Name: Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer een structurele complementatie-assay voor het monitoren van GPCR-β-arrestin-interacties in levende cellen. Deze methode versnelt geneesmiddelenontdekking en biedt inzicht in receptorfarmakologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van het onderzoeksprogramma (NRF-2015M3A9E7029172) van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschappen, ICT en toekomstige planning.

1. ontwerp strategie voor primer
<ol><li>Ontwerp primers om genen van belang te introduceren in pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren.</li>
	<li>Selecteer ten minste één van deze drie locaties als een van de twee unieke beperkings enzymen die nodig zijn voor richtings klonen vanwege de aanwezigheid van een in-frame stop codon die de multicloning-site verdeelt zoals weergegeven in Figuur 111.</li>
	<li>Neem de nucleotide sequentie op in de primers zoals weergegeven in tabel 1 om de linker residuen te coderen zoals weergegeven in rood in tabel 211.</li>
	<li>Voor pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] vectoren, zorg ervoor dat de 5 ́ primer een ATG codon en een krachtige Kozak consensussequentie (GCCGCCACC) bevat.</li>
	<li>Voor pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren, zorg ervoor dat de 3 ́ primer een stop codon bevat. Notes: elke vector bevat de HSV-TK-promotor om niet-specifieke associatie te minimaliseren en experimentele artefacten te verminderen, ook elke vector heeft een expressie cassette voor ampicillaire resistentie bij bacteriën.</li>
</ol>2. PCR
<ol><li>Instellen en uitvoeren van PCR-reacties om te versterken het insert DNA van het gen van belang met behulp van de primers ontworpen uit stap 1. Het is belangrijk om een high-fidelity DNA-polymerase te gebruiken om mutaties te minimaliseren.</li>
	<li>Gebruik exact de volgende volgorde om 50 μL PCR-reactie te bereiden. Voeg 35,5 μL gedistilleerd water, 5 μL 10 x polymerase buffer, 5 μL dNTP-mengsel (2,5 mM per stuk), 1 μL plasmide sjabloon (200 ng/μL), 1,25 μL voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM) en 1 μL High-Fidelity polymerase (5 U/μL) toe.</li>
	<li>Met behulp van een Thermocycler het volgende DNA-versterkings programma instellen.<ol>
<li>Denature bij 95 °C gedurende 5 min.</li>
		<li>Herhaal 25 keer de volgende thermische cyclus: 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 minuut, 72 °C gedurende 2 minuten per 1 KBP om te worden versterkt.</li>
		<li>Voer een laatste verlenging uit bij 72 °C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Houd de monsters bij 4 °C binnen de Thermocycler. Opmerking: het wordt ten zeerste aanbevolen om een high-fidelity polymerase te gebruiken om puntmutaties te minimaliseren, vooral die zich voordoen tijdens de versterking van lange sequenties. Naarmate de ampliconlengte voor temp langer wordt, neemt de mate van nauwkeurigheid bij de replicatie van het DNA af. Voor de PCR-reactie, kies de gloeien temperatuur op basis van de smelttemperatuur van de regio waar de oligos direct hybridiseren met de DNA-template en niet met alle volgorde van de primer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR-product zuivering<ol>
<li>Isoleer het PCR-product uit de rest van de PCR-reactie met behulp van een Kit van een fabrikant van voorkeur12. Het PCR-product is nu klaar voor een beperking van de spijsvertering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNA-spijsvertering
<ol><li>Voor de PCR-product bereiding wordt 50 μL van de digestie reactie als volgt bereid.<ol>
<li>Voeg met een tube van 1,5 mL 12 μL gedistilleerd water toe.</li>
		<li>Voeg 5 μL 10x buffer toe met de beste compatibiliteit met beide restrictie enzymen.</li>
		<li>Vanaf stap 2,4 Voeg 30 μL PCR-product toe</li>
		<li>Voeg ten slotte 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe.</li>
		<li>Meng kort door Vortex en inincuberen bij 37,5 °C 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de ontvanger plasmide spijsvertering bereiden 50 μL van de spijsvertering reactie als volgt:<ol>
<li>Voeg met een tube van 1,5 mL 23 μL gedistilleerd water toe.</li>
		<li>Voeg 5 μL 10x buffer toe met de beste compatibiliteit met beide restrictie enzymen.</li>
		<li>Voeg 15 μL van het recipiënte plasmide (200 ng/μL) toe.</li>
		<li>Voeg 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe.</li>
		<li>Meng kort door Vortex en inincuberen bij 37,5 °C 's nachts. Opmerking: het is belangrijk om 3 μg van het recipiënte plasmide te gebruiken om voldoende materiaal te verkrijgen na de reiniging van de DNA-agarose gel. Het is ook relevant om DNA-digestons 's nachts te laten met behulp van beide enzymen om een hoge kloon efficiëntie te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. reiniging en klonen van DNA-agarose gel
<ol><li>Bereid een 1% agarose gel voor het uitvoeren van de verteerde DNA plasmide en inserts en doorgaan met het snijden van de bijbehorende bands. Zodra de corresponderende vector en insert bands zijn purified12, bepaal de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>Voer DNA-ligatie uit om de wisselplaat aan de ontvangende plasmide te smelten.</li>
	<li>Bereid ligatie reacties van ongeveer 100 ng totaal DNA inclusief 50 ng plasmide vector.</li>
	<li>Instellen van de ontvanger plasmide-insert ratio van ongeveer 1:3; het kan worden berekend met behulp van een vector-insert Calculator13.</li>
	<li>Negatieve controles parallel instellen. Bijvoorbeeld, een ligatie van het recipiënte plasmide DNA zonder enige toevoeging geeft informatie over hoeveel achtergrond van onverteerde of zelfdragende recipiënte plasmide aanwezig is.</li>
</ol>5. transformatie van klonen
<ol><li>Plaats een buis van DH5α bevoegde cellen uit de vriezer bij-80 °C en breng het onmiddellijk over op ijs gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Neem na die tijd 55 μL van DH5α bevoegde cellen en voeg 4 μL ligatie reactie toe en meng door de buis te flikken en op ijs te bewaren voor 45 min.</li>
	<li>Plaats de buis in een waterbad eerder opgewarmd op 42 ° c voor precies 48 s en onmiddellijk krijgen de buizen terug op ijs voor nog eens 3 min.</li>
