Name: Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer tumor-geassocieerde mutaties detecteren in circulerend DNA uit patiëntbiovloeistoffen met behulp van droplet digital PCR. Deze niet-invasieve methode maakt longitudinale monitoring van tumor dynamiek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de vrijgevigheid van alle patiënten en hun families erkennen. Dit werk werd gesteund door de financiering van de Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), de V Foundation (Atlanta, GA), het Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, klinisch en translationeel wetenschaps Instituut bij Children's National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), de Lilabean Stichting voor pediatrisch hersenkanker onderzoek (Silver Spring, MD), de jeugd hersenen tumor Foundation (Germantown, MD), de hersenen van de kinderen Tumor tissue Consortium (Philadelphia, PA), en rally Foundation voor kinderkanker onderzoek (Atlanta, GA).

<ol><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+molecular+meta-analysis+of+1%2C000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).</li>
<li>Hoffman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genomic+heterogeneity+in+diffuse+intrinsic+pontine+and+midline+high-grade+glioma%3A+implications+for+diagnostic+biopsy+and+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child%27s+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas.</a> Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year+one+in+the+molecular+era+of+pediatric+brain+tumor+diagnosis%3A+application+of+universal+clinical+targeted+sequencing+in+an+unselected+cohort+of+children%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children.</a> Neuro-Oncology. 19 (4), iv21(2017).</li>
<li>Mueller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIPG-40.+PNOC003%3A+Precision+medicine+trial+for+children+with+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Neuro-Oncology. 19 (4), iv14(2017).</li>
<li>Kilburn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIPG-76.+PNOC-003%3A+Precision+medicine+trial+for+children+with+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%3A+preliminary+experience+with+multi-agent+personalized+therapy+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations.</a> Neuro-Oncology. 20 (2), i64(2018).</li>
<li>Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+in+glioma+immunotherapy%3A+evidence%2C+pitfalls%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives.</a> Journal of Immunology Research. 2017, 5813951(2017).</li>
<li>Panditharatna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+and+minimally+invasive+tumor+surveillance+of+pediatric+diffuse+midline+gliomas+using+patient-derived+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA+%28locked+nucleic+acids%29%3A+synthesis+and+high-affinity+nucleic+acid+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition.</a> Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).</li>
<li>Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+mismatch+discrimination+of+locked+nucleic+acid-DNA+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes.</a> Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).</li>
<li>Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA+probes+substantially+improve+the+detection+of+bacterial+endosymbionts+in+whole+mount+of+insects+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization.</a> BMC Microbiology. 12, 81(2012).</li>
<li>Qiagen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAamp+Circulating+Nucleic+Acid+Handbook%22">QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook</a>. , 1090257(2013).</li>
<li>Jackson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+preamplification+of+serum+DNA+to+facilitate+reliable+detection+of+extremely+rare+cancer+mutations+in+circulating+DNA+by+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).</li>
<li>Rain Dance Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RainDrop+Assay+Guidelines%22">RainDrop Assay Guidelines</a>. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).</li>
<li>Rain Dance Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RainDrop+Analyst+II+Operator%27s+Manual%22">RainDrop Analyst II Operator's Manual</a>. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).</li>
<li>Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poisson+Plus+quantification+for+digital+PCR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Poisson Plus quantification for digital PCR system.</a> Scientific Reports. 7, 9617(2017).</li>
<li>Biorad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Droplet+Digital+PCR+Applications+Guide%22">Droplet Digital PCR Applications Guide</a>. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).</li>
<li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).</li>
<li>Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+genotyping+with+oligonucleotide+probes+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+tumors+of+the+brainstem+by+sequencing+of+CSF-derived+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li>
<li>Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+for+non-invasive+cancer+management%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management.</a> Cancer Genetics. , (2018).</li>
<li>Barault, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+methylated+circulating+DNA+biomarkers+for+comprehensive+non-invasive+monitoring+of+treatment+response+in+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer.</a> Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).</li>
</ol>

De methode die in dit manuscript wordt beschreven, is opgenomen in een internationale octrooiaanvraag "methoden voor het opsporen van kanker biomarkers" door Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.

