Name: Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer een verbeterde EGFP-gebaseerde assay voor het bestuderen van neurietuitgroei in embryonale ratcorticale neuronen. Deze methode verhoogt transfertie-efficiëntie en ondersteunt onderzoek naar neurale regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door fondsen van de Raad voor onderzoeksbeurzen Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), cuhk direct subsidie Scheme, het United College begiftiging Fund en de tuyf liefdadigheid Trust.

Alle gevolgde procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van het ethische comité dier experimenten van de Chinese Universiteit van Hongkong.
1. voorbereiding van de Dekstroken
<ol><li>Plaats een steriele 18 mm circulaire afdek in elke put van een 12-well weefselkweek plaat.</li>
	<li>Mantel de dekslip met 5 μg/mL poly-D-Lysine oplossing in een bevoficeerde 37 °C incubator gedurende ten minste 1 uur.</li>
	<li>Aspireren de poly-D-Lysine-oplossing van de weefselcultuur plaat en spoel de gecoate dekstroken eenmaal met steriel water.</li>
</ol>2. rat embryonale neuron dissectie
<ol><li>Offer een getimede-zwangere Sprague-Dawley rat op een zwangerschaps leeftijd van 18 dagen (E18) door beide cervicale dislocatie of CO2 asphyxiation. Opmerking: Controleer de lokale regelgeving voor het offeren van zwangere ratten.</li>
	<li>Open de buikholte van de zwangere rat met ontleed schaar en breng de baarmoeder over naar een 10 cm Petri schaaltje.</li>
	<li>Open de baarmoeder en de amniotische zak voorzichtig met een kleine ontleed schaar en verwijder de placenta van het embryo van de rat met behulp van een kleine ontleed schaar. Breng het hele embryo over in een 10 cm Petri schaaltje met voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met glucose (PBS-glucose, 10 mM natrium fosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride en 3 g/L glucose) met behulp van een paar kleine Tang.</li>
	<li>Snijd langs het sagittale hecht deel van de schedel en open het zorgvuldig met een paar kleine ontleden schaar. Breng het embryonale brein over met een kleine platte spatel naar een 10 cm Petri schaaltje met ijskoude PBS-glucose.</li>
	<li>Scheid de twee hersenhelften van het cerebellum en de hersenstam met behulp van twee #5 pincet onder een dissectie Microscoop. Opmerking: Raadpleeg referentie12 voor de structuur van de hersenen van de rat.</li>
	<li>Verwijder de hersenvliezen met de #5 pincet.</li>
	<li>Isoleer de cortex van de hersenhelften met twee rechte #5 pincet.</li>
	<li>Breng de geïsoleerde cortex over naar ijskoude PBS-glucose in een 15 mL centrifugebuis.</li>
</ol>3. primaire corticale neuron cultuur
Opmerking: Alle procedures in stap 3 en 4 worden uitgevoerd in een klasse II Biosafety Cabinet.
<ol><li>Plaats de geïsoleerde cortex gedurende 5 minuten op 4 °C en zuig de PBS-glucose op.</li>