	<li>Voeg 600 μL Luria Bouillon (LB) medium eerder opgewarmd bij 37,5 °C en incuberen met 1 uur schudden bij 200 rpm.</li>
	<li>Breng 200 μL over in een agar-plaat met ampicilinin 100 μg/mL en verdeel zachtjes over het oppervlak met de vloeistof meestal geabsorbeerd.</li>
	<li>Incuberen de platen 's nachts om de kolonies volgende ochtend te zien. De ontvangende plasmide op de insert Plate moet significant meer kolonies hebben dan de ontvangende plasmide alleen plaat.</li>
</ol>6. isolatie van het afgewerkte plasmide
<ol><li>Kies 3-10 individuele bacteriële kolonies en breng in 1 mL LB medium dat ampicilinebevattende (100 μg/mL) bevat en inincuberen gedurende 6 uur.</li>
	<li>Neem 200 μL bacteriële suspensie en breng over naar 5 ml lb-medium dat dezelfde concentratie ampicilinegehalte bevat als in stap 6,1, en incubeer 's nachts bij 37,5 °c met schudden bij 200 rpm.</li>
	<li>Gebruik een miniprep DNA Kit zuivering, uitvoeren miniprep DNA-zuiveringen met behulp van 5 mL LB geteeld 's nachts volgens de instructies van de fabrikant14.</li>
	<li>Om succesvolle ligaties te identificeren, stelt u PCR-reacties op dezelfde manier in als in sectie 2 met behulp van het DNA dat is verkregen uit stap 6,3 als een sjabloon met dezelfde primers als in punt 2 tijdens de eerste PCR. Positieve klonen zullen PCR-producten produceren met de overeenkomstige grootte.</li>
	<li>Na grote prep DNA zuivering van de positieve klonen, voeren een diagnostische beperking vertering van 500 ng van gezuiverd DNA met de enzymen gebruikt tijdens de kloon stap en voer de verteerde producten op een 1% agarose gel. Er moeten twee bands zijn: één van de grootte van de vector en één van de grootte van de nieuwe insert.</li>
	<li>Controleer de construct volgorde door sequentiëren met behulp van de volgende primers: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' en reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '. Opmerking: wanneer DNA wordt gerepliceerd met behulp van PCR, is er altijd de mogelijkheid van fouten tijdens de versterking zelfs bij het gebruik van een high-fidelity polymerase, daarom is het zeer belangrijk om de volgorde van de laatste constructies.</li>
</ol>7. transfectie en eiwit expressie
<ol><li>In een eerder poly-L-lysine-gecoate witte 96 goed plaat, voer celseeding één dag vóór transfectie op 2,5 x 104 cellen per goed met behulp van dulbecco's gemodificeerde eagle's medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml Penicillaire G, en 100 μg/ mL streptomycine.</li>
	<li>Gebruik alleen de 60 binnenste putjes om het potentieel voor thermische hellingen over de plaat en de randeffecten van verdamping te minimaliseren. Voeg 200 μL steriel gedestilleerd water toe aan de 36 buiten putten en 150 μL in de ruimten tussen putjes en inincuberen gedurende een nacht bij 37,5 °C en 5% van CO2.</li>
	<li>De volgende ochtend voeren transfectie met behulp van 100 ng van totaal DNA (50 ng elke construct).</li>
	<li>Stel vier verschillende plasmide combinaties (receptor: β-vanger) in volgens Figuur 2b.</li>
	<li>Gebruik voor elke plasmide combinatie 20 μL gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES met 0,3 μL lipidische transfectiereagens per put.</li>
	<li>Voeg 20 μL lipidische transfectiereagens-DNA-mengsel toe aan elk goed en meng de plaat in cirkels gedurende 10 sec.</li>
	<li>Verander vers medium na 6 uur incubatie bij 37,5 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Incuberen de plaat voor 24 uur bij 37,5 °C en 5% CO2.</li>
</ol>8. monitoring receptor-β-arrestin1/2 interacties in HEK293 cellen
<ol><li>Aspirate medium en voeg 100 μL gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES aan elk goed en laat de plaat stabiliseren bij RT voor 10 min.</li>
	<li>Bereid het furimazine substraat door 1 volume van 100x substraat te combineren met 19 volumes van LCS verdunnings buffer (een 20-voudige verdunning)11, waardoor een 5x voorraad wordt gemaakt om te mengen met celkweekmedium.</li>
	<li>Voeg 25 μL 5x furimazine toe aan elk goed en meng in kringen zachtjes gedurende 10 sec.</li>
	<li>Meet de luminescentie gedurende 10 minuten voor signaal stabilisatie bij RT. Opmerking: door het gebruik van dit basislijn signaal om de respons van elk goed te normaliseren, zal het bijdragen aan het verminderen van variabiliteit veroorzaakt door verschillen in het aantal cellen per put, ook verschillen in Transfectie-efficiëntie, enz. Eenmaal berekend, gemiddelde de genormaliseerde reactie van repliceren putten voor een bepaalde medicamenteuze behandeling.</li>
	<li>Bereid 13,5 x ligand-oplossing in gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES.</li>
	<li>Voor experimenten bij kamertemperatuur met 10 μL 13,5 x ligand toevoeging, voeg de verbindingen met behulp van injectoren of een multichannel pipet en meng de plaat met de hand of met behulp van een rondschudder (20 s bij 200 rpm).</li>
	<li>Voor experimenten met 37,5 °C met 10 μL 13,5 x ligand toevoeging, gebruik injectoren om verbindingen te doseren en meng met behulp van het instrument orbitale Shaker. In het geval van het niet gebruiken van injectoren, verwijder de plaat van de luminometer, voeg de liganden en meng de plaat met de hand of met behulp van een rondschudder (20 s bij 200 rpm). Opmerking: gebruik injectoren en een shaker binnen het detectie-instrument om temperatuurschommelingen bij het verwijderen van de plaat van de luminometer te minimaliseren. Voor deze test kunnen standaard lichtmeters worden gebruikt. Gebruik een integratie tijd van 0,25 – 2 sec.</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Met behulp van de hier gepresenteerde methode kunnen interacties tussen GPCR en β-arrestin1/2 worden bewaakt in real time levende systemen met deze GPCR-β-vanger in structurele complementatie test. In dit verband waren we in staat om de differentiële β-vanger in de rekrutering tussen de twee β--vanger-isovormen te observeren door de GLP-1R (een prototypische klasse B GPCR), we observeerden ook een dissociatie van de receptor-β-vanger in complex enkele minuten na het bereiken van de maximale lichtgevende signaal.
<p c...