Hier hebben we onze methode voor het opsporen en kwantificeren van de allelische frequentie van tumor mutaties in cfDNA van patiënt vloeistof biopsie gepresenteerd. We benadrukken cruciale stappen voor het succes van deze methode, waaronder pre-analytische monsterverwerking, cfDNA-extractie, PCR-assay ontwerp en gegevensanalyse. Om het gebruikte monstervolume te beperken, wordt cfDNA geëxtraheerd uit 1 mL plasma, maar slechts 500 μL CSF. Bij het uitpakken uit CSF, het protocol voor extractie van 1 mL urine (na de cfDNA-extractie Kit handboek12) wordt gebruikt, volgens de aanbeveling van de fabrikant. Het verschil in monstervolume vereist tussen plasma en CSF is te wijten aan lagere niveaus van tumor-specifieke cfDNA in plasma in vergelijking met CSF van patiënten met hersentumoren, vereisen grotere monstervolumes voor mutatie detectie8. Als het monster beschikbaar is, kan meer dan 1 mL plasma worden geëxtraheerd om een hogere DNA-opbrengst te produceren. In het geval van pediatrische patiënten is het echter belangrijk om de hoeveelheid bloed zoveel mogelijk te minimaliseren, omdat zelfs een eenvoudige procedure zoals bloedverlies vermoeiend is voor pediatrische patiënten met kanker die stralings therapieën ondergaan. Extractie van 1 mL aliquots van plasma maakt ook het repliceren van extracties mogelijk, zodat de test kan worden herhaald (bijvoorbeeld in gevallen van falen in DNA-extractie of monster verontreiniging).
In een poging om elk monster gebruik dat niet strikt noodzakelijk is te verminderen, wordt cfDNA meestal niet gekwantificeerd. We hebben echter een bereik van cfDNA-concentraties gevonden tussen 0,2-2 ng/μL en 0,6-13 ng/μL in respectievelijk plasma en CSF. Gezien de geringe hoeveelheid cfDNA en het feit dat tumor-specifieke Mutante allelen op een lage frequentie aanwezig zijn, is een pre-amplificatie stap met behulp van dezelfde set primers die voor dPCR worden gebruikt nodig om de hoeveelheid doel-DNA in het monster significant te verhogen, wat helpt bij Mutatie detectie8. Het verdunnen van het voorversterkte product in de DNA-suspensie buffer biedt voldoende volume voor technische replicaten, wat helpt bij het onderscheiden van echte positieven. Omdat het aantal Mutante druppeltjes laag kan zijn (bijvoorbeeld tussen 0-2 Mutante druppeltjes in een plasma monster), is het opnemen van technische replicaten essentieel voor het oplossen van de mutatie status. Terwijl een PCR-goed 0 Mutant druppeltjes kan opleveren, kunnen de andere twee 1-2 opleveren voor een enkel plasma monster dat in drievaat wordt geanalyseerd; de opname van replicaten zorgt dus voor een grotere nauwkeurigheid bij het bepalen van de mutatie status. Het MAF wordt vervolgens berekend als het gemiddelde van de repliceer waarden.
Multiplexed pre-amplificatie (het voorversterkend wild type en het Mutante allelen van twee mutaties van belang) vergroot het nut van een enkel monster, omdat hetzelfde uitgangsmateriaal kan worden gebruikt om te testen op twee mutaties. Belangrijk is dat een multiplex preamplificatie product in singleplex kan worden geanalyseerd tijdens dPCR voor meer eenvoud, zoals hier beschreven. Beide preamplificatie-PCR en dPCR kunnen echter Multiplexed zijn. Wanneer multiplexing, voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor beide sets van primers en sondes: primer gloeien temperaturen moeten vergelijkbaar zijn om samen te lopen in PCR-versterking, en sondes moeten worden ontworpen om verschillende clusters te genereren (op basis van fluorescerende signaal en intensiteit). Voer bij het valideren van een nieuwe set primers en voelers een gloeien temperatuurgradiënt uit om de optimale gloeien temperatuur te bepalen op basis van het door de fabrikant voorgestelde bereik. Voordat testen sondes op patiënt cfDNA specimens, valideren met behulp van synthetische DNA-constructies en/of tumorweefsel gDNA van verschillende ingangen (d.w.z., tot 10 ng).
