Uitgebreid autopsie programma voor individuen met multiple sclerose

Het doel van ons onderzoek is het bestuderen van de pathogenese van multiple sclerose. Om dit doel te bereiken hebben we een snel autopsieprogramma opgezet om de hersenen van personen met MS te verkrijgen en te bestuderen. Er zijn twee speciale aspecten van ons autopsieprogramma, de eerste is dat het snel is. We verzamelen dat de hersenen minder dan zes tot acht uur dood zijn.

Dit zorgt voor state of the art moleculaire studies. Het tweede aspect is dat we een MRI in situ doen voordat we de hersenen verplaatsen. Dit stelt ons in staat om pathologische veranderingen te correleren met veranderingen in de beeldvorming van de hersenen.

Visuele demonstratie stelt kijkers in staat om te begrijpen hoe we onze ruimte en tijd organiseren om optimale resultaten te bereiken. Weefselverwerking dat snel en zorgvuldig gebeurt, zorgt voor RNA-analyse, immunostaining, immunoblotting en MRI-correlaties. Nieuwe onderzoekers kunnen worstelen met de verwerking van weefsels met een slechte weefselintegriteit.

Het vermijden van lange post mortem fixatie tijden is belangrijk en MRI weefsel corde strepen kan uitdagend zijn, zodat overleg met MRI-analyse deskundigen kan zeer nuttig zijn. Het demonstreren van de procedure zal Worden Emilie Christie en Christina Volsko. Technici van ons lab.

Na In situ magnetische resonantie beeldvorming, wegen en fotograferen van de hersenen en plaats een bijgevoegde dura in een container van 4%Paraformaldehyde of PFA. Scheid het cerebellum en de hersenstam van de cerebrum en fotografeer de cerebrum. Gebruik een sonde om de optische zenuwen, chiasm en traktaten te scheiden en de structuur te voorzien van een scalpel.

Scheid de hersenhelften in de lengterichting en fotografeer elk halfrond individueel. Inkt de primaire motorische cortex of PMC voor de linker hersenhelft, herfotograferen het weefsel en plaats het weefsel in een 3,3 liter container voor lange fixatie. Om de PMC voor de rechter hemisfeer te verkleinen verwijder de bekledingsingen en herfotograferen het weefsel.

Volgende resect de PMC met behulp van een scalpel. Fotografeer vervolgens de gereseceerde PMC naast het halfrond. Snijd de PMC in zes even grote secties en inkt het rostral aspect van elke sectie.

Plaats vervolgens elke andere sectie in PFA gevulde containers voor korte fixatie. En snap bevriezen de resterende secties voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer een. Snijd de rechter hersenhelft voorste naar achterste in een centimeter dikke coronale secties.

Fix elke andere sectie in PFA en snap bevriezen de resterende secties voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer een. Scheid de hersenstam van het cerebellum en plaats de hersenstam in een PFA gevulde container voor korte fixatie. Snijd elk cerebellar halfrond in vier even vaste sagittale secties en fotografeer de mediale en laterale uitzichten.

Plaats vervolgens de linker hersenhemisferische plakjes in een container van PFA voor korte fixatie. En snap bevriezen de juiste cerebellar hemisferische plakjes voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer een. Na het verkrijgen van het ruggenmerg met de zenuwwortels verwijder het ruggenmerg dura mater en bewaar de dura in PFA.

Scheid de linker en rechter voorste en achterste zenuwwortels en snijd de linker voorste en achterste zenuwwortels van het ruggenmerg voor korte fixatie in PFA. Snijd de rechter voorste en achterste zenuwwortels uit het ruggenmerg en snap bevriezen deze weefsels voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer twee. Fotografeer vervolgens de caudal-meest 20 centimeter van het ruggenmerg en snijd twee centimeter overdracht secties van de staart naar rostral richting van het koord voor PFA korte fixatie en snap bevriezing.

Fotografeer vervolgens het resterende rostralgedeelte van het ruggenmerg. En snijd twee centimeter overdracht secties van de caudal naar rostral richting van het snoer voor PFA korte fixatie en snap bevriezing. Snijd delen van de rente uit de korte of lange vaste weefsels.