Gpcrs vertegenwoordigen het doel van bijna 35% van de huidige drugs in de markt1,2 en een duidelijk begrip van hun farmacologie is cruciaal in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische geneesmiddelen3. Een van de belangrijkste aspecten bij de ontdekking van GPCR-geneesmiddelen, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling van partijdige agonisten, is de karakterisering van roman liganden naar receptor-β-dein interacties4 -en β-dein interacties met andere cytosolische eiwitten, zoals Als clathrin5.
Er is gedocumenteerd dat de afhankelijke signalering van β-vanger een belangrijke rol speelt bij neurologische aandoeningen zoals bipolaire stoornis, ernstige depressie en schizofrenie6 en ook ernstige bijwerkingen in sommige medicijnen zoals morfine7.
De huidige methoden die worden gebruikt om deze interacties te bewaken, vertegenwoordigen meestal niet de werkelijke endogene niveaus van de eiwitten in studie, in sommige gevallen vertonen ze een zwak signaal, fotobleaching en afhankelijk van de GPCR kan het technisch lastig zijn om8in te stellen. Deze roman Structural complementatie test maakt gebruik van lage expressie Promoter vectoren om endogene fysiologische niveaus na te bootsen en biedt een hoge gevoeligheid in vergelijking met de huidige methoden9. Met behulp van deze aanpak, was het mogelijk om te karakteriseren Galanin receptor-β-arrestin1/2 en ook β-arrestin2-clathrin interacties10. Deze methodologie kan op grote schaal worden gebruikt voor elke GPCR van bijzonder belang waar β-vanger een belangrijke fysiologische functie speelt of de signalering relevant is bij sommige ziekten.