Voor de detectie van mutant allelen met een grotere specificiteit en minder mismatches in de hybridisatie van de sonde naar het doel-DNA, worden vergrendelde nucleïnezuur (LNA) sondes gebruikt. LNA is een nucleïnezuur analoog met een methyleen brug die de 2 '-zuurstof en 4 '-koolstof van de ribose ring9verbindt. De methyleen brug vergrendelt het nucleïnezuur in een stijve bicyclische conformatie die flexibiliteit beperkt, thermische duplex stabiliteit verhoogt en de specificiteit van sonde hybridisatie verbetert om DNA10,18te targeten, 19. als er een enkele basis mismatch bestaat tussen LNA-sonde en template-DNA, zal de duplex vorming tussen sonde en doelwit destabiliseren. Als zodanig, LNA sondes verbeteren de specificiteit van sonde binding en resulteren in een hogere signaal-ruis verhouding11. Analyse van plasma en CSF van niet-CZS-zieke pediatrische patiënten heeft de specificiteit vastgesteld van onze assay met LNA-sondes gericht op H3F3A p. K27M, om te bepalen dat een allelische frequentie van gelijk aan of kleiner dan 0,001% als vals-positief wordt beschouwd 8. voor aanvullende overwegingen voor het optimaliseren van het ontwerp van sondes en primers, met inbegrip van GC-inhoud, ampliconlengte voor temp grootte, probe reporter kleurstoffen, en quenchers, verwijzen naar de richtlijnen van de dpcr-fabrikant14,17. Hoewel onze methode is geoptimaliseerd voor gebruik met het RainDance-systeem, kan het protocol worden aangepast voor gebruik met andere dPCR-platformen.
De hier gepresenteerde methode haalt kracht uit de hoge gevoeligheid en doel verrijking van dPCR, die het platform van keuze blijft voor het opsporen van zeldzame tumor mutaties in cfDNA. Hoewel krachtig, is dPCR beperkt in het aantal mutaties dat in één test kan worden getest. Een alternatief voor dPCR is Next generation sequencing (NGS), die meerdere mutaties in veel genen kan detecteren, waardoor het nut van een enkel monster toeneemt. NGS kan mutaties in CSF en plasma van patiënten met hersenstam gliomen20detecteren, echter, is momenteel minder gevoelig dan dpcr bij het opsporen van tumor mutaties in cfdna, met detectiegrenzen van 0,1-10% MAF vergeleken met 0,001% in PCR-gebaseerde benaderingen21 . dPCR realiseert ook een snellere doorlooptijd dan NGS, waardoor mutaties van belang snel kunnen worden opgespoord. De PCR-benadering is toepasbaar voor verschillende soorten kanker en kan worden uitgebreid om hotspot mutaties en gemethyleerd cfDNA22te detecteren.
De vloeibare biopsie is inderdaad in de kinderschoenen en zal verdere ontwikkeling vereisen voor het afstemmen van specifieke ziekten. Tumor monitoring in de context van tumor evolutie zal de volgende uitdaging zijn, waarbij een platform dat in staat is om opkomende mutaties met een hoge gevoeligheid te detecteren nodig zou zijn. Bovendien zullen platforms die in staat zijn om een verscheidenheid aan biomoleules (peptiden, cytokines, RNA) te detecteren, zeer nuttig zijn bij het beoordelen van de tumorrespons op de behandeling, evenals het bevorderen van gepersonaliseerde klinische interventies.