	<li>Voeg 1 mL 0,05% trypsine-EDTA toe aan de geïsoleerde cortex en meng zachtjes door het weefsel gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C te tikken en te inbroed om enzymatische spijsvertering mogelijk te maken. Tik de buis zachtjes om de 2 minuten te mengen.</li>
	<li>Voeg 4 mL onderhouds medium (bijv. Neurobasal medium) toe aan het weefsel/trypsine-mengsel. Opmerking: Al het onderhouds medium dat in dit protocol wordt gebruikt, wordt aangevuld met Penicillair-streptomycine en B-27 supplement13.</li>
	<li>Dissociëren het weefsel zachtjes door trituratie met behulp van een 1 mL pipet.</li>
	<li>Pellet de gedissocieerde cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3,5 tot en met 3,7 tweemaal.</li>
	<li>Respendeer de celpellet in 1 mL onderhouds medium.</li>
	<li>Voeg 10 μL 0,4% Trypeen blauwe oplossing toe aan een celsuspensie van 10 μL voor het tellen van levensvatbare cellen met een hemocytometer.</li>
	<li>Plaat de neuronen met een dichtheid van 65.000/cm2 (levensvatbare cellen) in 1 ml onderhouds medium per put in een 12-well plaat.</li>
</ol>4. celtransfectie en fixatie
<ol><li>Na 2 dagen in vitro (DIV2), transfect 0,5 μg EGFP construct (pEGFP-C1) samen met of zonder van 0,5 μg NP met behulp van 1 μL transfectie reagens (bijv. Lipofectamine 2000). Gebruik de instructies van de fabrikant. Opmerking: De uitdrukkings constructies voor zoogdieren werden bereid met behulp van een endotoxine gratis plasmide voorbereidings Kit. Behandeling met chemicaliën/moleculen (in dit manuscript cytochalasin D (CYTO D) en zenuw groeifactor (NGF) werden gebruikt) kan worden gedaan om 6 h na transfectie.</li>
	<li>Aspirate de cultuurmedium 24 h post-transfectie en was de getransfunde cellen eenmaal met 37 ° c PBS (10 mM natrium fosfaten, 2,68 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride).</li>
	<li>Repareer de cellen met 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de vaste cellen drie keer met PBS.</li>
	<li>Voeg een minimale hoeveelheid fluorescentie-bevestigings medium toe op een Microscoop-glas glijbaan. Breng het afdekplaatje voorzichtig over van de 12-put plaat op het afdekmedium met het monster naar de glazen glijbaan. Opmerking: Sluit de rand van de Afdeklijst af met nagellak als er een waterig afdekmedium wordt gebruikt.</li>
</ol>5. meting van de neuriet uitgroei
<ol><li>Gebruik een 40x doelstelling voor het vastleggen van beelden met een epi-fluorescerende Microscoop.</li>
	<li>Leg beelden vast van ten minste 40 intact neuronen met EGFP-signaal per trans fectie.</li>
	<li>Open het vastgelegde beeld in imagej-software met de neuronj-plugin11 om de lengte van de langste neuriet te meten, van het cellichaam tot het puntje van de groei kegel, van elk afbeelding gemaakt neuron.</li>
	<li>Analyseer de gegevens die zijn verkregen met de software om het effect van de beoogde eiwitten in neuriet uitgroei te bepalen.</li>
</ol>

