Name: Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer een methode voor real-time in vitro monitoring van odorant receptoractivering door vluchtige stoffen in de dampfase. Deze techniek helpt onderzoekers om geurperceptie en receptorkinetiek te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH (DC014423 en DC016224) en het Defense Advanced Research Project Agentschap RealNose-Project. YF bleef aan de Duke University met financiële steun van JSPS programma voor de bevordering van strategische internationale netwerken voor het versnellen van de omloop van getalenteerde onderzoekers (R2801). Wij danken Sahar Kaleem voor het bewerken van het manuscript.

1. Hana3A cellen cultuur
<ol><li>Bereiden M10 (Minimum essentiële Medium (MEM) plus 10% v/v foetale runderserum (FBS)) en M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicilline-streptomycine en 1,25 µg/mL amfotericine B).</li>
	<li>Cultuur van de cellen in 10 mL van de M10PSF in een 100 mm cel cultuur schotel in een incubator vastgesteld op 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2).</li>
	<li>Verdeel de cellen om de 2 dagen op een 20%-verhouding: bij 100% samenvloeiing van cellen (ongeveer 1.1 x 107 cellen) wordt waargenomen onder een Microscoop fase contrast, streven de media en wassen van de cellen zachtjes met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>PBS gecombineerd en voeg 3 mL 0,05% trypsine-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA, 0,48 mM). Laten treden voor ongeveer 1 minuut, totdat de cellen van de plaat distantiëren.</li>
	<li>Voeg 5 mL M10 inactivering van de trypsine en uiteindelijk het loskoppelen van de cellen nog steeds gekoppeld aan de plaat op en neer waarbij eveneens.</li>
	<li>Het volume (8 mL) overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL van M10PSF door pipetteren omhoog en omlaag om een willekeurige cel massa te doorbreken. Vermijd het creëren van bubbels in de buis.</li>
	<li>Breng 1 mL van de oplossing van de geresuspendeerde cellen in een nieuwe cel cultuur schotel van 100 mm en voeg 9 mL verse M10PSF. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
</ol>2. voorbereiding van de cellen van de Transfectie
<ol><li>Evalueren de samenvloeiing, of het aantal cellen, door het observeren van hen onder een Microscoop fase contrast. Ten minste 10% samenvloeiing (ongeveer 1.1 x 106 cellen) is nodig voor een plaat.</li>
	<li>De media gecombineerd en wassen van de cellen zachtjes met 10 mL PBS. PBS gecombineerd en voeg 3 mL EDTA. Laten treden voor ongeveer 1 minuut bij kamertemperatuur, totdat de cellen van de plaat distantiëren.</li>
	<li>Voeg 5 mL M10 inactivering van de trypsine en uiteindelijk het loskoppelen van de cellen nog steeds gekoppeld aan de plaat op en neer waarbij eveneens. Het volume (8 mL) overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL van M10PSF door pipetteren omhoog en omlaag om een willekeurige cel massa te doorbreken. Vermijd het creëren van bubbels in de buis.</li>
	<li>Afhankelijk van het aantal platen om te zijn transfected, overdracht van een passend bedrag van cellen in een reservoir met de juiste bijbehorende volume van M10PSF. Een 96-wells-plaat moet worden bedekt met 1/10 van een 100% confluente 100 mm schotel (ongeveer 1.1 x 106 cellen) verdund in M10PSF tot een totaal volume van 6 mL. Voeg voor een 96-wells-plaat beginnen met een schotel van 100% samenvloeiing 100 mm, 500 µL van de 5 mL geresuspendeerde cellen tot 5,5 mL van verse M10PSF. Meng de cellen en M10PSF zonder dat er luchtbellen.</li>
	<li>Pipeteer 50 µL van de zwevende cellen in elk putje van de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
</ol>3. plasmide transfectie
<ol><li>Observeer de 96-wells-plaat onder een Microscoop fase contrast te verzekeren van een cel samenloop tussen 30% en 50%.</li>
	<li>Bereiden van een eerste transfectie mix waarin de plasmiden gemeenschappelijk aan de gehele plaat (RTP1S, of en Glosensor eiwit, Zie Tabel van materialen) na de volumes in tabel 1. Merk op dat de hoeveelheid Rho-gelabeld OR moet worden gedeeld door het aantal ORs als verschillende ORs. Opmerking: We sterk advies een lege vector negatieve controle (hier Rho-pCI) en een positieve controle (OR bekend om te reageren op de geteste odorant) toevoegen aan het experiment-plan.</li>
