Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Dit protocol kan worden gebruikt om schimmel- en plantenmaterialen voor te bereiden op vaste nucleaire magnetische resonantie, of NMR, en dynamische nucleaire polarisatie, of DNP, experimenten voor complexe biosysteemkarakterisering. Deze techniek stelt ons in staat om biomaterialen te onderzoeken tot een atomair resolutieniveau in hun eigen omgeving, bijvoorbeeld in hele cellen. De verwerving van structurele informatie over schimmelmaterialen met hoge resolutie zal helpen bij de ontwikkeling van schimmeldodende geneesmiddelen.

De methode geeft inzicht in de samenstelling en structuur van complexe koolhydraten in schimmelcelwanden en kan worden toegepast op vele koolhydraatrijke organismen, waaronder planten, schimmels, algen en bacteriën. Sommige onderzoekers kunnen worstelen met schimmelverontreiniging in hun cellulaire culturen. Mijn advies is om het medium en de apparatuur grondig te steriliseren voor gebruik om deze besmetting te voorkomen.

Deze demonstratie zal onderzoekers met weinig ervaring in NMR of celcultuur helpen om te leren hoe deze technieken in schimmel- en installatiesystemen te implementeren. Om ongelabeld vloeibaar groeimedium voor te bereiden, los 6,5 gram gistextract peptone dextrose of YPD-poeder op in 100 milliliter gedestilleerd water en vervolgens de resulterende oplossing gedurende 25 minuten bij 134 graden Celsius. Om ongelabeld vast groeimedium voor te bereiden, voeg 6,5 gram YPD agarpoeder toe aan 100 milliliter gedestilleerd water en autoclave het medium gedurende 25 minuten bij 121 graden Celsius, voordat het medium afkoelt tot ongeveer 50 graden Celsius.

Breng vervolgens 13 tot 15 milliliter van het gesmolten vaste groeimedium over in individuele steriele plastic petrischaaltjes en plaats de deksels onmiddellijk op de borden. Voor de bereiding van koolstof-13, stikstof-15-gelabelde vloeibare groeimedium, past u een volume van 100 milliliter aan isotoopbevattend minimaal medium aan een pH van 6,6 met zuur of basis indien nodig. Los vervolgens de in de tabel vermelde zouten op in 100 milliliter gedestilleerd water, voeg toe aan het koolstof-13, stikstof-15-label vloeibare groeimedium en beklad de resulterende oplossing gedurende 25 minuten bij 121 graden Celsius.

Wanneer de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg 100 microliter spoorelementen oplossing aan het gehele volume van koolstof-13, stikstof-15-gelabelde minimale medium. Om de schimmelmaterialen te kweken, gebruikt u een inentrentlus om een kleine hoeveelheid schimmels uit opslag over te brengen op een YPD-plaat en de schimmel twee dagen lang te kweken in een couveuse van 30 graden Celsius. Gebruik aan het einde van de incubatie een nieuwe inentingslus om een actieve groeiende schimmelrand over te brengen naar het koolstof-13, stikstof-15-label vloeibare groeimedium, en plaats de cultuur op 30 graden Celsius en 220 rotaties per minuut gedurende drie tot vijf dagen in een schuddende incubator.

Wanneer grote hoeveelheden van de schimmel de kolfbodem bedekken en in de vloeistof zweven, verzamel je de schimmels door centrifugatie en gooi je de supernatant weg. Hydrateer de pellet met een geschikte oplossing en gebruik tangen om ongeveer 0,5 gram van de goed gehydrateerde pellet te verzamelen voor NMR- en DNP-analyses. Meng vervolgens het resterende materiaal met een 20%glyceroloplossing in een conische buis en plaats het schimmelmonster op min 80 graden Celsius voor langdurige opslag.

Om de A.fumigatus voor te bereiden op de NMR-analyse met vaste toestand, gebruikt u eerst een dialysezak met een 3,5 kilodalton moleculair gewichtsafsnede om de 0,5-gram koolstof-13, stikstof-15-gelabelde schimmelmonster te dialyseren tegen een liter fosfaatbuffer van 10 millimolar bij vier graden Celsius gedurende drie dagen om kleine moleculen uit het groeimedium te verwijderen. Breng het monster aan het einde van de dialyse over in een buis van 15 milliliter voor centrifugatie en verpak 70 tot 80 milligram van de gelijkmatig koolstof-13-gelabelde en goed gehydrateerde monsterpasta in een vier millimeter zirconiumdioxidetortor. Gebruik een metalen staaf om voorzichtig en herhaaldelijk knijp het monster, met behulp van papier om het overtollige water te absorberen.