Vanwege beperkingen in de beschikbaarheid van tumorweefsel voor moleculaire analyses, is er behoefte aan de ontwikkeling van zeer gevoelige methoden die in staat zijn tumor somatische mutaties in biovloeistoffen van patiënten te detecteren, waaronder plasma, serum en cerebrospinale vloeistof (CSF) . Bijvoorbeeld, pediatrische diffuse middellijn gliomen (dmg's) vormen een uitdaging als gevolg van hun neuroanatomische locatie. In het afgelopen decennium heeft moleculaire profilering van DMG-weefsel specimens bestuurders mutaties in dit tumor type1 blootgelegd en heeft het ruimtelijke en temporele heterogeniteit van mutaties onthuld, waardoor biopsie nodig is voor het karakteriseren van een patiënt binnen een ziekte subgroep en bevordering van moleculair gerichte therapieën2. Als zodanig, klinische proeven pleiten voor de integratie van chirurgische biopsieën voor tumor moleculaire profilering op vooraf diagnose3,4,5,6. Tijdens de behandeling, controle van de therapeutische respons in Dmg's is beperkt tot MRI, die ontbreekt aan gevoeligheid voor het detecteren van kleine veranderingen of tumor genomische evolutie. MRI is ook gevoelig voor het detecteren van pseudoprogressie, voorbijgaande ontsteking op de plaats van de tumor die ware progressie op beeldvorming nabootst en kan de interpretatie van tumorrespons7verkeerd informeren. Dus, Dmg's vertegenwoordigen een tumor type met een hoge behoefte aan een alternatieve, minimaal invasieve middelen voor het opsporen van tumor mutaties en monitoring klinische respons. Om aan deze behoeften tegemoet te komen, ontwikkelden en optimaliseerde men een protocol voor het opsporen en kwantificeren van de allelische frequentie van tumor mutaties in cfdna uit plasma, serum en CSF van kinderen met middellijn gliomen8. Gezien het feit dat de kinder Dmg's vaak (> 80%) een somatische lysine-tot-methionine-mutatie op positie 27 van Histon-variant H 3.1 (H 3.1 K27M, 20% van de gevallen) of H 3.3 (H 3.3 K27M, 60% van de gevallen)1, deze en andere mutaties die kenmerkend zijn voor dmg's (d.w.z. ACVR1, PIK3R1) waren gericht op gemuteerde allel kwantificering met behulp van cfDNA8. Deze test kan worden aangepast aan het detecteren van hotspot mutaties in andere tumortypen met behulp van sequentie-specifieke primers en sondes. De veelzijdigheid van deze aanpak maakt het toepasbaar op een verscheidenheid van kankers die baat zouden hebben bij de integratie van op cfDNA gebaseerde diagnostische instrumenten en therapeutische monitoring.
Om op een verstandige manier lage allel-frequentie mutaties in cfdna te detecteren, hanteren we een druppel digitale PCR (dpcr)-gebaseerde aanpak. Bij deze methode wordt het PCR-reactiemengsel opgedeeld in een theoretisch maximum van 10.000.000 druppels met behulp van het dPCR-platform (bijv. RainDance), met 7-9 miljoen druppels per PCR-goed meestal experimenteel gezien. Vanwege de hoge mate van sample partitionering kunnen er in elke druppel maximaal één tot twee DNA moleculen aanwezig zijn. PCR-amplificatie en sequentie-specifieke fluorescentie sonde hybridisatie kunnen voorkomen in elke druppel, zodat miljoenen reacties plaatsvinden. Dit maximaliseert de gevoeligheid en maakt detectie mogelijk van zeldzame Mutant allelen, die anders onopgemerkt kunnen blijven tegen een achtergrond van wild type DNA. Het gebruik van vergrendelde nucleïnezuur (LNA) voelers verhoogt de specificiteit van de assay door het beperken van mismatch hybridisatie en het ondersteunen van nauwkeurige mutatie detectie9,10,11. Hier beschrijven we onze methoden voor monsterverwerking, cfDNA-extractie, voor versterking van doel-allelen, dPCR en gegevensanalyse.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367525</td><td>Voor plasma collectie</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367895</td><td>Voor serum collectie</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Free DNA Blood Collection Tubes</td><td>Streck</td><td>218961</td><td>cfDNA bloedverzamelbuizen (optioneel)</td></tr><tr><td>CentriVap Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Aangepast ontwerp</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutant Probe</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Aangepast ontwerp</td></tr><tr><td>PAXgene Blood ccfDNA tubes</td><td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>cfDNA bloedverzamelbuizen (optioneel)</td></tr><tr><td>PCR 8 well strip tube caps</td><td>VWR</td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8 well strip tubes</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (p20, p200, p1000)</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette filter tips (p20, p200, p1000)</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>cfDNA extractie kit handleiding (2013 editie)</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>cfDNA extractie kit (Protocol Stap 4)&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>Optionele kit voor DNA extractie uit kleine (&lt; of =200 &micro;L) steekproefvolumes</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Voor gebruik met QIAamp Circulating Nucleic Acids kit</td></tr><tr><td>Raindance Consumable Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>Bevat druppelgenererende instrumentchips, kwantificeringsinstrumentchips, PCR-stripkapjes inclusief hogesnelheidskapjes en druppelstabiliserende olie</td></tr><tr><td>Raindance Sense Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Kwantificeringsinstrument (gebruikt in Protocol Stap 9)</td></tr><tr><td>Raindance Source Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Druppelgenererend instrument (gebruikt in Protocol Stap 9)</td></tr><tr><td>RainDrop Analyst II Software</td><td>RainDance Technologies</td><td></td><td>Analyst software gebruikt voor Data Analysis (Protocol Stap 10)</td></tr><tr><td>Refrigerated Vapor Trap</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Aangepast ontwerp</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genotyping Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4371353</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT Probe</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Aangepast ontwerp</td></tr></tbody></table>

