Name: Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer hoe je een oraal vaccin tegen diabetes type 1 produceert met behulp van transiënte expressie in rode biet. Deze plantaardige methode biedt een schaalbaar alternatief voor conventionele vaccinatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke Project "Het gebruik van planten voor de productie van een auto-immuunziekte diabetes eetbare vaccin (eDIVA)" (Project-ID: 891854) door de Universiteit van Verona, in het kader van de oproep 2014 gefinancierd.

<ol><li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+The+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li>
<li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li>
<li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases%3A+Where+are+we%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).</li>
<li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li>
<li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pediatric+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li>
<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li>
<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
<li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li>
<li>Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015).</li>
<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li>
<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie toonden we voorlopige analyse voor het ontwerp van een kandidaat-orale vaccin voor auto-immuunziekte diabetes. De proteïne van de doelgroep voor dit experiment was een gemuteerde vorm van het menselijke 65 kDa glutamaat Decarboxylase, welke productie en functionaliteit zijn dan gemakkelijk waarneembare en meetbare12. De expressie in de weefsels van verschillende eetbare plant was gemedieerd door de vectoren5, die een hoog niveau van de productie van recombina...

Sinds de plant moleculaire biologie revolutie in de jaren 1980, kunnen plant gebaseerde systemen voor de productie van biofarmaceutica worden beschouwd als een alternatief voor traditionele systemen gebaseerd op microbiële en zoogdieren cellen1. Planten display verscheidene voordelen over traditionele platformen, met schaalbaarheid, kosteneffectiviteit en veiligheid wordt de meest relevante2. De recombinante product kan worden gezuiverd van getransformeerde plant weefsel en vervolgens beheerd, ofwel parenteraal of mondeling en, bovendien, getransformeerde eetbare plant direct voor mondelinge levering kan worden gebruikt. Orale toediening bevordert tegelijkertijd mucosal en systemische immuniteit, en het elimineert de noodzaak voor naalden en gespecialiseerde medisch personeel. Bovendien elimineert mondelinge levering de complexe downstream processing, die normaal goed is voor 80% van de totale productiekosten van een recombinant eiwit3. Al deze voordelen kunnen worden vertaald in besparingen in leveringen, productie en arbeid reduceert de kosten van elke dosis, waardoor de drug betaalbaar voor de meeste van de wereldbevolking.
Verschillende strategieën, zowel voor stabiele transformatie en voorbijgaande expressie, werden ontwikkeld voor de productie van recombinante eiwitten in planten. Onder hen biedt een hoog rendement gedeconstrueerd plant virus gebaseerde expressie systeem (bijvoorbeeld magnICON) superieure prestaties leidt hoge opbrengsten van recombinante eiwitten over relatief korte tijdschalen4. Vele voorbeelden van voorbijgaande expressie met behulp van de plant virus gebaseerde expressie systeem in Nicotiana benthamiana planten worden gerapporteerd, wordt de goudstandaard productie host. Deze plant model wordt echter niet beschouwd als een eetbare soorten als gevolg van de alkaloïden en andere giftige metabolieten die zijn verzameld in zijn bladeren.
In dit werk, beschrijven we de vergelijking tussen twee eetbare plant systemen, rode biet (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (oleracea Spinacea cv Industria), voor de expressie van twee kandidaat-vormen van de isovorm 65 kDa van glutaminezuur decarboxylase (GAD65), uitgevoerd door de plant virus gebaseerde vectoren5. GAD65 is een grote autoantigen geassocieerd met Type 1 Diabetes (T1D) en het wordt momenteel onderzocht in klinische testen te voorkomen of vertragen T1D door inducerende tolerantie6. De productie van GAD65 in planten is uitgebreid onderzocht bij model plantensoorten als Nicotiana tabacum en N. benthamiana4,5,6,7. Hier beschrijven we het gebruik van eetbare planten voor de productie van de molecule in weefsels die kunnen worden bedoeld voor een mondelinge bericht direct te bezorgen. Vanuit een technisch oogpunt, we onderzocht en geselecteerd van het systeem voor agroinfiltration van de plant en de eetbare plant-platform voor de productie van GAD65 met een evaluatie van verschillende parameters: de recombinant eiwit expressie niveaus, de resterende microbiële lading in plant weefsels bedoeld voor mondelinge levering, de weerstand van GAD65 naar de maag spijsvertering, en de biologische equivalentie van de getransformeerde planten met de wild-type.