<table><tbody><tr><td>Antibiotics penicillin streptomycin</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td><td>Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>Bacteria Incubatie Apparaat</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td></tr><tr><td>Celcultuur medium</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM Celcultuur Medium</td></tr><tr><td>Celcultuur transfectie medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X celcultuur medium</td></tr><tr><td>CO2 Incubatie Apparaat</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>Direct Heat CO2 Incubatie Apparaat</td></tr><tr><td>Digitaal waterbad</td><td>Lab Tech</td><td>LWB-122D</td><td>Digitaal waterbad lab tech</td></tr><tr><td>DNA Polymerase proofreading</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU DNA polymerase</td></tr><tr><td>DNA zuiveringskit</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td></tr><tr><td>DNA Taq Polymerase</td><td>Enzynomics</td><td>P750</td><td>nTaq DNA polymerase</td></tr><tr><td>Enzyme restrictie BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>Enzyme restrictie buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X Buffer</td></tr><tr><td>Enzyme restrictie EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>Enzyme restrictie NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>Enzyme restrictie XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco Canada</td><td>12483020</td><td>Fetaal bovien serum</td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td>CKX53 Microscoop Olympus</td></tr><tr><td>Lipide transfectiere reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Biotek/Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td></tr><tr><td>NanoBiT Systeem</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS Starter Systeem</td></tr><tr><td>Nanoluciferase substraat</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo Live Cell assay systeem</td></tr><tr><td>PCR Thermische cycler</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Master cycler Nexus SX1</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Poly-L-lysine oplossing</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trypsine EDTA 10X</td></tr><tr><td>Witte Celcultuur 96 wel plaatjes</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>Assay Plate 96 wel plaatje</td></tr></tbody></table>

monitoren van gpcr-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interacties tussen G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) en β-vanger zijn vitale processen met fysiologische implicaties van groot belang. Momenteel is de karakterisering van nieuwe geneesmiddelen naar hun interacties met β-vanger en andere cytosolische eiwitten zeer waardevol op het gebied van GPCR-geneesmiddelen ontdekking, met name tijdens de studie van GPCR-bevooroordeeld agonisme. Hier tonen we de toepassing van een nieuwe structurele complementatie test om nauwkeurig de receptor-β-vanger in interacties in real time levende systemen te bewaken. Deze methode is eenvoudig, nauwkeurig en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar elke GPCR van belang en ook heeft het voordeel dat het overkomt onspecifieke interacties als gevolg van de aanwezigheid van een lage expressie promotor aanwezig zijn in elk vector systeem. Deze structurele complementatie test biedt belangrijke kenmerken die een nauwkeurige en nauwkeurige controle van receptor-β-vanger interacties mogelijk maken, waardoor het geschikt is in de studie van bevooroordeeld agonisme van elk GPCR-systeem en GPCR c-Terminus ' fosforylering codes ' geschreven door verschillende GPCR-kinases (GRKs) en post-translationele modificaties van afvallen die het receptor-β-afradercomplex stabiliseren of destabiliseren.

