Een in vitro batch cultuur model om de effecten van Interventionele regimes op menselijke fecale microbiota te schatten
31 juli 2019
Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.
Gezien de opkomende rol van darmmicrobioom in verschillende menselijke ziekten, verschillende darmmicrobioom modulators zoals probiotica, prebiotica, diëten en drugs kunnen helpen bij het verbeteren van darmmicrobioom-geassocieerde gezondheidsaandoeningen. Er is echter geen snel en betaalbaar screeningsysteem beschikbaar om de effecten van dergelijke darmmicrobioommodulatoren te voorspellen, maar dit systeem is eenvoudig genoeg om te voorspellen hoe bepaalde interventies van invloed kunnen zijn op darmmicrobioom dat uiteindelijk de gezondheid van de gastheer kan beïnvloeden. Dit protocol is eenvoudig, betaalbaar en praktisch voor laboratoria die de darmmicrobioommodulatoren onderzoeken en hun effecten op microbiota en de gezondheid van de gastheer.
Onderhoud van aseptische en anaërobe omstandigheden is cruciaal voor dit experiment. Ook het fecale monster moet opnieuw worden gebruikt, onmiddellijk na het verzamelen. Anders, als het experiment later wordt gepland, moet het monster onmiddellijk na het verzamelen bij min 80 worden opgeslagen, zonder blootstelling aan omgevingstemperatuur en lucht.
Handling nauwkeurigheid tijdens aliquot prepping en pipetting is ook belangrijk voor het behoud van nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Het duurt minder dan 12 uur overdag. We kunnen 's nachts een cultuur opbouwen als ze de monsters binnen 24 uur nodig hebben.
Daarna volgen de korte-keten vetzuren en de bepaling van het microbioom. Dit proces zal worden aangetoond door twee grote uni studenten, Shokouh Ahmadi en Rabina Mainali uit mijn lab. Om fermentatiemedia onder een rookkap voor te bereiden, in een reagensfles op magneetmengsel, meng oplossing A, oplossing B, spoorminerale oplossing, in water oplosbare vitamineoplossing, foliumzuurbiotineoplossing, riboflavineoplossing, hemineoplossing, korte keten vetzuurmix en rezursain.
Voeg vervolgens in de fles gisextract, natriumcarbonaat, cysteïne hydrochloride monohydraat, en trypticase. Voeg 296,1 milliliter gedestilleerd water toe, pas de pH aan met een normale hydrochloride of natriumhydroxide om er zeker van te zijn dat deze rond 7,0 ligt. Breng het bekerglas naar een aseptisch werkstation en gebruik een vacuümfilter met poriegrootte op 0,22 micrometer om de media te steriliseren.
Om een liter anaerobe verdunningsoplossing voor te bereiden, los je vijf gram natriumchloride, twee gram glucose en 0,3 gram cysteïnehydrochloridemonohydraat in het geïoniseerde water op. Autoclave de reagens fles met dop op 121,1 graden Celsius gedurende 15 minuten, en bewaar het in de anaerobe kamer. Bewaar voor het begin van het fermentatie-experiment alle materialen, oplossingen en gereedschappen die nodig zijn voor het fermentatie-experiment minstens 48 uur in de anaerobe kamer, om ervoor te zorgen dat eventuele residuestof wordt verwijderd.
Ten minste 24 uur voor het fermentatie-experiment weegt u 300 milligram inuline en breng deze over op een buis van 50 milliliter, die vervolgens in de anaerobe kamer wordt geplaatst. Voeg 26 milliliter gesteriliseerde fermentatiemedia toe aan de buis en vortex om te mengen. Laat hydratatie van vezels voor ongeveer 24 uur.
De dag van het fermentatie-experiment, bereid fecale entmateriaal. Weeg eerst vijf gram vers fecale monster in een conische buis van 50 milliliter. Voeg anaerobe verdunningsoplossing toe aan de buis om een eindvolume van 50 milliliter te bereiken.
Vortex gedurende 15 minuten, of tot volledig gehomogeniseerd. Houd de ingeënte buizen op 37 graden Celsius in de anaerobe kamer, en om te keren zachtjes een keer per uur om de vezels en enentmateriaal resuspend. Na drie, zes, negen of 24 uur, neem de juiste hoeveelheid gefermenteerde media, en centrifugeren de monsters op 14,000 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.
Bevries onmiddellijk de supernatant en pellet in vloeibare stikstof, dan na snap bevriezing, bewaar de supernatant voor korte keten vetzuren analyse, en pellet voor microbioom analyse, op min 80 graden Celsius. Dit protocol wordt gebruikt om het effect van een specifiek prebioticum aan te tonen. De ontlasting van gezonde menselijke proefpersonen, na behandeling met inuline, vertoonde negen uur lang een relatief stabiele pH, terwijl ze na 24 uur dramatisch daalden.
De inenting van inuline aanzienlijk verhoogd de niveaus van korte-keten vetzuren en lactaat in inuline behandeld fecale specimen wordt vergeleken met niet-behandelde fecale microbiota cultuur. De belangrijkste coördinatenanalyse toont verschillende microbiotasamenstelling aan de gewogen en ongewogen UniFrac-metingen van bètadiversiteit tussen inulinebehandelde en onbehandelde monsters. Indexen van alfadiversiteit versus fylogenetische diversiteit door PD hele boom, soorten rijkdom, operationele taxonomische eenheden, soorten gelijkmatigheid, evenals relatieve overvloed van grote phyla en geslachten, alle aanwezig verschillende gut microbiota handtekeningen tussen inuline behandelde en onbehandelde monsters.
