Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

eVOLVER geeft onderzoekers experimentele vrijheid, de mogelijkheid om hun eigen cultuurgroeiexperimenten te definiëren met geautomatiseerde feedback op meerdere parameters en deze te schalen naar welke grootte ze nodig hebben. eVOLVER is flexibeler dan andere apparaten. Gebruikers kunnen eenvoudig software aanpassen in Python en de hardware, door de slimme mouwen aan te passen die sensoren voor elke cultuur bevatten.

Het systeem kan op het eerste gezicht ingewikkeld lijken met meerdere componenten en verbindingen. Een visuele gids geeft gebruikers voor het eerst meer vertrouwen in het uitvoeren van experimenten op zichzelf. Een goede installatie is cruciaal.

Zorg ervoor dat u begrijpt wat elk onderdeel doet. Dus je bevestigen dat ze werken. Zorg ervoor dat alles correct wordt gerouteerd en goed is aangesloten.

Hoewel ontworpen voor aërobe culturing van bacteriën en gist in verschillende omstandigheden, eVOLVER kan ook worden gewijzigd voor anaërobe fermentatie of om zoogdiercellen in suspensie te handhaven. Deze video laat zien hoe u een experiment met een hoge doorvoercontinucultuur instellen, initialiseren en uitvoeren met behulp van het eVOLVER-platform. De dag voor het experiment, bereid media, flesjes en entmateriaal volgens het manuscript.

In drie grote bekers, bereiden twee bekers van 10% bleekmiddel en een beker van 70%-ethanol. Met behulp van de schakelaars op het eVOLVER-apparaat schakelt u de vijf volt voeding op de eVOLVER in, wacht vijf seconden en schakelt u de 12 volt voeding in. Als u meerdere flesjes uit dezelfde mediafles uitvoert, sluit u meerdere media-invoerlijnen aan met buizenversplitters.

Aangepaste buizensplitters kunnen worden gebouwd met lagere componenten. Dompel de media-invoerlijnen onder in de eerste bleekbeker en de media eflux lijnen in de tweede bleekbeker. Sluit het stroomafwaartse uiteinde van de media-invoerlijnen aan op de tweede beker met de efluxlijnen.

Plaats afvallijnen in een afvalcarboy. Voeg een tot twee liter bleekmiddel in de afvalcarboy om afval gegenereerd tijdens het experiment te steriliseren. Navigeer met behulp van het touchscreen op de eVOLVER naar de installatiesectie en voer alle pompen gedurende 20 seconden uit om de vloeistoflijnen te vullen met 10% bleekmiddel.

Laat bleekmiddel te zitten in de lijnen voor ten minste 30 minuten te steriliseren. Voer de pompen opnieuw met behulp van het touchscreen totdat de lijnen niet meer onder water, het duwen van lucht door de lijnen om zo veel van het bleekmiddel eruit te krijgen mogelijk. Plaats media invoerlijnen in de ethanol beker, vul de lijnen met ethanol, spoel ze met lucht.

Bevestig vervolgens media-invoerlijnen aan de mediaflessen met de onderste connectoren en voer de pompen uit totdat de media volledig door de lijnen loopt en eventuele resterende ethanol wegspoelen. Plaats gesteriliseerde flacons gedeeltelijk in de slimme mouwen van eVOLVER en sluit de invoerlijnen aan op het korte instroomstro en de afvallijnen op de lange eflux strawq volgens de kleurcodering. Pas op het eVOLVER touchscreen aan om alle pompen in stappen van 10 seconden te laten draaien om de flacons te vullen met media.

Zorg ervoor dat efluxpompen door visuele inspectie efficiënt media verwijderen via de efluxrietjes om overloop te voorkomen. Duw vervolgens de flesjes naar beneden tot ze volledig zijn ingekapseld door de slimme mouw. Sleep op de interactieve installatiepagina van het eVOLVER touchscreen met een vinger over het touchscreen of druk op de knop Alles selecteren om alle flesjes te selecteren en stel de initiële temperatuuromstandigheden in op 30 graden Celsius en de roer op 10.

Geef op een computer het eVOLVER-apparaat op waarop het experiment wordt uitgevoerd. Zorg ervoor dat de gewenste kalibratie-instellingen zijn geselecteerd. Open het eVOLVER-dashboard en navigeer naar de pagina Experiment manager.

Selecteer het basisexperiment in het deelvenster Experimenteernavigator of een bestaand experiment als uitgangspunt en klik op Kloon. Navigeer naar de pagina Experimenteditor. Gebruik de panelen Vial Selector en Parameter Definition om de temperatuur aan te passen op 30 graden Celsius en stel een bovenste en onderste od voor elke flacon in volgens het experimentele ontwerp.

Sla het experiment op door op Opslaan te klikken. Klik vervolgens op de pijl om terug te gaan naar de pagina Experiment manager en klik op de knop Afspelen om uit te voeren. Zodra het experiment aan de gang is, gaat u naar het deelvenster Realtime gegevens in het interactieve dashboard.

Controleer voor elke flacon of de OD-waarden op nul staan. Blader door de temperatuurgrafieken om te controleren of de temperaturen op of op weg zijn naar 30 graden Celsius. Om het entmateriaal voor te bereiden, meet eerst de OD van overnight culturen en bereken de gewenste volledige verdunning voor overnight culturen uitgaande van een flacon volume van 25 milliliter en een gewenste start OD van ongeveer 0,05.

Via de bemonsteringspoort, pipet het berekende volume van inoculum of mengsel van inocula. Controleer de grafieken op het dashboard om te zien dat de OD stijgt tot 0,05. Celgroei en flacon voorwaarden kunnen worden gecontroleerd in real time als het experiment aan de gang is, waardoor de onderzoeker om in te grijpen als er problemen optreden.

eVOLVER is een geautomatiseerd continu cultuurplatform dat meerparameter controle geeft over de cultuuromstandigheden. Kwalitatieve verschillen werden getoond tussen het wilde type, temperatuurgevoelige en zoutgevoelige groepen wanneer de logratio's werden uitgezet ten opzichte van generaties die waren geïnterpoleerd uit gegevens over de groeisnelheid van eVOLVER. Kleur geeft de temperatuur van de selectie aan, terwijl streepjes zoutconcentraties onderscheiden.

Een helling past door het lineaire gedeelte van elk perceel met een minimum van drie punten, levert een kwantitatieve fitnesswaarde op die beschrijft hoe de variantstam concurreert met de referentiestam. Negatieve fitnesswaarden geven aan dat de variantstam wordt 1000 keer meegecurreerd door de referentiestam. Controleer altijd of alle pompen efficiënt draaien en of vloeistofleidingen vrij zijn van klompen.

Een overloop kan een experiment verpesten en mogelijk de slimme mouwen beschadigen. Monsters die van eVOLVER zijn genomen, kunnen vervolgens worden gesequenced om te controleren op genomische veranderingen als gevolg van het experiment. Deze informatie kan worden gebruikt om nieuwe stammen of systemen te ontwikkelen.

Voor onderzoekers die labevolutie of bibliotheekselectie gebruiken, is het eenvoudig om unieke selectiedruk toe te passen in elk eVOLVER-experiment. Feedback controle en dynamische omgevingen zijn nu ook zeer toegankelijk. De afvalcarboy zal kleine hoeveelheden bleekmiddel en ethanol bevatten na een experiment.

Raadpleeg uw labveiligheidscoördinator voor een goede afvalverwerking.