	<li>Een tweede transfectie mix met 500 µL van MEM en 20 µL van het Lipofectamine 2000 reagens te bereiden (geldig voor een 96-wells-plaat, Zie Tabel van materialen). De tweede mix toevoegen aan de eerste, en zachtjes Meng door omhoog en omlaag pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 5 mL M10 en meng voorzichtig.</li>
	<li>De M10PSF in de eerder vernikkeld 96-wells-plaat vervangen door 50 µL van de definitieve transfectie media. Incubeer in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2 en vacuüm van de kamer van de luminometer overnachting volgende de procedure zoals in stap 6 beschreven.</li>
</ol>4. substraat incubatie
<ol><li>Observeer de 96-wells-plaat onder een Microscoop fase contrast te verzekeren van een cel samenloop tussen 60% en 100%. Bereid de oplossing van een stimulatie van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met 10 mM voor hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) en 5 mM van D-glucose.</li>
	<li>Verdun 75 µL van het kamp reagens (Zie tabel van materialen) -oplossing tot 2.75 / mL van de oplossing van de stimulatie. Verwijder het medium van de transfectie van de 96-wells-plaat en wassen van de cellen door 50 µL van vers stimulatie oplossing toe te voegen aan elk putje.</li>
	<li>Verwijder de stimulatie-oplossing en voeg 25 µL van cAMP reagens oplossing bereid in stap 4.2 aan elk putje. Incubeer de 96-wells-plaat bij kamertemperatuur in een donkere en geur-vrije omgeving (bijvoorbeeld een schone lege lade ver weg tegen chemicaliën of odorant) voor 2 h.</li>
</ol>5. Odorant stimulatie
<ol><li>Eerst, equilibreer de luminometer kamer met vluchtige odorant moleculen. Verdun de odorant aan de gewenste concentratie in 10 mL minerale olie(Figuur 2). Vóór het eind van de incubatietijd cAMP reagens, voeg toe 25 µL van de odorant oplossing in een nieuwe 96-wells-plaat (niet de ene met de cellen). Incubeer deze odorant plaat bij kamertemperatuur in de zaal van de luminometer voor 5 min (Figuur 2B) (geen luminometer opname is hier vereist).</li>
	<li>Instellen van de luminometer om vast te leggen van de luminescentie met 0 s van vertraging tijdens 20 cycli van plaat meting van 90 s met 0,7 s van het interval tussen de cycli.</li>
	<li>Vlak voor het lezen van de plaat, de odorant plaat uit de zaal te verwijderen. Voeg 25 µL van odorant tussen de putjes van de 96-wells-plaat met de cellen (de odorant niet toevoegen in de putjes met de cellen) en snel beginnen met het meten van de luminescentie van alle putjes voor 20 cycli binnen 30 min (Figuur 2C).</li>
</ol>6. verwijdering van de resterende odorant binnen de Luminometer
<ol><li>Open het deurtje van de luminometer. Plaats de buis verbonden met de vacuümpomp.</li>
	<li>Vacuüm odorant in de lezing kamer uitgebreid (ten minste 2 uur, bij voorkeur 's nachts) tussen twee odorant aan het voorkomen van kruisbesmetting van vluchtige stoffen de geur van een experiment naar de andere. Vervangen door frisse lucht door het sturen van perslucht gedurende 5 min voordat de volgende odorant aan het broeden.</li>
</ol>7. de gegevensanalyse
<ol><li>Exporteer de gegevens uit de luminometer-software.</li>
	<li>Het gemiddelde van de duplo's van hetzelfde of voor elke opnametijd. Bereken de genormaliseerde OR reactie aan een eventuele besturingselement (bijvoorbeeld lege vector, Figuur 3A en representatieve resultaten sectie) door het verdelen van de waarde van het besturingselement gemiddeld of gemiddeld waarde op elk tijdstip van de opname (Figuur 3B en representatieve resultaten sectie).</li>
	<li>Normaliseren de elke OR-reactie op hun basale activiteit door het verdelen van de gemiddelde reactie van de OR bij 0 s tot elke opname tijd reactie (Zie Figuur 3C en representatieve resultaten sectie).</li>
	<li>Bereken de oppervlakte onder de curve van elke of het verkrijgen van een interne OR-responswaarde. Om dit te doen, som van alle waarden van de luminescentie van elke opnametijd voor elke OR.</li>
</ol>

Y.F., H. K en H.M. een patent aanvraag ingediend relevant zijn voor dit werk op 27 oktober 2016.