<ol><li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system%3A+Lessons+from+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li>
<li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li>
<li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li>
<li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li>
<li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li>
<li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain%3A+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li>
<li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth%3A+roles+of+microfilaments+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li>
<li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li>
<li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li>
<li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18(2010).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation%2FReoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li>
<li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).</li>
<li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+advanced+glycation+end+products+%28RAGE%29--soluble+form+%28sRAGE%29+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Investigation%22%5BJournal%5D)">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li>
<li>Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRadbruch%2C+A+%22Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%22">Flow Cytometry and Cell Sorting</a>. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).</li>
<li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li>
<li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899(2013).</li>
<li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+%28hiPSC%29-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.

Zoals eerder vermeld, PC12 en de subclones worden op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neurite uitbreiding omdat ze uitstekende transfectie efficiëntie2,3. In tegenstelling, primaire neuronen hebben een lage transfectie tarief, dat is een groot obstakel voor het bestuderen van neuriet uitgroei regulators door transfectie7. Hier beschrijven we een handig protocol voor het kwantificeren van neuriet uitgroei in primaire neuronen. ...

Neurites, met inbegrip van zowel axonen en dendrites, zijn de projecties van neuronen die betrokken zijn bij de oprichting van de neurale netwerken. De dynamische uitgroei van neurites is essentieel voor neuro ontwikkeling. De onderliggende regelgevings mechanismen eronder blijven echter onduidelijk. In het bijzonder, neuriet schade wordt vaak waargenomen in verschillende neurodegeneratieve ziekten en na hersenletsel1. Daarom zou onderzoek naar de rollen van putatieve moleculen in verschillende neuriet uitgroei regelgevende trajecten ons begrip van het proces verbeteren. Bovendien, het kan onthullen nieuwe therapeutische doelen voor verschillende neurologische aandoeningen. Neuronale cellijnen zijn waardevolle modellen voor het bestuderen van neuronale processen met inbegrip van neuriet uitgroei als ze zijn gemakkelijk te manipuleren en transfect2,3. Echter, genetische drift is gemeld te voorkomen in sommige veelgebruikte cellijnen, die kunnen leiden tot variaties in hun fysiologische reacties4. Bovendien is differentiële eiwit expressie aangetoond tussen neuronale cellijnen en primaire neuronen. Bijvoorbeeld, PC12, een neuronale cellijn afgeleid van Rat bijnier die op grote schaal wordt gebruikt voor het bestuderen van neuriet uitgroei2,3, doet niet Express NMDA receptoren5. Bovendien is voorgesteld dat de verminderde responsiviteit van de muis neuroblastoom lijn neuro-2a naar neurotoxines in vergelijking met primaire neuronen is te wijten aan het gebrek aan expressie van bepaalde membraan receptoren en ionenkanalen6. Daarom, primaire neuronen zijn een meer wenselijk en representatief model voor het onderzoek van neuriet uitgroei. Echter, het gebruik van primaire neuronen wordt belemmerd door hun lage transfectie-efficiëntie7.
Hier beschrijven we een methode waarbij de co-transfectie van het eiwit van belang (POI) en EGFP aan primaire rat corticale neuronen. De EGFP fungeert als een morfologische marker voor de identificatie van succesvol getransfunde neuronen en maakt de meting van neurites mogelijk. We gevalideerd deze methode met behulp van verbindingen/moleculen die zijn gemeld aan het moduleren van neuriet uitgroei. Bovendien, FE65, een neuronale adapter eiwit dat is aangetoond dat het stimuleren van neuriet uitgroei, werd gebruikt ter illustratie van deze aanpak8,9. Dit protocol omvat (1) de isolatie van primaire corticale neuronen van embryonale dag 18 (E18) Rat embryo's, (2) de co-transfectie van neuronen met EGFP en de POI (FE65 in deze studie) en (3) de beeldvorming en analyse van de neuronen met behulp van de beeldverwerking software ImageJ met de NeuronJ plugin10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 tweezers</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circle Cover Slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>Sterilizeer voor gebruik</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>Opgelost in DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Mounting Medium</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>Zie a.u.b. verwijzingen 8 en 15</td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neuriet uitgroei is een fundamenteel voorval in de vorming van de neurale circuits tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Ernstige neuriet schade en synaptische dysfunctie optreden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en leeftijdsgebonden degeneratie. Onderzoek van de mechanismen die neuriet uitgroei reguleren zou niet alleen waardevolle licht werpen op de ontwikkeling van de hersenen processen, maar ook op dergelijke neurologische aandoeningen. Vanwege de lage transfectie-efficiëntie is het momenteel uitdagend om het effect van een specifiek eiwit op neuriet uitgroei in primaire zoogdieren neuronen te bestuderen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het onderzoek naar neuriet uitgroei door de co-transfectie van primaire rat corticale neuronen met EGFP en een eiwit van belang (POI). Deze methode maakt de identificatie mogelijk van POI-getransfunde neuronen via het EGFP-signaal, en dus kan het effect van de POI op neuriet-uitgroei nauwkeurig worden bepaald. Deze EGFP-gebaseerde assay biedt een gemakkelijke aanpak voor het onderzoek van trajecten reguleren van neuriet uitgroei.

Om deze methodologie te testen, we gebruikten cyto D en zenuw groeifactor NGF, die is aangetoond dat remt en stimuleren van neuriet uitgroei respectievelijk14,15,16. De neuriet lengte van neuronen getransffecteerd met EGFP werden gemeten na behandeling met cyto D of NGF. De transfectie-efficiëntie van EGFP naar de neuronen was 2,7% (1.068 neuronen geteld). Zoals getoond in Fi...