Taxonomisch cladogram, afgeleid van lineaire discriminante effectgrootteanalyse van 16S-sequenties, vertegenwoordigt de differentiaal overvloedige taxa tussen verschillende groepen monsters. Volg alle stappen zorgvuldig. Het belangrijkste is om strikte aseptische en anaërobe voorwaarden te handhaven.
De supernatant en van het experiment kan worden gebruikt voor de behandeling van korte-keten vetzuren niveau veranderingen als gevolg van de fermentatie op basis van vezels. Bovendien kan de in de pellet worden gebruikt voor het analyseren van de veranderingen in de samenstelling van het darmmicrobioom. Sommige chemische stoffen die worden gebruikt voor het maken van de cultuur media zijn potentieel gevaarlijk.
Gelieve het MSDS-blad en neem dienovereenkomstig voorzorgsmaatregelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een in vitro batch-culture fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, waarbij inuline wordt gebruikt om de effecten van specifieke interventies op de samenstelling en de metabole activiteiten van de fecale microbiota te beoordelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbioomonderzoek
- Darmgezondheid
- Prebiotische effecten
Achtergrond
- Het darmmicrobioom speelt een cruciale rol bij de menselijke gezondheid.
- Modulatoren zoals prebiotica kunnen de darmmicrobiota beïnvloeden.
- Huidige screeningssystemen voor effecten op het darmmicrobioom zijn beperkt.
- Dit protocol biedt een praktische oplossing voor laboratoria.
Doel van de studie
- Om een eenvoudig en betaalbaar screeningssysteem te ontwikkelen.
- Om de impact van interventies op de darmmicrobiota te voorspellen.
- Om het begrip van de rol van de microbiota in de gezondheid van de gastheer te vergroten.
Gebruikte methoden
- In vitro batch-cultuurfermentatiesysteem.
- Gebruik van verse fecale monsters of correcte bewaring bij -80掳C.
- Handhaving van aseptische en anaerobe condities.
- Beoordeling van de microbiotasamenstelling en metabole activiteiten.
Belangrijkste resultaten
- Het systeem voorspelt effectief de effecten van specifieke interventies.
- Aantoonbare veranderingen in de samenstelling van het fecale microbiota.
- Belichtte de metabole activiteiten die beïnvloed worden door inuline.
- Bood inzichten in de modulatie van het darmmicrobioom.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol instrument voor onderzoek naar het microbioom.
- Het maakt de evaluatie van interventies voor de gezondheid van de darmen mogelijk.
- Het ondersteunt verdere studies naar microbiota en de gezondheid van de gastheer.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
High-throughput, in vitro batch-cultuurmodellen voor de menselijke fecale microbiota maken snelle, schaalbare screening van microbiome-modulatoren mogelijk zonder afhankelijkheid van dier- of mensenstudies. Deze aanpak ondersteunt het vroegtijdige beperken van risico's bij kandidaat-interventies door kwantitatieve, reproduceerbare gegevens te verschaffen over de samenstelling van de microbiota en de metabolische output. De integratie van dergelijke modellen in discovery-pipelines versnelt de evaluatie van prebiotica, probiotica en dieetcomponenten voor portefeuilles gericht op darmgezondheid.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele analyse van microbiome-modulatoren op microbiële gemeenschappen van menselijke oorsprong mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door verschuivingen in microbiota-diversiteit en metabole activiteit te kwantificeren.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij het selecteren van veelbelovende interventies voor verdere ontwikkeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar systeem voor het evalueren van interventie-effecten op de samenstelling van het microbiota.
- Genereert kwantitatieve resultaten zoals pH, lactaat en spiegels van korteketenvetzuren voor comparatieve analyse.
- Ondersteunt schaalbare screening van meerdere verbindingen of schema's in parallelle workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro bevindingen in lijn met ziekterelateerde microbiome-signaturen voor translationele continuïteit.
- Maakt risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van kandidaten mogelijk op basis van mechanistische en metabole read-outs.
- Ondersteunt de ontdekking van biomarkers door interventie-geïnduceerde veranderingen te koppelen aan meetbare resultaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit in vitro batch-cultuurmodel bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie en levert bruikbare gegevens op voordat preklinische in vivo studies worden uitgevoerd.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over microbioommodulatie en effecten op signaalpaden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor het vergelijken van interventies.
- Analytica: Maakt statistische analyse mogelijk van de microbiota-compositie en metabole verschuivingen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische validatie wanneer dit wordt ondersteund door metabole gegevens en diversiteitsoutputs.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Biedt een herbruikbaar platform voor de voortdurende evaluatie van diverse kandidaten die op het microbioom zijn gericht.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij microbiome-gerichte ontdekkingen.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows en verbetert de reproduceerbaarheid over verschillende screeningscampagnes heen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalallocatie door het verstrekken van vroege, bruikbare gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van microbiome-modulatoren voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in anaerobe microbiologie en aseptische technieken.
- Vereist toegang tot anaerobe kamers en analytische platformen voor metaboliet- en microbioomprofilering.
- Noodzaak van strikte standaardisatie tussen teams voor monsterverwerking en data-analyse.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende donorbronnen of interventietypes.
- Potentiële risico's door chemische reagentia vereisen naleving van veiligheidsprotocollen.