De perceptie van geur is fundamenteel afhankelijk van de activering van ultraperifere regio's. Bijgevolg, begrip van hun functionaliteit is vereist voor spleet naar de complexe mechanismen waarmee de hersenen zijn vluchtige chemische omgeving waarnemen. Echter heeft het begrip van dit proces belemmerd door de moeilijkheden bij het vaststellen van een robuuste methode om het scherm van het repertoire van de OR voor functionaliteit tegen odorant in vitro. Cel oppervlak en heterologe expressie van ultraperifere reg...

De betekenis van geur kunt landdieren om te interageren met hun vluchtige chemische omgeving station gedrag en emoties. Fundamenteel, is het detectieproces geur begint met de allereerste interactie van odorant moleculen met de olfactorische systeem, op het niveau van odorant receptoren (ORs)1. ORs worden individueel zoogdieren uitgedrukt in olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel2. Zij behoren tot de familie van de G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en precies te zijn naar de subgroep van rodopsine-achtige (ook wel klasse A). ORs paar met de stimulerend G eiwit Golf wiens Activering tot cAMP productie leidt, gevolgd door de opening van cyclische nucleotide gated kanalen en de generatie van de actie potentieel. Het is geaccepteerd dat een geur percept is afhankelijk van een specifiek patroon van geactiveerde ORs3,4 en geur erkenning een combinatorische coderingsschema dat volgt, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van reukstoffen en één odorant kunt activeren een combinatie van ultraperifere regio's. En door middel van dergelijke combinatorische codering, het is gepostuleerd dat organismen kunnen detecteren en onderscheid tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen maken. Een van de sleutels tot het inzicht hoe geuren worden waargenomen is te begrijpen hoe en die ultraperifere regio's worden geactiveerd door een bepaalde geur.
In een poging om het verhelderen van odorant- of interacties, in vitro functionele testen een essentiële rol hebben gespeeld. De identificatie van de agonist geurige liganden voor wees ORs (OR ambtshalve orphanization) is een zeer actief gebied geweest voor de afgelopen twintig jaar, door het gebruik van diverse in vitro, ex vivo en in vivo Functionele assays5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
In-vitro-assay systemen zijn zeer geschikt voor de gedetailleerde functionele karakterisering van ultraperifere regio's, met inbegrip van identificatie van de functionele domeinen en kritische residuen van ultraperifere regio's, evenals mogelijke waterbouwkundige toepassingen. Ontwikkeling van waardevolle in vitro systemen voor ultraperifere regio's is echter verder een uitdaging, gedeeltelijk als gevolg van problemen met kweken OSNs en functionele expressie van ultraperifere regio's in heterologe cellen geweest. De eerste uitdaging was geweest om de protocollen die voor de cel-oppervlakte expressie van functionele ultraperifere regio's in de toewijzing van odorant toegestaan-OR interacties. Een aantal onafhankelijke groepen hebben gebruikt verschillende benaderingen5,6,7,8,9,10,11,12, 14,,18,19,20. Een van de vroegste successen geboekt door Krautwurst et al. gelabeld in de N-terminus van ultraperifere regio's met een verkorte opeenvolging van rodopsine (Rho-tag) en een verbeterde oppervlakte expressie in menselijke embryonale nier (HEK) cellen13waargenomen. Voor de tag gekoppeld aan de volgorde van de OR aangebrachte wijzigingen is nog steeds een pad onderzocht voor het verbeteren van de OR expressie en functionaliteit19,-21. Saito et al.. dan vervoer van receptor eiwitten 1 (RTP1) geïdentificeerd en RTP2 die vergemakkelijken OR mensenhandel. 22 een kortere versie van RTP1, genaamd RTP1S, is ook aangetoond dat zelfs effectiever dan de oorspronkelijke eiwit23. De ontwikkeling van een cellijn (Hana3A) die stabiel Golf uitdrukt, REEP1 en RTP1, RTP2 24, in combinatie met het gebruik van cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) verslaggevers identificatie van odorant heeft ingeschakeld-OR interacties. Het mechanisme waarmee de RTP-familie van eiwitten cel oppervlakte expressie van ultraperifere regio's bevordert moet nog worden bepaald.
Een waarschuwing voor deze gevestigde methoden is dat ze op de stimulatie van de odorant in vloeibare fase vertrouwen, wat betekent dat odorant vooraf in een medium stimulatie opgelost zijn en cellen stimuleren door vervanging van het medium. Dit is zeer verschillend van de fysiologische omstandigheden waar odorant moleculen de olfactorische epitheel in damp fase bereiken en activeren van ORs door ontbinding in de nasale mucosa. Als u wilt meer sterk gelijken op fysiologisch relevante stimulans blootstelling, Sanz et al.20 voorgesteld een bepaling op basis van damp stimulatie door toepassing van een daling van odorant oplossing om op te hangen onder de binnenzijde van een plastic folie geplaatst op de top van cel wells. Zij de calcium antwoorden opgenomen door controle van de intensiteit van de fluorescentie. Deze methode was de eerste die lucht-fase odorant stimulatie, maar deed het niet toestaan dat een grote screening van OR activering.
Hier, ontwikkelden we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van in vitro OR activering via damp fase odorant stimulatie door de bepaling van de Glosensor (Figuur 1). Deze bepaling heeft eerder is gebruikt in het kader van vloeibare odorant stimulatie18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. de controle kamer van de luminometer is eerste geëquilibreerd met gevaporiseerde odorant vóór plaat lezen(Figuur 1). Odorant moleculen zijn dan solvated in de buffer, Baden van Hana3A cellen, uiting geven aan de OR van belang, RTP1S en de Glosensor eiwitten (Figuur 1B). Als de odorant een agonist van de UPR's is, zal de OR overschakelen naar een geactiveerde bevleesdheid en binden de Golf, activeren de adenylyl cyclase (AC) en uiteindelijk leiden tot cAMP niveaus te stijgen. Dit stijgende kamp zal binden aan en activeer het eiwit Glosensor voor het genereren van luminescentie luciferine katalyseren. Deze luminescentie wordt vervolgens geregistreerd door de luminometer en kan OR activering. Deze methode is van groot belang in het kader van OR deorphanization, zoals het in vitro systemen dichter bij de natuurlijke waarneming van geuren brengt.