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure werden de interacties tussen een prototypische GPCR en twee β-vanger-isovormen gemonitord. Glucagon zoals Peptide Receptor (GLP-1R) constructies werden gemaakt met behulp van primers met NheI en EcoRI enzym restrictie sites en gekloond in de vectoren pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] terwijl in het geval van β-vanger, twee extra vectoren werden gebruikte pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] met behulp van enzym beperkings sites BgIII en EcoRI in het g...

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Dit protocol heeft een hoge impact op het gebied van drugsontdekking en -ontwikkeling, vooral bij de ontwikkeling van nieuwe, eersteklas geneesmiddelen met minimale bijwerkingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast op elk GPCR-systeem, en gebruikt om nauwkeurige informatie over receptor farmacologie te verkrijgen in real-time levende systemen. De implicaties van deze techniek houden nauw verband met nieuwe therapieën, met name wanneer bèta-arrestines relevant zijn.Deze omvatten opiod receptoren in pijn en dopamine receptoren bij schizofrenie. Deze methode kan nuttig zijn in veel medische wetenschappelijke onderzoeksgebieden, van neurologie tot cardiopulmonale ziekte. PCR demonstratie van onze methode is belangrijk, omdat het zorgt voor een gedetailleerde presentatie van de kritische stappen in het protocol, die niet mogelijk zou zijn met conventionele publicatie.Begin met het ontwerpen van primers om genen van belang te introduceren in de pBiT vectoren. Als gevolg van de inframe stop codon die de multi-klonen site verdeelt, selecteert u ten minste een van de drie sites als een van de twee unieke beperking enzymen die nodig zijn voor directionele klonen. Raadpleeg het manuscript voor nucleotidesequenties om de linkerresten te coderen en in de primers op te nemen.Voor de pBiT1.1-C en pBiT2.1-C zorg ervoor dat de voorwaartse primer een ATG codon en een krachtige Kozak consensus sequentie bevat. Voor de pBiT1.1-N en pBiT2.1-N moet u ervoor zorgen dat de omgekeerde primer een stopcodon bevat. Gebruik de ontworpen primers om het invoeg-DNA van het gen van belang te versterken.Combineer de PCR-reagentia volgens de handschriftaanwijzingen, zorg ervoor dat u een high-fidelity DNA polymerase gebruikt om mutaties te minimaliseren. Programmeer de thermocycler en start de reactie. Na het voltooien van PCR, verteren het product in een 50-microliter spijsvertering reactie.Combineer in een buis van 1,5 milliliter 12 microliter gedestilleerd water, vijf microliter van de juiste 10x beperkingsverteringsbuffer en 30 microliter van het PCR-product. Voeg vervolgens 1,5 microliter van elk beperkingsenzym toe. Vortex het reactiemengsel.En broeden 's nachts op 37,5 graden Celsius. Bereid een tweede reactie voor om de ontvanger plasmide te verteren. In een buis van 1,5 milliliter, combineren 23 microliter water, vijf microliters van de juiste 10X beperking spijsvertering buffer, 15 microliter van de ontvanger plasmid, en 1,5 microliter van elke beperking enzym.Meng de buis kort. En broeden 's nachts op 37,5 graden Celsius. Op de dag na het klonen en de transformatie, kies drie tot 10 individuele bacteriële kolonies en breng ze over naar een milliliter LB-medium met ampicilline.De cellen zes uur uitbroeden. En breng vervolgens 200 microliter bacteriële suspensie over naar vijf milliliter vers LB-medium met ampicilline. Incubeer de cultuur op 37,5 graden Celsius met schudden op 200 rpm 's nachts.Op de volgende dag, isoleren van de plasmid met een mini-prep DNA-zuivering kit. Scherm de gezuiverde plasmide voor een succesvolle ligatie met PCR. Een dag voor de transfectie, zaad van de cellen op een poly-L-lysine gecoate 96-put plaat met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium aangevuld met 10% foetale runder serum, 100 eenheden per milliliter penicilline G, en 100 microliter per milliliter streptomycine.Voeg alleen cellen toe aan de 60 binnenste putten om het potentieel voor thermische gradiënten over de plaat en randeffecten van verdamping te minimaliseren. Voeg 200 microliter steriel gedestilleerd water toe aan de 36 buitenputten en 150 microliter in de ruimtes tussen de putten. Dan incubeer de plaat 's nachts op 37,5 graden Celsius en 5% kooldioxide.Op de volgende dag, uitvoeren van transfectie met behulp van een totaal van 100 nanogram DNA. Stel vier verschillende plasmidecombinaties op volgens manuscriptrichtingen. Met behulp van 20 microliters van gemodificeerde Eagle's minimale essentiële media gebufferd met HEPES, en 0,3 microliter van lipidische transfectie reagens per goed.Voeg 20 microliters lipidische transfectie reagens en DNA-mengsel aan elke put, en meng de plaat in cirkels gedurende 10 seconden. Broed de plaat zes uur lang in op 37,5 graden Celsius en 5%kooldioxide. Vernieuw het medium.En nog 24 uur uitbroeden. Na de incubatie, aspirate het medium en voeg 100 microliters van gemodificeerde Eagle's minimale essentiële media gebufferd met HEPES aan elke put. Laat de plaat 10 minuten stabiliseren bij kamertemperatuur.Bereid ondertussen het furimazine substraat voor door één volume van het 100X substraat te combineren met 19 volumes LCS verdunningsbuffer, waardoor een 5X-voorraad ontstaat om te mengen met het celkweekmedium. Wanneer de cellen klaar zijn, voeg 25 microliter van de voorraad aan elke put, en meng voorzichtig de plaat gedurende 10 seconden. Meet vervolgens de luminescentie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voor signaalstabilisatie.Voor experimenten met ligand toevoeging, bereid de 13.5X ligand oplossing in gemodificeerde Eagle's minimale essentiële media gebufferd met HEPES, en voeg 10 microliters per goed met behulp van een multichannel pipet. Meng vervolgens de plaat met de hand of met een orbitale shaker. Dit protocol is met succes gebruikt om interacties tussen een prototypische GPCR en twee bèta-arrestine isovormen te bestuderen.Vier verschillende plasmidecombinaties werden gescreend, en één met het hoogste luminescente signaal werd geselecteerd voor verdere experimenten. De EC50-waarden voor elke bèta-arrestine-isovorm werden bepaald aan de hand van dosisresponscurven, die werden verkregen uit de maximale respons van elke concentratie uit kinetische studies. Het is van cruciaal belang om speciale aandacht te besteden bij het ontwerpen van de PCR primers.De ontwikkeling van de juiste constructies is essentieel voor het succes van deze testen. Volgens deze methodologie u receptor-bèta-arresten in interacties monitoren, evenals receptorinteracties met andere cytosolische eiwitten. Deze methodologie zal helpen om fundamentele vragen op het gebied van GPCR farmacologie te beantwoorden door te bestuderen hoe GPCR-bèta-arrestine interacties kunnen worden gemoduleerd door wijzigingen in de ligand structuur.