detectie en monitoring van tumor geassocieerd circulerend dna bij patiënt biovloeistoffen

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complicaties in verband met vooraf en herhaalde chirurgische weefsel bemonstering presenteren de behoefte aan minimaal invasieve platformen die in staat zijn moleculaire subclassificatie en temporele monitoring van tumorrespons op therapie. Hier beschrijven we onze op dPCR gebaseerde methode voor de detectie van tumor somatische mutaties in cel vrij DNA (cfDNA), direct beschikbaar in biovloeistoffen voor patiënten. Hoewel het aantal mutaties dat in elke test kan worden getest beperkt is, biedt deze methode een hoge mate van gevoeligheid en specificiteit. Monitoring van de mutatie overvloed, zoals berekend door MAF, maakt de evaluatie van tumorrespons op therapie mogelijk, waardoor een veel noodzakelijke aanvulling op radiografische beeldvorming wordt geboden.

Figuur 1 toont representatieve resultaten voor een succesvolle detectie van H3F3A p. K27M mutatie in voorversterkt plasma (linksboven) en CSF (rechtsboven paneel) cfdna van twee kinderen met dmg. cfDNA-monsters werden geanalyseerd in repliceren, maar slechts één representatieve grafiek wordt weergegeven voor elk type monster. De dPCR-plots vertonen een succesvolle druppel generatie, met 7-9 miljoen druppels per PCR-put (waarvan de meeste negatieve druppels zijn die geen doel-DNA bevatten). Een minimum van 7.000.000 druppels per PCR-goed duidt op een succesvolle dropletisatie, terwijl minder dan 7.000.000 duiden op falen van de test, in welk geval de gebruiker niet door moet gaan met gegevensanalyse. Figuur 1 toont een duidelijke scheiding tussen Mutant en wild type clusters langs respectievelijk de x-en y-as. Robuuste wild type clusters geven aan dat de cfDNA-extractie is gelukt omdat template DNA aanwezig is. Mutant clusters vertonen respectievelijk een MAF van 1,60% en 39,92% voor de plasma-en CSF-monsters, die een positieve detectie van de mutatie aantonen. Voor deze patiënten, dPCR resultaten zijn in overeenstemming met de tumor mutatie status, zoals bevestigd door genomische analyse van biopsie tumorweefsel8. De negatieve controle (onderste linker paneel) toont 0 Mutant en 0 wild type druppeltjes, wat aangeeft dat er geen besmetting van het PCR-reactiemengsel was. De positieve controle tumorweefsel gdna (onderste rechter paneel) toont de mutatie wordt gedetecteerd op de verwachte allel frequentie voor het specifieke tumor monster geselecteerd.
In Figuur 2worden representatieve resultaten getoond voor de mislukte opsporing van de mutatie van belangstelling, H3F3A p. K27M, in plasma cfdna van een kind met dmg. Mutatie status werd bevestigd door genomische analyse van tumorweefsel8. Representatieve resultaten van twee duplo-PCR-putten worden getoond (toppanelen). Het totale aantal druppels, inclusief negatieve druppels, is tussen de 7-9 miljoen per PCR-put, wat duidt op een succesvolle dropletisatie. De wild type clusters, uitgezet langs de y-as, vertonen ongeveer 7-8000 wild druppeltjes per PCR-goed voor het plasma cfdna, wat duidt op een succesvolle cfdna-extractie (omdat er een doel wild-DNA in het monster is). Echter, 0 Mutant druppeltjes worden gedetecteerd in het plasma monster. Het paneel linksonder toont negatieve controle (MB H2O) zonder wild type of Mutante druppeltjes; en de onderste rechter paneel toont de positieve controle voorversterkte tumorweefsel gDNA (0,025 ng) met positieve mutatie detectie. Zoals blijkt uit dit cijfer, kan de afwezigheid van mutatie detectie in het plasma niet noodzakelijkerwijs betekenen dat de patiënt wild type is voor de mutatie van belang, aangezien valse negatieven optreden8. In sommige gevallen, wanneer de mutatie wordt gemist in het plasma verzameld op vooraf biopsie, het wordt gedetecteerd in het plasma verkregen van dezelfde patiënt op een later tijdstip punt8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg"> Figuur 1 : Succesvolle opsporing van H3F3A p. K27M mutatie in voorversterkt plasma en CSF cfdna van kinderen met middellijn gliomas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg"> Figuur 2 : Vals negatieve resultaten verkregen uit de analyse van een voorversterkt plasma-cfDNA-monster van een patiënt die bekend is om de mutatie van belang, H3F3A p. K27M, in de tumor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Dit protocol maakt de detectie van tumor geassocieerde mutaties en momenteel complimenten invasieve chirurgische ingrepen. Een andere kracht is de mogelijkheid om dit protocol te gebruiken om tumormutatie belasting overuren te controleren. De techniek maakt tumor genotyping zonder dat de werkelijke chirurgische weefsel biopsie die vooral nuttig is voor tumoren op uitdagende locaties, zoals de hersenstam met beperkte toegang tot weefsel.Bij afwezigheid van herhaalde biopsie zijn longitudinale moleculaire gegevens niet beschikbaar om MRI te complimenteren. Digitale PCR monitoring vergemakkelijkt een moleculair gebaseerd supplement voor de diagnose, waardoor een beter geïnformeerde behandeling besluitvormingsproces. Soortgelijke methoden kunnen worden gebruikt om de expressie van genen in het bijzonder systeem te detecteren, met conventionele Fluo-4 en