<table><tbody><tr><td>0.05 % trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% Trypsin - EDTA (1x), fenol rood - bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>100 mm celkweekschaal&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm x 20 mm celkweekschaal&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL buis</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td>17 mm x 120 mm kegelvormige buizen</td></tr><tr><td>96-well plaat</td><td>Corning</td><td>3843</td><td>96 well, met LE-deksel wit met heldere bodem Poly-D-lysine gecoat Polystyreen</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Amphotericin B 250 &micro;g/mL - bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>centrifuge-machine</td><td>Jouan</td><td>C312</td><td>Centrifuge-machine met roterende emmer voor 15 mL</td></tr><tr><td>Klasse II Type A/B3 afzuigkap</td><td>NUAIRE</td><td>NU-407-500</td><td>afzuigkap voor celkweek</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Fetaal bovien serum - bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Reagens</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td>GloSensor cAMP Reagens luminescente eiwit substraat - bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Incubator 37 &deg;C; 5 % CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-604</td><td>Incubator voor celkweek</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000 Reagens 1mg/ml transfectie reagens - bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Luminometer POLARstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>discontinued</td><td>96 well plaatlezer voor luminescentie</td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Solvent voor geurstoffen - bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Corning cellgro</td><td>10-010-CV</td><td>Minimum Essential Medium Eagle met Earle&rsquo;s zouten &amp; L-glutamine - bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>Penicilline-Streptomycine oplossing gestabiliseerd met 10.000 U penicilline en 10 mg streptomycine - bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>pGlosensor</td><td>Promega</td><td>E2301</td><td>pGloSensor-22F cAMP luminescente eiwit plasmide - bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Phase contrast microscoop</td><td>Leica</td><td>090-131.001</td><td>phase contrast microscoop met x4, x10, x20 objectieven</td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>H. Matsunami lab</td><td>-</td><td>100 ng/&micro;L plasmide - bewaar bij 4 &deg;C</td></tr></tbody></table>

real-time in vitro monitoring van odorant receptor activering door een odorant in de damp-fase

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Olfactorische waarneming begint met de interactie van odorant met odorant receptoren (of) uitgedrukt door olfactorische sensorische neuronen (OSN). Geur erkenning volgt een combinatorische coderingsschema dat, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van odorant en één odorant kan het activeren van een combinatie van ultraperifere regio's. Door dergelijke combinatorische codering, kunnen organismen detecteren en onderscheid maken tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen. Dus, een geur met een bepaalde concentratie kan worden beschreven door een patroon voor activering van ultraperifere regio's, die specifiek is voor elke geur. In die zin, het kraken van de mechanismen die de hersenen gebruikt voor het waarnemen van geur vereist het begrip odorant-OR interacties. Dit is de reden waarom de reukzin Gemeenschap streeft naar "--orphanize" deze receptoren. Conventionele in vitro systemen gebruikt voor het identificeren van odorant- of interacties drachtige cel media met odorant, hebben gebruikt die verschilt van de natuurlijke detectie van geuren via damp odorant ontbinding in nasale mucosa voor interactie met ORs. Hier beschrijven we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van OR activering via damp-fase odorant. Onze methode is afhankelijk van de cAMP release door luminescentie met behulp van de bepaling van de Glosensor meten. Het huidige verschillen tussen de in vivo en in vitro benaderingen overbrugt en vormt de basis voor een biomimetische vluchtige chemische sensor.