monitoring-gpcr-arrestin12-interactions-real-time-living-systems-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Eenvoudige methoden om de selectieve activering van G-eiwitten door G-eiwit-gekoppelde receptoren te detecteren, blijven een grote uitdaging in celsignalering. Hiervoor zijn Fӧrster resonantie-energieoverdracht (FRET) biosensoren ontwikkeld door een GPCR paarsgewijs vast te maken aan G-eiwitpeptiden om conformationele veranderingen te onderzoeken bij gecontroleerde concentraties in levende cellen.

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.

Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via de S1P-receptoren (S1PR's) subfamilie. Hier wordt een pijplijn beschreven om de structuren en functie van S1PR's uit te leggen.

Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Dit protocol beschrijft het gebruik van op BRET gebaseerde biosensoren voor real-time meting van G-eiwitactivering in levende HEK293-cellen bij G-eiwitgekoppelde receptorligandstimulatie. Hier dienen de β2-adrenerge receptor en cannabinoïde type 1-receptor als voorbeeld om de efficiëntie van sensoren voor verschillende G-eiwitsubtypes en voor verschillende GPCR's aan te tonen.

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

Leer een structurele complementatie-assay voor het monitoren van GPCR-β-arrestin-interacties in levende cellen. Deze methode versnelt geneesmiddelenontdekking en biedt inzicht in receptorfarmakologie.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Meer video's verkennen