In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bestuderen van neuriet uitgroei in embryonale rat corticale neuronen door co-transfecting met EGFP en het eiwit van belang.

Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Lage transfectie-efficiëntie is een belangrijk obstakel om te bepalen hoe eiwit neurietuitgroei in primaire neuronen reactiveert. Ons protocol heeft dit probleem opgelost door mede-transfectie van EGFP om met succes transfected cellen te identificeren. De hoge co-transfectie snelheid van EGFP en de eiwitten van belang zorgt voor de nauwkeurigheid van de test.En daarom is nu immunofluorescentievlekken nodig. Aangezien neuriet ontgroeiing optreedt tijdens neurale regeneratie, kan deze methode worden toegepast op de identificatie van nieuwe doelen voor het herstel van het beschadigde neuronale netwerk bij hersentrauma of neurodegeneratieve ziekten. Voordat u met de procedure begint, plaatst u een steriele 18 millimeter cirkelvormige coverslip in elke put van een 12 goed weefselkweekplaat en coat elke coverslip met vijf microgram per millimeter Poly-D-Lysine-oplossing in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator gedurende ten minste een uur.Aan het einde van de incubatie, aspirate de Poly-D-Lysine oplossing en spoel de coverslips met steriel water. Plaats op embryonale dag 18 de baarmoeder die is geoogst van een getimede zwangere Sprague Dawley-rat in een petrischaaltje van 10 centimeter en gebruik een kleine ontleedschaar om de baarmoeder en de vruchtzak te openen. Gebruik de schaar om de placenta te verwijderen en gebruik tangen om een heel embryo over te brengen in een nieuwe petrischaal van 10 centimeter met gekoelde PBS-glucose.Gebruik de schaar te snijden langs de sagittale hechting van de schedel en gebruik een kleine platte spatel om de embryonale hersenen over te brengen in een nieuwe 10 centimeter petrischaal met verse ijskoude PBS glucose. Met behulp van twee nummer vijf pincet en een dissectie microscoop, scheiden de twee hersenhelften van het cerebellum en hersenstam en verwijder de hersenvliezen. Isoleer vervolgens de cortex van de hersenhelften en plaats de cortex in een 15 milliliter buis met verse ijskoude PBS glucose.Voor primaire corticale neuron cultuur, in een klasse II bioveiligheid kabinet, laat de cortex te regelen door de zwaartekracht gedurende vijf minuten op vier graden Celsius voor de vervanging van de PBS glucose met 0,05% trypsine EDTA. Meng met zachte tikken en uitbroed het weefsel in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten met extra zachte tikken om de twee minuten. Aan het einde van de incubatie, stop de spijsvertering met vier milliliter onderhoudsmedium en gebruik een 1 milliliter pipet om het weefsel te scheiden met zachte trituratie.Sediment de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in een milliliter onderhoudsmedium voor een tweede centrifugatie. Resuspend de pellet gevormd na de tweede centrifugatie in een milliliter van vers onderhoud medium voor het tellen en plaat van de geïsoleerde neuronen op een 6,5 keer 10 tot de vierde levensvatbare cellen per centimeter kwadraat concentratie in een milliliter van onderhoud medium per goed in een 12 put plaat. Na twee dagen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, verdun EGFP en doel eiwit plasmid DNAs en transfectie reagens in twee afzonderlijke 1,5 milliliter buizen en meng ze samen.Transfecteer de cellen met EGFP construct door het toevoegen van de transfectie mix aan de putten. Na 24 uur was je de cellen met 37 graden Celsius PBS en bevestig ze met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de vaste cellen drie keer met verse PBS per wasbeurt en voeg een minimaal volume van fluorescentie montage medium op een microscoop glas dia per monster.Breng vervolgens de gecoate covers voorzichtig over op de montagemedia met de monsters naar de glazen glijbanen. Om de neurietgroei in beeld te brengen, selecteert u de 40X-doelstelling op een epifluorescente microscoop en klikt u op het vastleggen van beelden van ten minste 40 intacte EGFP-positieve neuronen per transfectie. Wanneer alle neurites zijn afgebeeld, open de vastgelegde beelden in ImageJ met de NeuronJ plugin en meet de lengte van de langste neurite van elk neuron van het cellichaam naar het puntje van de groeikegel.Analyseer vervolgens de gegevens verkregen met de software om het effect van de beoogde eiwitten op de groei van neuriet te bepalen. Cytochalasine D onderdrukt neurite extensie in een dosis-afhankelijke manier, terwijl neurite uitgroei wordt verbeterd in neuronen behandeld met zenuwgroei factor. Bovendien stimuleert het neuronale groeiadaptereiwit FE65 de tweevoudige onverzette neurotische uitgroei aanzienlijk in vergelijking met onverzetteerde neuronen.Ondanks een lage transfectie-efficiëntie, immunofluorescentie analyse blijkt dat meer dan 80% van een twee-daagse celcultuur kan met succes worden gecotransfected met EGFP en FE65. EGFP-expressie wordt gedetecteerd op zes uur na de transfectie, terwijl FE65 voor het eerst wordt gedetecteerd op uur 12 en beide signalen worden gedetecteerd voor maximaal zeven dagen na de transfectie. De transfectie van primaire rattencorticale neuronen met verschillende hoeveelheden FE65 plasmide DNA onthult een dosisafhankelijke toename van neurietextensie met 0 tot 0,5 microgram FE65 plasmide.Er wordt echter geen significant verschil in groei waargenomen bij neuronen die worden doorfecteel met 0,5 of een microgram van het plasmide. Bij het proberen van het protocol is het belangrijk om het juiste gebied te isoleren van de embryonale hersenen. Deze techniek kan ook worden toegepast op de studie van neurale groei in menselijke iPSC-afgeleide neuronen die waardevolle instrumenten voor regeneratieve geneeskunde hebben.