Sluit de rotor vervolgens stevig vast en plaats het monster in de spectrometer voor vaste NMR-karakterisering. Om de A.fumigatus voor te bereiden op DNP-analyse, voeg 100 microliters DNP-matrix toe in één 1,5-milliliter microcentrifugebuis per koolstof-13, koolstof-15-gelabeld schimmelmonster en los 0,7 milligram polarisatiemiddel op aan elke buis om een 10-millimolar radicale voorraadoplossing te vormen. Na twee tot drie minuten vortexen om ervoor te zorgen dat radicalen volledig zijn opgelost in de oplossing, weken 10 milligram gedialyseerde koolstof-13, stikstof-15-label schimmelmonster in 50 microliter van de polariserende agent oplossing, en gebruik een stamper en een mortel om het mengsel licht te malen om penetratie van de radicalen in de poreuze celwanden te garanderen.

Voeg nog eens 30 microliters van de radicale oplossing toe aan de grondpellet om het schimmelmonster verder te hydrateren en pak de pellet in een saffierrotor van 3,2 millimeter. Knijp mild en verwijder het overtollige DNP-oplosmiddel zoals aangetoond, en voeg een siliconenplug van 3,2 millimeter toe om het verlies van hydratatie te voorkomen. Voeg vervolgens de rotor toe aan een NMR-spectrometer voor routine-experiment of een DNP-spectrometer voor het meten van het door DNP verbeterde spectrum onder microgolfbestraling.

Om plantaardige materialen voor te bereiden op DNP-studies, gebruikt u een scheermesje om het gelijkmatige koolstof-13-gelabelde plantmateriaal in stukken van één tot twee millimeter te snijden. Gebruik een mortier en stamper om de stukken te malen in kleinere deeltjes tot het uiteindelijke poeder een homogene uitstraling heeft. Voeg 40 microliter van 10-millimolar radicale voorraad oplossing aan het plantmateriaal, en licht malen het monster voor een extra vijf minuten om homogene mengen met de radicale te garanderen.

Hydrateer het grondmonster met nog eens 20 microliters radicale voorraadoplossing en verpak het geëquilibreerde plantenmonster in een saffierrotor van 3,2 millimeter voor DNP-analyse. Steek vervolgens een siliconenplug in om het verlies van hydratatie te voorkomen en laad het monster op de DNP-spectrofotometer. Isotopenetikettering verbetert de NMR-gevoeligheid aanzienlijk en maakt het mogelijk om een reeks tweedimensionale koolstof-13-koolstof-13 en koolstof-13-stikstof-15 correlatiespectra te meten om de samenstelling, hydratatie, mobiliteit en verpakking van de polymeren te analyseren voor hun integratie voor de bouw van een driedimensionaal model van celwandarchitectuur.

Als off-diagonale signalen zijn moeilijk te verkrijgen in de 2D carbon-13-carbon-13 spectrum, statistische etikettering zou kunnen hebben plaatsgevonden. De twee koolstof-13 pieken op 96 en 92 delen per miljoen zijn handtekening koolstof-1 signalen van glucose. Daarom is hun sterke intensiteiten in de kwantitatieve koolstof-13 directe polarisatie spectra gemeten met lange recycle vertragingen van 35 seconden meestal wijzen op de dominantie van kleine moleculen als gevolg van onvolledige dialyse of wassen.

Met goed gelabelde monsters kunnen correlaties over lange afstand verder worden gemeten om de ruimtelijke nabijheid van biomoleculen te detecteren en een structureel model van de intacte celwanden te construeren. Deze techniek maakt het mogelijk structuurfunctie in veel natuurlijk voorkomende en gemanipuleerde materialen te verkennen, waardoor toekomstige studies van koolhydraatrijke biomaterialen en gefunctionaliseerde polymeren worden vergemakkelijkt. Aangezien sommige schimmels infectie of systematische ziekten bij de mens kunnen veroorzaken, moet u schimmelmaterialen in een laminaire stroomkap behandelen voor bescherming en om blootstelling te minimaliseren.