Wij onderzocht de reactie van drie muis ORs, Olfr746, Olfr124 en Olfr1093 met behulp van cinnamaldehyde damp stimulatie (Figuur 3). Gelijktijdig, gebruikten we een lege vectorbestrijding (Rho-pCI) om te verzekeren dat de activiteiten van odorant-geïnduceerde van de geteste ultraperifere regio's specifieke (Figuur 3A). De real-time activering van de ultraperifere regio's op damp odorant stimulans was gecontroleerde meer dan 20 meting cycli. De ge...

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Ons protocol maakt het mogelijk om detectie en discriminatie van vluchtige geuren te meten met een panel van geurreceptoren. Deze methode opent de mogelijkheid om geurreceptorgebaseerde biosensoren te ontwikkelen. Deze techniek maakt real-time in vitro monitoring van geurreceptor activering op geurige moleculen in dampfase.Het vult de kloof tussen in vitro en in vivo benaderingen. Deze methode kan worden gebruikt om de kinetiek van gebeurtenissen die leiden tot geurperceptie te begrijpen, met inbegrip van de rol van slijmvlies metabole enzymen. Om te beginnen, bereid M10 en M10 PSF volgens het manuscript.Cellen worden gekweekt in 10 milliliter M10 PSF bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Observeer het kweekgerecht onder een contrastmicroscoop voor fases. Wanneer het bereikt 100%samenvloeiing, split de cellen tot een lagere concentratie door aspirating de media en het wassen van de cellen zachtjes met 10 milliliter PBS.Dan aspirate de PBS en voeg drie milliliter trypsin-EDTA. Laat het ongeveer een minuut reageren totdat de cellen zich van de schotel distantiëren. Voeg vijf milliliter M10 toe om de trypsine te activeren en pipet op en neer om de cellen aan de schotel los te maken

real-time-vitro-monitoring-odorant-receptor-activation-an-odorant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.

Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen

Olfactorische receptor neuronen (ORNs) om te zetten geur signalen eerst in een receptor stroom die op zijn beurt actiepotentialen die worden overgebracht naar de tweede orde neuronen in de bulbus olfactorius triggers. Hier beschrijven we de zuig-pipet techniek om tegelijkertijd op te nemen van de geurstof-geïnduceerde receptor huidige en actiepotentialen van muis ORNs.

Odorant-geïnduceerde responsen Opgenomen van olfactorische receptor neuronen met behulp van de zuignap Pipet Techniek

This video demonstrates the protocol for measuring odorant receptor activation in transfected cells using a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor and luminescence detection. The method is applied to study receptor-ligand interactions and signaling pathways in olfactory neurons.

Measuring Odorant Receptor Activation using a Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay

Source: de March, C. A. et. al., Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the method to monitor the real-time activation of odorant receptors in recombinant mammalian cells using luminescence measurement. Odorant binding triggers G-protein activation and cAMP production, activating glosensor proteins that emit luminescence upon substrate binding, providing a quantitative measure of receptor response.

Real-Time Monitoring of Odorant Receptor Activation in Recombinant Cells

Een verticale, T-doolhof olfactometer beschreven voor het testen van de gedragsreactie van geleedpotigen. De olfactometer kan de experimentator om keuzes te maken die door proefpersonen te meten wanneer het wordt blootgesteld aan twee potentiële geur velden. Zowel aantrekking tot en afstoting van geurstoffen kan worden gemeten met dit apparaat.

Verticale T-doolhof Keuze Test voor geleedpotigen Reactie op odoranten

Olfactorische receptor activering patronen coderen geur identiteit, maar het gebrek aan gepubliceerde gegevens identificeren geurstof liganden voor zoogdieren reukreceptoren belemmert de ontwikkeling van een alomvattend model van geur codering. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor zeer snelle identificatie van olfactorische receptor liganden en kwantificering van receptoractivering vergemakkelijken.

High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

Leer een methode voor real-time in vitro monitoring van odorant receptoractivering door vluchtige stoffen in de dampfase. Deze techniek helpt onderzoekers om geurperceptie en receptorkinetiek te bestuderen.

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Meer video's verkennen