Plaats de secties in individuele putten van een zes put plaat en was de weefsels met drie vijf minuten wast in twee milliliter verse PBS per was, met schudden. Voor antigeen ophalen, magnetron de secties gedurende twee tot drie minuten in een glazen beker met ongeveer 30 milliliter van 10 millimollar citraat buffer. Wanneer de secties zijn afgekoeld tot kamertemperatuur de overdracht van de monsters in een nieuwe zes put plaat voor drie vijf minuten wasbeurten en twee milliliter PBS, plus 0,3%Triton X-100 per put, per wasbeurt.

Gevolgd door endogene peroxidase blokkeren in twee milliliter van 3% waterstofperoxide plus 0,3%Triton X-100 in PBS gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de secties drie keer in twee milliliter PBS plus Triton X-100 per wasbeurt, zoals aangetoond. Gevolgd door het blokkeren in twee milliliter van 3% normale geitenserum en PBS plus Triton X-100 gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Vervolgens, incubeer de secties van 's nachts tot vijf dagen in de primaire antilichamen van belang bij vier graden Celsius, gevolgd door drie vijf minuten wast in twee milliliter PBS per wasbeurt. Incubeer de secties in avidin-biotine complexe oplossing of ABC complex gedurende een uur, bij kamertemperatuur. Volg dit met drie vijf minuten wasbeurten in PBS.

Label de secties met twee milliliter gefilterde Diaminobenzidine aangevuld met waterstofperoxide per goed gedurende drie tot acht minuten. Wanneer de kleur voldoende is ontwikkeld, was de secties drie keer in PBS en breng elke sectie individueel over naar een met PBS gevulde container. Plaats elke sectie plat, onder individuele weefselglijbanen.

En til elke glijbaan voorzichtig uit de PBS, zodat de secties zo plat mogelijk blijven. Gebruik twee kwasten om elk weefsel voorzichtig af te vlakken en uit te rekken. En gebruik een papieren handdoek om het overtollige water weg te deppen.

Monteer vervolgens de secties met een passend montagemedium en verzegel elke afslag met duidelijke nagellak. Weefselsecties worden onderzocht op de aanwezigheid van witte stoflaesies en de geselecteerde gebieden worden vastgehouden op immuunactiviteit en demyelinatie. In acute Multiple Sceloris laesies fungeren veel van deze gedemyelineerde axonen als axonale intrekkingsbollen die de proximale uiteinden van doorgesneden axonen weerspiegelen.

De dichtheid van doorgesneden axonen in acute laesies overschrijdt 11000 per kubieke millimeter in actieve laesies in vergelijking met slechts 15 in aangrenzende niet-lesional witte stof regio's. Nieuw gegenereerde oligodendrocyten zijn ook aanwezig in veel chronische MS-laesies. Deze processen associëren met, maar niet myelinaat gedemyelineerde axonen.

Een representatieve, onbevooroordeelde zoektocht naar neuronale genveranderingen in snel bevroren motorcorscoors verkregen van chronische MS-patiënten, identificeerde significante reducties in 23 nucleaire en gecodeerde mitochondriale boodschapper RNA's Credentialing studies met behulp van immunocytochemie en in situ hybridisatie aangegeven dat deze genen waren sterk verrijkt in corticale projectie neuronen en dat mitochondondriën geïsoleerd van projectie ax displayons verminderde glycolyse. Vergelijking van de neuronode genexpressie in geïhileerde en gedemyerineerde hippocampi onthult reducties in neuronale boodschapper RNA's met inbegrip van eiwitten die betrokken zijn bij het geheugen en leren. Verder, in vergelijking met controle cortices, corticale neuronale verlies is aanzienlijk groter in een sub populatie van MS-patiënten die demyelinatie van het ruggenmerg en de hersenschorst, maar niet van de cerebrale witte stof.

Zorg er tijdens weefselverwerking voor dat ze bij het snijden van de coronale secties consequent worden gesneden met betrekking tot dikte en oriëntatie. En dat ze plat liggen als ze in een fixatief zweven of als ze bevroren zijn. Naast de immunohistochemische analyse biedt de diepvriesweefselcollectie ons de mogelijkheid om genetische en proteomische analyse uit te voeren.

Deze technieken hebben geholpen bij de identificatie van een nieuw cohort van MS-patiënten met cerebrale witte stof laesies op MRI, maar zonder significante witte stof demyelinatie. Genoemd Myelocortical MS.