<table><tbody><tr><td>0.2-&mu;m Minisart RC4 membraanfilters</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash;mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Toxisch; 4 % om laadbuffer met glycerol, SDS en Tris-HCl te maken</td></tr><tr><td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>96-wellsplaat</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>Corrosief</td></tr><tr><td>Acetonitrile LC-MS kwaliteit</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Toxisch &ndash; 0.1 M stock in DMSO</td></tr><tr><td>Agar Bacteriologisch Kwaliteit</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>15 g/L om LB medium (pH 7.5 met NaOH) met Gistextract, NaCl en Tryptone te maken</td></tr><tr><td>Ammoniumformiaat</td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP antilichaam</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD 65/67 antilichaam</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LHCB2 antilichaam</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 Kolom</td><td>Grace</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &mu;m) Kolom</td></tr><tr><td>C18 Guard Kolom</td><td>Grace</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &mu;m) Guard&nbsp; Kolom</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>Meststof</td></tr><tr><td>Carbenicilline dinatrium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Chemiluminescentie beeldvormingssysteem</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Touch Imaging System</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Detergentia</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td>Polysorbaat 20</td></tr><tr><td>Fluorescentie lezer</td><td>Perkin-Elmer</td><td>&nbsp;1420-011</td><td>VICTOR Multilabel Counter</td></tr><tr><td>Forminezuur LC-MS kwaliteit</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15 % om laadbuffer met Tris-HCl, SDS en 2&ndash;mercaptoethanol te maken</td></tr><tr><td>GoTaq G2 polymerase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Corrosief</td></tr><tr><td>HILIC Kolom</td><td>Grace</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; deeltjesgrootte 2.7 &mu;m) Kolom</td></tr><tr><td>HILIC Guard Kolom</td><td>Grace</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &mu;m) Guard&nbsp; Kolom</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugaat anti-konijn antilichaam</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Niet te vaak invriezen/ontdooien</td></tr><tr><td>HPLC Autosampler</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>System Gold 508 Autosampler</td></tr><tr><td>HPLC Systeem</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Kanamycine sulfaat</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>2 g/L met NaCl, Na2HPO4 en KH2PO4 om PBS te maken</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2.4 g/L met NaCl, Na2HPO4 en KCl om PBS te maken</td></tr><tr><td>Laadbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminol oplossing</td><td>Ge Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>Bereid de oplossing met behulp van het commerciële ECL Prime Western Blotting System kit</td></tr><tr><td>Lyofilizator</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>Massaspectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&nbsp; -</td><td>Bruker Esquire 6000; de massaspectrometer was uitgerust met een ESI-bron en de analyzer was een ionenval</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Melk-blokkeer oplossing</td><td>Ristora</td><td>&nbsp;&nbsp; -</td><td>3 % in PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Gebruik met NaH2PO4 om Natriumfosfaat buffer te maken</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 g/L met KCl, Na2HPO4 en KH2PO4 om PBS te maken; 10 g/L om LB medium (pH 7.5 met NaOH) met Gistextract, Tryptone en Agar Bacteriologisch Kwaliteit te maken</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp;Gebruik met Na2HPO4 om Natriumfosfaat buffer te maken; 14.4 g/L om PBS te maken</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membraan</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Pepsine uit varkensgastrische mucosa</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase substraat ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td>Lichtgevoelig materiaal</td></tr><tr><td>Pomp Vacuum Pers</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>Reagens A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Gebruik 50 delen van dit reagens met 1 deel van reagens B om BCA werkoplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Reagens B</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Gebruik 1 deel van dit reagens met 50 delen van reagens A om BCA werkoplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Rifamycine</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Toxisch &ndash; 25 mg/mL stock in DMSO</td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfaat)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Ontvlambaar, toxisch, corrosief

voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor type 1 diabetes

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Plant moleculaire landbouw is het gebruik van planten voor de productie van moleculen van belang. In dit perspectief moet kunnen planten gebruikt worden als bioreactoren voor de productie en de daaropvolgende zuivering van het eindproduct en de directe mondelinge levering van heterologe eiwitten bij het gebruik van eetbare plantensoorten. In dit werk presenteren wij de ontwikkeling van een kandidaat-orale vaccin tegen Type 1 Diabetes (T1D) in de eetbare plant-systemen die gebruikmaken van gedeconstrueerd plant virus gebaseerde recombinant DNA-technologie, geleverd met vacuüm infiltratie. Onze resultaten tonen aan dat een rode biet een geschikte gastheer voor de voorbijgaande expressie van een mens afgeleide autoantigen gekoppeld aan T1D is, beschouwd als een veelbelovende kandidaat als een T1D vaccin. Bladeren produceren de autoantigen werden grondig gekenmerkt voor hun verzet tegen de maag spijsvertering, de aanwezigheid van residuele bacteriële lading en hun secundaire metabole profiel, met een overzicht van het productie proces voor de potentiële gebruik van planten voor de directe mondelinge aflevering van een heteroloog eiwit. Onze analyse toonde bijna volledige afbraak van het gevriesdroogd kandidaat-orale vaccin na een gesimuleerde maag spijsvertering, suggereert dat een strategie van de inkapseling bij de vervaardiging van de GAD plantgerelateerde vaccin vereist is.

In dit werk, wordt de workflow voor de ontwikkeling van een orale vaccin in eetbare plantaardige weefsels gepresenteerd. De focus van dit werk is de uitdrukking van een doel-proteïne in een eetbare host plantensoorten en de karakterisatie van het potentiële orale vaccin.
De eerste stap bij de beoordeling van de geschiktheid van de plant expressie virus gebaseerde technologie voor de productie van recombinante eiwitten in eetbare...

Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.

Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Onder de verschillende strategieën voor de productie van recombinant eiwit in planten, de gedeconstrueerde plantaardige VERS expressie biedt superieure prestaties, wat leidt tot hoge opbrengsten over een relatief kort tijdsbestek. Replicatie van deze technologie voor de productie van een oraal vaccin heeft een groot potentieel om in de nabije toekomst een alternatief te worden voor conventionele vaccins. Lyophilized rode bieten bladeren tijdelijk getransformeerd accumuleert een hoeveelheid foto antigenen geschikt voor orale tolerantie inductie in type een diabetes preventie.Dit experimentele protocol kan worden uitgebreid tot veel verschillende eetbare soorten na een beoordeling van recombinant eiwitaccumulatie per geval. Het demonstreren van de procedure zal Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo, en Roberta Zampieri. Om met deze procedure te beginnen, kweek je rode bieten- en spinazieplanten in een groeikamer zoals beschreven in het tekstprotocol.Bevrucht de planten na zaadkieming twee keer per week met een oplossing van commercieel verkrijgbare meststof met een concentratie van één gram per liter. Voor agro-infiltratie, gebruik maken van vijf weken oude spinazie en zes weken oude rode bieten planten. Na de bouw van de plantenexpressievectoren inent u de drie Transformatoren van A.tumefaciens in 50 milliliter LB-medium met rifampicine bij een concentratie van 50 microgram per milliliter en vectorspecifieke antibiotica zoals beschreven in het tekstprotocol.Groeien door schudden 's nachts op 28 graden Celsius. De volgende dag, pellet de bacteriële culturen door centrifugeren op 4500 keer G gedurende 20 minuten. Resuspend de pellet in 100 milliliter infiltratie buffer met 10 millimolar MES en 10 millimolar magnesiumsulfaat.De suspensies drie uur lang op kamertemperatuur uitbroeden. Meng een gelijk volume van een bacteriële suspensie met een van de hier getoonde modules, met de vijf prime module en de integrase module. Met behulp van een spuit zonder naald, neem vijf milliliter van de schorsing mix.Druk de punt van de spuit tegen de onderkant van het plantenblad terwijl u de druk zachtjes tegenzet aan de andere kant van het blad. Infiltreren in de eerste drie volledig uitgebreide bladeren, vanaf de top, voor elke plant. Label de agroinfiltrated bladeren met het papieren label op de bladstengel.Breng de planten vervolgens onder standaardomstandigheden terug naar de groeikamer. Op dag vier tot 14 na infectie, verzamel de agro-geïnfiltreerd bladeren en bevries ze in vloeibare stikstof. Bewaar dit plantenweefsel op min 80 graden Celsius.Ten eerste, afzonderlijk groeien de drie A.tumefaciens transformatoren in 50 milliliter LB medium met rifampicin bij een concentratie van 50 microliter per milliliter, en passende vector-specifieke antibiotica door schudden 's nachts op 28 graden Celsius. De volgende dag, pellet de bacteriële culturen door centrifugeren op 4500 keer G gedurende 20 minuten. Resuspend de pellet in 1 liter infiltratie buffer tot een OD600 van 0,35, en incubeer de schorsingen bij kamertemperatuur gedurende drie uur.Voeg vervolgens 0,01% van het wasmiddel toe aan elke suspensie. Meng een gelijk volume van een bacteriële suspensie met een van de hier getoonde modules met de vijf priemmodule en de integrase module. Steek een zes weken oude rode bietenplant in de houder.Omkeren van de houder en plaats het op de top van een beker met twee liter van een infiltratie bad om de bladeren onder te dompelen in de infiltratie suspensie. Breng hierna het infiltratiebad met de ondergedompelde installatie naar de infiltratiekamer en sluit het. Zet de vacuümpomp aan en open de vacuüminlaatklep op de infiltratiekamer.Zodra de druk in de kamer is gedaald tot 90 millibar, moet u het vacuüm gedurende drie minuten behouden. Laat het vacuüm vervolgens 45 seconden los. Wanneer de kamer is teruggekeerd naar atmosferische druk, open de kamer en verwijder de geïnfiltreerde plant uit het bacteriële bad.Breng de plant terug naar de groeikamer. Oogst op de dag van maximale expressie de geïnfiltreerde bladeren en bevries ze in vloeibare stikstof zoals eerder beschreven. Oogst eerst de vacuüm agroinfiltrated delta 87 GAD65mut die rode bietenbladeren uitdrukt op de expressiepiek en bevries ze in vloeibare stikstof.Lyophilize de bevroren bladeren op min 50 graden Celsius en op 0,04 millibar gedurende 72 uur. Bewaar ze dan bij min 80 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, maal de bladeren tot een fijn poeder en bewaar bij kamertemperatuur in een verzegelde container met silicagel om het vocht uit te sluiten.Voor de maagvertering simulatie, wegen 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bieten bladeren, en resuspend het in zes milliliter PBS. Gebruik zes molaire zoutzuur om het monster pH aan te passen aan twee. Voeg vier milligram per milliliter pepsine van varkens maagslijmvlies, en 10 millimolar zoutzuur, om een definitieve pepsine concentratie van een milligram per milliliter te verkrijgen.Schud het monster op 37 graden Celsius gedurende 120 minuten. Gebruik vervolgens natriumhydroxide om de pH van het monster aan te passen tot acht en de pepsine te inactiveren. Breng 750 microliter aliquots van elk monster over naar microcentrifugebuizen en vercentrifugeer de aliquots op 20.000 keer G en gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Verzamel elke supernatant afzonderlijk, en resuspend elke pellet in een supernatant volume van de lading buffer. Analyseer vervolgens zowel de supernatant als de geresuspended pellet door Western blot analyse. Voor de celintegriteitsanalyse bereidt u twee monsters van 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bietenbladeren en resuspend beide in zes milliliter PBS.Gebruik zes molaire zoutzuur om de pH van één monster aan te passen aan twee. Schud beide monsters op 37 graden Celsius gedurende 120 minuten. Dan aliquot 750 microliters van elk monster om microcentrifuge buizen.Centrifuge op 20.000 keer G en bij 4 graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel elke supernatant afzonderlijk, en resuspend elke pellet in een supernatant volume van de lading buffer. Analyseer vervolgens zowel de supernatant als de geresuspended pellet door Western blot analyse.Weeg eerst 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bietenbladeren en zet het opnieuw op in acht milliliter steriele PBS. Vortex voor één minuut. Plaat een milliliter van elk gevriesdroogd bladhomogenaat in een van de vijf bereide selectieve LB-media.Broed de platen drie dagen lang op 28 graden Celsius. Tel hierna de agrobacteriumkolonies die op elke plaat worden geteeld en bereken de resterende bacteriële lading als het aantal kolonievormende eenheden per milliliter van het gevriesdroogde bladhomogenaat. In dit werk wordt een oraal vaccin ontwikkeld in eetbaar plantweefsel.Rode bieten en spinazieplanten worden handmatig agroinfiltrrated met suspensies van A.tumefaciens die EGFP recombinant expressievectoren dragen, en de fluorescerende eiwitexpressie wordt gevisualiseerd door westerse vlekanalyse en gekwantificeerd onder UV-licht. Het rodebietensysteem wordt gekenmerkt door een hogere EGFP-expressie, die ongeveer 544 microgram per gram vers bladgewicht bereikt na negen dagen na infectie, terwijl de spinazie slechts een maximumniveau van ongeveer 113,4 microgram per gram vers bladgewicht bereikte op 11 dagen na infectie. Hierdoor wordt de rode bieten geselecteerd als expressiehost voor alle volgende experimenten.Planten worden vervolgens vacuüm geïnfiltreerd met een A.tumefaciens suspensie. Na de TSP-extractie uit agro-infiltratiebladeren worden de monsters geanalyseerd door westerse vlek en wordt het recombinant eiwit relatief gekwantificeerd door een densitometrieanalyse. Ten slotte worden de parameters voor de ontwikkeling van een mogelijk oraal vaccin geëvalueerd.Zoals hier te zien, wordt het doeleiwit gezien als stabiel na het lyophilisatieproces. Maagvertering wordt gesimuleerd door het varkenszuurenzym pepsine toe te voegen aan gevriesdroogd materiaal, hetzij tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per milliliter, of een verhouding van één tot 20, aan TSP. Beide spijsverteringsbehandelingsvoorwaarden resulteren in afbraak van het recombinant eiwit.De afwezigheid van een specifiek signaal in de pelletmonsters na pepsine spijsvertering suggereren dat na vriesdrogen, de plantencellen hun integriteit verloren, en dit leidde tot de beoogde eiwitafbraak. De procedure moet zorgvuldig worden aangepast aan de plantensoorten met betrekking tot vacuüminfiltratie en het doelrecombinant eiwit met betrekking tot de analyse van de tijdscursus. De demonstrerende procedure kan ook worden gebruikt voor de productie van biofarmaceutische geneesmiddelen die bestemd zijn voor orale levering, zoals vaccin en antilichamen.