quencher-gekoppelde sondes, maar met een hogere gevoeligheid dan met de kwantitatieve PCR.Reinig voor het begin van de druppel digitale PCR-procedure de bankruimte en -apparatuur met 10% bleekwater en 70% ethanol en voorzichtig vortex en vercentrifugeer kort alle reagentia, behalve de druppelstabiliserende olie. Bevestig dat de gecomprimeerde stikstofgascilinder is bevestigd aan het druppelgenererende instrument en dat de cilindertank is ingesteld op 90 pond per vierkante inch. En 38 microliters van digitale PCR reactie mengsel direct in de bodem van elke put van een acht put PCR buis strip, het verwijderen van eventuele bubbels met een schone pipet tip.Voeg 12 microliter van vooraf versterkt DNA-monster in drievoud toe aan de juiste putten van de buisstrip. Voorzichtig pipette het volledige volume 10 keer om de reactie mengsel mengen met het DNA monster en pipette het volledige volume van elke goed in de overeenkomstige A door H kanalen van een druppel genererende instrument chip. Plaats een nieuwe PCR-buisstrip in het druppelgenererende instrument en scan de druppelgenererende instrumentchip-id in de software op de instrumentcomputer.Klik vervolgens op Uitvoeren om te beginnen met het druppelen van voorbeelden. Wanneer de druppelisatie is voltooid, verwijdert u de PCR-buisstrip en brengt u buisstripdoppen aan. Breng de buis strip naar een thermische cycler en de balans van de buis met een andere buis strip met 80 microliter water per put.Voer vervolgens de thermische cycler in onder de juiste thermische fietsomstandigheden. Vervang de stripdoppen door hoge snelheidsdoppen. Wanneer de thermische strook is voltooid, breng je de buisstrook over naar het kwantificeringsinstrument, klik je op Een run instellen op de instrumentsoftware en plaats je de buisstrip in het kwantificeringsinstrument.Plaats het metalen schild bovenop een nieuwe chip van kwantificeringsinstrument, scan de chip-ID in het instrument en steek de chip in de machine. Sluit het deksel van het instrument. Voer in de computersoftware een naam in voor de digitale PCR-run en voor elk van de acht kanalen, selecteer vervolgens De snelle modus en klik op Start om de kwantificering te beginnen.Om de ruwe spectrale gegevens te analyseren, start u de software van de analist en opent u de fcs-bestanden. Selecteer intact onder de analyseweergave. Klik onder voorbeeldweergave op de vakken naast elk van de acht voorbeelden.De software zal de signalen voor de mutant en wilde type allelen langs respectievelijk de x- en y-as in kaart brengen. Gebruik de berekende matrixfunctie om de spectrale compensatie op de intacte druppels toe te passen, volgens de instructeurs van de fabrikant en pas de asinstellingen aan onder asopties. Stel de x-as in op minimaal nul en maximaal 30,000 en de y-as op minimaal min 5, 000 en maximaal 10.000.Wanneer druppelclusters zijn geïdentificeerd, past u de as aan om de lege ruimte in de grafiek te verkleinen. Selecteer het monster dat overeenkomt met het genomische DNA van de positieve controletumorweefsel om de negatieve mutant- en wilde typepoorten in te stellen, zodat de clusters verschillend en gemakkelijk te identificeren zijn. Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Alle instellingen toepassen op geselecteerde voorbeelden om de poortinstellingen voor het positieve besturingselement toe te passen op alle voorbeelden.Klik onder de grafische weergave op meerdere voorbeelden om de percelen voor alle geselecteerde voorbeelden weer te geven en de afbeelding als tif-bestand te exporteren. Selecteer vervolgens onder Werkruimte de optie Analyse exporteren en sla het geanalyseerde gegevensbestand op als een csv-bestand. Hier worden representatieve resultaten getoond voor een succesvolle detectie van een mutatie in een pre-versterkt plasma- en hersenvochtcelvrij DNA van twee kinderen met diffuse midlineglinomen.In dit experiment kan een duidelijke scheiding tussen de mutant en wild type clusters worden waargenomen langs respectievelijk de x- en y-as. Robuuste wild type clusters geven aan dat de cel vrije DNA-extractie succesvol was omdat template DNA aanwezig is. Voor deze patiënten vertonen de mutantclusters een mutatiealllic frequentie van 1,6 en 39,32 procent voor respectievelijk de plasma- en hersenvochtmonsters in overeenstemming met de tumormutatiestatus, zoals bevestigd door genomische analyse van het gebiopte tumorweefsel.De negatieve controle aan de andere kant toont nul mutant en nul wilde type druppels die erop wijzen dat er geen verontreiniging van de PCR reactie mengsel. De positieve controle tumor weefsel genomic DNA toont de mutatie wordt gedetecteerd op de verwachte alllic frequentie voor de specifieke tumor monster geselecteerd. De afwezigheid van mutatiedetectie in het plasma kan niet nodig zijn, betekent dat een patiënt een wild type is voor de mutatie van belang, omdat er valse negatieven optreden.Bijvoorbeeld, bij deze patiënt, hoewel de mutatie van belang niet werd gedetecteerd, werd de mutatiestatus bevestigd door genomische analyse van het tumorweefsel. De PCR is een zeer gevoelige techniek die een frequente ontsmetting van het werkgebied en apparatuur vereist om het verkrijgen van vals-positieve gegevens te voorkomen.

