Differentiatie capaciteit van menselijke aorta gerelateerde adipeus voorlopercellen

Perivasculair vetweefsel omringt bloedvaten en reguleert cardiovasculaire fysiologie. Dit protocol wordt gebruikt om belangrijke vragen met betrekking tot de functie van menselijke vetvererwaarden in de vasculaire micro-omgeving te beantwoorden. Vetverervercellen variëren afhankelijk van hun anatomische locatie.

We tonen aan dat een populatie van multipotige voorlopers met succes kan worden afgeleid uit perivasculair vetweefsel van patiënten met hart- en vaatziekten. Het aantonen van de procedure zal Spencer Scott zijn, een medische student van mijn laboratorium. Haal een stuk menselijk perivasculair vetweefsel of PVAT van 500 milligram uit de operatiekamer zoals beschreven in het tekstprotocol.

Breng verse menselijke PVAT van DMEM naar een 50 milliliter conische buis met 25 milliliter antibioticaoplossing. Incubeer met schommelen voor 20 minuten op vier graden Celsius. Terwijl de PVAT is in antibiotica oplossing, ontdooien een aliquot van dissociatie buffer op 37 graden Celsius.

Voeg 50 microliter van 100x antibioticum/antimycotische oplossing toe aan vijf milliliter dissociatiebuffer en steriliseer met behulp van een spuitfilter van 0,22 micron. Voeg een milliliter gelatineoplossing toe aan een put van een 24-putplaat. Gebruik in een laminaire stroomkap steriele tang en schaar om PVAT over te brengen van de antibioticaoplossing naar een steriel petrischaaltje.

Voeg een milliliter voorverwarmde dissociatiebuffer toe aan het weefsel. Fijn gehakt het hele weefsel in een drijfmest met behulp van steriele tangen en dissectie schaar. Breng de een milliliter drijfmest over naar vier milliliter dissociatiebuffer.

Broed de buis op zijn kant in een voorverwarmde 37 graden Celsius orbitale shaker bij 200 rpm gedurende een uur. Na een uur mogen er geen zichtbare weefselstukken aanwezig zijn en verschijnt de oplossing als een troebele celsuspensie. Filter de oplossing door een 70 micron cel zeef set bovenop een 50 milliliter conische buis.

Spoel de zeef met een extra 10 milliliter antibioticaoplossing om zoveel mogelijk cellen op te vangen. Knijp niet in de zeef. Nu pellet de cellen voor 12 minuten op 300 keer g in een swingende emmer centrifuge.

Na centrifugatie wordt de buis gescheiden in een vette toplaag van adipocyten, een interfase en een pellet. De pellet is de stromale vasculaire fractie die endotheelcellen, immuuncellen, bloedcellen en voorlopercellen bevat. Resuspend de pellet in 10 milliliter HBSS en centrifuge gedurende vijf minuten op 300 keer g.

Herhaal deze stap voor in totaal twee wasbeurten in HBSS. Nu aspirate de gelatine van een 24-well plaat. Was de put een keer voorzichtig met HBSS om ongebonden gelatine te verwijderen.

Resuspend de stromal vasculaire fractie pellet met intacte rode bloedcellen in een milliliter groeimedium en zaad op de gelatine-gecoate put. Voeg vervolgens menselijke FGF2 toe aan een uiteindelijke concentratie van 25 nanogram per milliliter in kweekmedium. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5%CO2.

Na het kweken van de cellen gedurende 24 uur, verwijder de groeimedia en was de cellen vijf keer met HBSS. Deze wasstap verwijdert rode bloedcellen en dode cellen. Voeg vervolgens een milliliter verse groei media aangevuld met 25 nanogram per milliliter FGF2 aan elke put.

Verander de media om de 48 uur om ervoor te zorgen aan te vullen met 25 nanogram per milliliter verse FGF2 elke keer. Passagecellen zodra ze 100% samenvloeiing bereiken zeven tot 10 dagen na de explant. Om dit te doen, aspirate groeimedia en was de monolayer tweemaal met een milliliter HBSS.

Aspirate alle HBSS uit de putten en voeg een paar druppels van de cel dissociatie oplossing. Tik en draai de plaat meerdere malen en incubeer op 37 graden Celsius met 5%CO2 gedurende vijf tot zeven minuten om de cellen op te tillen. Voeg vervolgens ongeveer een milliliter vers kweekmedium toe aan de losstaande cellen.

Verdeel 500 microliter van de losgemaakte cellen naar twee putten van een 24-put plaat die elk 500 microliters groeimedia en 25 nanogram FGF2 bevatten. Ook cultuur menselijke beenmerg Mesenchymal Stamcellen of MSC kolonies zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaat de juiste aantallen beenmerg en PVAT-afgeleide cellen per put van een 12-well plaat.

Voor adipogene en osteogene aandoeningen, plaat ongeveer 200.000 tot 225.000 cellen per put. Terwijl voor chondrogene omstandigheden, plaat 150, 000 tot 175.000 cellen per put. Dan scheiden cellen van zowel de menselijke PVAT voorloper cel populatie en de menselijke beenmerg MSC populatie door toevoeging van celloslating oplossing.