transient-expression-red-beet-biopharmaceutical-candidate-vaccine-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven de lever neo-eilandje formatie in STZ (streptozotocine)-geïnduceerde diabetische muizen door genoverdracht van Neurogenin3 (Ngn3) en betacelluline (BTC) met behulp van helper-afhankelijke adenovirale vector (HDAd) en de omkering van hyperglycemie. Onze methode wordt voordelen van helper-afhankelijke adenovirale vectoren met hun zeer efficiënt in vivo transductie en langdurige genexpressie.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van transgenic expressie pEUI(+) enkelvoud gene schakeloptie door tebufenozide behandeling.

Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Een protocol om gengemodificeerde menselijke pseudoislets te maken van verspreide menselijke eilandjes cellen die door lentivirus met korte haarspeld RNA (shRNA) worden weergegeven. Dit protocol maakt gebruik van direct beschikbare enzym-en kweekvaten, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en produceert genetisch gemodificeerde humane pseudoislets die geschikt zijn voor functionele en morfologische studies.

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het transplanteren en afbeelden van NIT-1-cellen in niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte muizen die worden uitgedaagd met splenocyten gezuiverd van spontaan diabetische NOD-muizen.

Bioluminescente monitoring van transplantaatoverleving in een adoptief transfermodel van auto-immuundiabetes bij muizen

Dit protocol schetst een gedetailleerde procedure voor het genereren van voorbijgaande chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen met behulp van niet-integrerend mRNA voor kankerimmunotherapie en biedt betrouwbare methoden voor het evalueren van CAR-T-cellen en hun cytotoxische functie.

Een niet-virale benadering om voorbijgaande chimere antigeenreceptor-T-cellen te genereren met behulp van mRNA voor immunotherapie bij kanker

Leer hoe je een oraal vaccin tegen diabetes type 1 produceert met behulp van transiënte expressie in rode biet. Deze plantaardige methode biedt een schaalbaar alternatief voor conventionele vaccinatie.

Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes

Meer video's verkennen