an-enhanced-green-fluorescence-protein-based-assay-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

FRAP is gebruikt om de mobiliteit van de groene fluorescentie Protein (GFP)-gemerkte eiwitten in gekweekte cellen te kwantificeren. We hebben de mobiele / immobiele fracties van de GFP onderzocht door het analyseren van de fluorescentie herstel na fotobleken percentage. In deze studie werd uitgevoerd op FRAP stekels van hippocampale neuronen.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

In this video, we describe a luminescence-based method to assess the neurotoxicity of neurite outgrowth-promoting small molecule compounds on the viability of hNPC-derived neurons. The assay measures intracellular ATP level, an indicator of cell viability, to evaluate neurotoxicity following test compound treatment.

Luminescence-Based Assay to Assess Neurotoxicity of Test Compounds on Neurons

In this video, we demonstrate an EGFP-based immunofluorescence assay to identify the efficacy of target proteins on the neurite outgrowth of primary cortical neurons. The primary neurons are transfected with a fluorescent protein, EGFP, and a target protein, and then an immunoassay is performed to investigate the effect of the target protein on neurite outgrowth.

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

Neuronale plasticiteit is een steeds meer erkend, maar onvoldoende duidelijk kenmerk van de gastro-intestinale (GI) stelsel. Hier, in het voorbeeld van menselijke pancreas aandoeningen presenteren we een in vitro assay neuroplasticiteit voor de studie van neuronale plasticiteit in het maagdarmkanaal, zowel morfologisch en functioneel niveau.

Simuleren Pancreatic Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticiteit Assay

Neuronale morfogenese en migratie zijn cruciale gebeurtenissen ten grondslag liggen aan een goede ontwikkeling van de hersenen. Hier beschrijven we methoden om genetisch manipuleren gekweekte cerebellaire granule neuronen en de ontwikkelingslanden cerebellum voor de beoordeling van de morfologie en trekkende kenmerken van neuronen.

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.

Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Leer een verbeterde EGFP-gebaseerde assay voor het bestuderen van neurietuitgroei in embryonale ratcorticale neuronen. Deze methode verhoogt transfertie-efficiëntie en ondersteunt onderzoek naar neurale regeneratie.

Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen

Meer video's verkennen