Broed de cellen in de onthechtingsoplossing vijf minuten in de onthechtingsoplossing bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Trek de populaties in aparte 15 milliliter conische flesjes. Draai de flesjes zeven minuten naar beneden op 500 keer g om de cellen te pelleteren.

Dan resuspend de cellen in een milliliter PBS en gebruik een hemocytometer om het celnummer te schatten. Bord de cellen in 12-well gerechten als voorheen. Zorg voor aparte gerechten voor de geïnduceerde en niet-geïnduceerde adipogene en osteogene omstandigheden.

En voeg 1,5 milliliter adipogene en osteogene geleidingsmedia toe aan elke put van de geïnduceerde aandoening. Voeg vervolgens 1,5 milliliter adipogene en osteogene niet-inductiemedia toe aan elke put van de niet-geïnduceerde aandoening. Begin incubatie van de adipogene en osteogene geïnduceerde en niet-geïnduceerde celpopulaties bij 37 graden Celsius en 5% CO2.

Draai het resterende volume van menselijke PVAT-voorlopercellen en menselijke beenmerg-MSC's zeven minuten naar beneden bij 500 keer g. Bepaal het volume dat nodig is om de resterende beenmerg en PVAT-afgeleide celpellets opnieuw op te stellen om een dichtheid van 100.000 cellen per 10 microliter te bereiken. Vervolgens resuspend de pellets in het berekende volume van MSC groeimedia voor chondrogenic lineage inductie.

Beweeg het volume van de cellen voorzichtig op en neer met behulp van een pipet om een homogene verdeling te garanderen. Nu pipette een 10 microliter druppel van de geconcentreerde cel oplossing in het midden van elke put tot een micromassa van 100.000 cellen te vormen. Plaats een milliliter steriel water in de aangrenzende put om verdamping te voorkomen.

Broed de micromassaculturen twee uur lang uit bij 37 graden Celsius en 5% CO2 om de micromassa te laten samenseren. Na twee uur, zorgvuldig toe te voegen chondrogenic differentiatie media verrijkt met 10 nanogram per milliliter menselijke TGF-beta-one aan elk van de geïnduceerde aandoening putten. Voeg nu voorzichtig 1,5 milliliter van de niet-inductiemedia toe aan de niet-geïnduceerde conditieputten.

Schraap of giet de micromassa in de geïnduceerde chondrogene toestand in een cassette om het monster zoals beschreven in het tekstprotocol te dehydrateren, insluiten en bevlekken. Adipogene differentiatiestudies werden uitgevoerd parallel met de door menselijke beenmerg afgeleide MSC- en PVAT-afgeleide voorlopercellen. In de niet-geïnduceerde aandoening is geen lipideaccumulatie duidelijk.

Dit is in tegenstelling tot de geïnduceerde aandoening getoond na het beitsen van neutrale lipiden met Olie Rood O.Terwijl de mate van differentiatie in de menselijke aorta PVAT-afgeleide cellen is robuuster, beide menselijke celbronnen tentoongesteld de mogelijkheid om te differentiëren voor de adipogene afstamming. Het osteogene differentiatieprotocol werd gebruikt voor menselijke beenmerg-afgeleide MSC's en PVAT-afgeleide cellen. Niet-geïnduceerde cellen vlekken niet met Alizarin Red.

Na het osteogene differentiatieprotocol ontwikkelden de menselijke MSC's verkalkte knobbeltjes die met Alizarin Red bevlekten, terwijl menselijke aorta PVAT-cellen dat niet deden. Cellen afkomstig van zowel menselijke beenmerg MSCs en menselijke PVAT weergegeven kenmerken die kenmerkend zijn voor chondrogene differentiatie met overvloedige collageen accumulatie in de micromassa. Micromassa wordt gevormd uit menselijke beenmerg MSCs en aorta PVAT-afgeleide cellen vertonen ook overvloedige accumulatie van glycosaminoglycanen zoals aangegeven door Alcian Blue vlekken.

Morfologisch werden structuren ontdekt die vergelijkbaar zijn met lacunes met cellen die in holtes zaten, omgeven door collageenafzetting. Het is van cruciaal belang om fijn gehakt perivasculaire vetweefsel voorafgaand aan enzymatische disassociatie en om ervoor te zorgen goede celdichtheden zijn verguld voor elke afstamming differentiatie test. Na deze procedure moet kwantitatieve PCR in combinatie met westerse vlek en stroomcytometrie worden gebruikt om afstammingsspecifieke markers van gedifferentieerde voorouders te karakteriseren uit perivasculaire vet- en beenmergbronnen.

Met deze techniek kunnen we beginnen met het begrijpen van de mechanismen die perivasculaire vetweefselexpansie en disfunctie reguleren tijdens obesitas en de implicaties die voorlopercellen hebben op de vasculaire functie en hart- en vaatziekten.