detection-monitoring-tumor-associated-circulating-dna-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een protocol om een poly (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) gecoat microfilter voor een effectieve vangst en thermoresponsieve release van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) wordt gepresenteerd te benutten. Deze methode maakt het vangen van CTC uit het bloed van de patiënt en de daaropvolgende vrijlating van levensvatbare CTC voor downstream off-chip cultuur, analyses en karakterisering.

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

We presenteren een nieuwe aanpak karakteriseren van tumorcellen. We immunofluorescentie gecombineerd met DNA TL -in-situ-hybridisatie te evalueren van cellen gevangen genomen door een functionalized medische draad staat in vivo verrijken CTCs rechtstreeks uit bloed van de patiënt.

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Detectie van circulerende RNA acid (cRNA) van bloed is een unmet behoefte in klinische diagnostiek. Hier beschrijven we methoden die kenmerkend zijn voor cRNA van niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten met behulp van gevoelige en specifieke digitale polymerase-kettingreactie. De tests voldoen aan ontwerp te detecteren fusion varianten binnen 72 uur.

Een bloed-gebaseerd testen voor de detectie van ROS1 en RET Fusion Transcripts from circulerende RNA zuur met behulp van digitale Polymerase-kettingreactie

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor niet-invasieve vloeibare biopsietechniek, waaronder bloedafname, plasma- en buffy coatscheiding, cfDNA- en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten

De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.

Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.

Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Leer tumor-geassocieerde mutaties detecteren in circulerend DNA uit patiëntbiovloeistoffen met behulp van droplet digital PCR. Deze niet-invasieve methode maakt longitudinale monitoring van tumor dynamiek mogelijk.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Meer video's verkennen