen.Sluit de rotor vervolgens stevig vast en plaats het monster in de spectrometer voor vaste NMR-karakterisering. Om de A.fumigatus voor te bereiden op DNP-analyse, voeg 100 microliters DNP-matrix toe in één 1,5-milliliter microcentrifugebuis per koolstof-13, koolstof-15-gelabeld schimmelmonster en los 0,7 milligram polarisatiemiddel op aan elke buis om een 10-millimolar radicale voorraadoplossing te vormen. Na twee tot drie minuten vortexen om ervoor te zorgen dat radicalen volledig zijn opgelost in de oplossing, weken 10 milligram gedialyseerde koolstof-13, stikstof-15-label schimmelmonster in 50 microliter van de polariserende agent oplossing, en gebruik een stamper en een mortel om het mengsel licht te malen om penetratie van de radicalen in de poreuze celwanden te garanderen.Voeg nog eens 30 microliters van de radicale oplossing toe aan de grondpellet om het schimmelmonster verder te hydrateren en pak de pellet in een saffierrotor van 3,2 millimeter. Knijp mild en verwijder het overtollige DNP-oplosmiddel zoals aangetoond, en voeg een siliconenplug van 3,2 millimeter toe om het verlies van hydratatie te voorkomen. Voeg vervolgens de rotor toe aan een NMR-spectrometer voor routine-experiment of een DNP-spectrometer voor het meten van het door DNP verbeterde spectrum onder microgolfbestraling.Om plantaardige materialen voor te bereiden op DNP-studies, gebruikt u een scheermesje om het gelijkmatige koolstof-13-gelabelde plantmateriaal in stukken van één tot twee millimeter te snijden. Gebruik een mortier en stamper om de stukken te malen in kleinere deeltjes tot het uiteindelijke poeder een homogene uitstraling heeft. Voeg 40 microliter van 10-millimolar radicale voorraad oplossing aan het plantmateriaal, en licht malen het monster voor een extra vijf minuten om homogene mengen met de radicale te garanderen.Hydrateer het grondmonster met nog eens 20 microliters radicale voorraadoplossing en verpak het geëquilibreerde plantenmonster in een saffierrotor van 3,2 millimeter voor DNP-analyse. Steek vervolgens een siliconenplug in om het verlies van hydratatie te voorkomen en laad het monster op de DNP-spectrofotometer. Isotopenetikettering verbetert de NMR-gevoeligheid aanzienlijk en maakt het mogelijk om een reeks tweedimensionale koolstof-13-koolstof-13 en koolstof-13-stikstof-15 correlatiespectra te meten om de samenstelling, hydratatie, mobiliteit en verpakking van de polymeren te analyseren voor hun integratie voor de bouw van een driedimensionaal model van celwandarchitectuur.Als off-diagonale signalen zijn moeilijk te verkrijgen in de 2D carbon-13-carbon-13 spectrum, statistische etikettering zou kunnen hebben plaatsgevonden. De twee koolstof-13 pieken op 96 en 92 delen per miljoen zijn handtekening koolstof-1 signalen van glucose. Daarom is hun sterke intensiteiten in de kwantitatieve koolstof-13 directe polarisatie spectra gemeten met lange recycle vertragingen van 35 seconden meestal wijzen op de dominantie van kleine moleculen als gevolg van onvolledige dialyse of wassen.Met goed gelabelde monsters kunnen correlaties over lange afstand verder worden gemeten om de ruimtelijke nabijheid van biomoleculen te detecteren en een structureel model van de intacte celwanden te construeren. Deze techniek maakt het mogelijk structuurfunctie in veel natuurlijk voorkomende en gemanipuleerde materialen te verkennen, waardoor toekomstige studies van koolhydraatrijke biomaterialen en gefunctionaliseerde polymeren worden vergemakkelijkt. Aangezien sommige schimmels infectie of systematische ziekten bij de mens kunnen veroorzaken, moet u schimmelmaterialen in een laminaire stroomkap behandelen voor bescherming en om blootstelling te minimaliseren.

preparation-fungal-plant-materials-for-structural-elucidation-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Antenne-installaties organen zijn beschermd door de cuticula, een supramoleculaire biopolyester-wax montage. We presenteren protocollen bij selectieve verwijdering van epi-en intracuticular was van tomaat fruit nagelriemen op moleculaire en microniveau door solid-state NMR en atomic force microscopie, respectievelijk te controleren, en om de verknoping capaciteit van gemanipuleerde cuticulair biopolyesters te beoordelen.

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

De gevoeligheidsverbetering die wordt geboden door oplossingsdynamische nucleaire polarisatie (DNP) maakt het mogelijk metabolische processen in realtime te volgen door NMR en MRI. De kenmerken en prestaties van een specifiek oplossings-DNP-setup dat is ontworpen voor het bestuderen van enzymatische reacties worden besproken.

Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van het reducerende einde (RE) en de interne glycosylsequenties van heteroxylanen door het RE te labelen met 2-aminobenzamide voorafgaand aan enzymatische (endoxylanase) hydrolyse en vervolgens analyse van de resulterende oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR).

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor cryogene overdracht van bevroren monsters in de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) magic angle spinning (MAS) nucleaire magnetische resonantie (NMR) sonde. Het protocol bevat aanwijzingen voor rotoropslag voorafgaand aan het experiment en aanwijzingen voor levensvatbaarheidsmetingen voor en na het experiment.

Cryogene monster laden in een magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectrometer die cellulaire levensvatbaarheid behoudt

31 P NMR is een krachtig hulpmiddel voor de structurele opheldering van polyfenolen. Deze snelle, eenvoudige, nauwkeurige, kwantitatieve en zeer reproduceerbare analyseprocedure, die de kwantificering en differentiatie van de verschillende soorten hydroxy-, fenol- en carbonlgroepen in lignines en tannines mogelijk maakt, is nu een routinematig analytisch hulpmiddel geworden.

Kwantitatieve 31P NMR-analyse van lignines en tannines

Dit artikel presenteert het gebruik van PSYCHE en SAPPHIRE-PSYCHE bij de metabole profilering van planten en bevat gedetailleerde procedures voor monstervoorbereiding en optimale Pure Shift NMR-spectraregistratie. Er worden voorbeelden besproken waarmee de resolutiewinst die wordt bereikt door homonucleaire ontkoppeling een uitgebreider begrip van het systeem mogelijk maakt.

Pure Shift nucleaire magnetische resonantie: een nieuw hulpmiddel voor plantmetabolomics

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Leer hoe u schimmel- en plantmateriaal voorbereidt voor structurele analyse met DNP vaste-stof-NMR. Deze methode biedt atomaire resolutie in hun natuurlijke omgeving en ondersteunt onderzoek naar celwanden en antifungale therapieën.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Meer video's verkennen