Name: Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer een kosteneffectieve methode voor TEER-metingen met een zelfgemaakte programmeerbare volt-amperemeter en chopstick-elektroden. Deze aanpak maakt betrouwbare impedantiemetingen in epitheliale monolagen toegankelijk voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Herman Liggesmeyer en Marvin bende graag bedanken voor hun deskundig advies in elektrotechniek en informatica.

1. montage van een basis-volt-Amperemeter voor TEER meting
<ol><li>Bereid een standaard USB-oplader voor als de 5 V DC-voeding, een USB-verlengsnoer, een microcontroller die zal worden gebruikt als een programmeerbare vierkante golfgenerator, twee standaard multimeters die in staat zijn om wisselstroom en spanning te meten als root mean Square ( True-RMS), vier kabels met banaanpluggen, een telefoon verlengsnoer met een RJ14 female connector, inclusief zes pinnen met de binnenste vier bedrade (6P4C), twee korte kabels, een Luster Terminal, een 120 kΩ voor weerstand, adereindferrules en soldeer lugs. De benodigde gereedschappen zijn een isolatie stripper, een krimptang en een soldeerbout.</li>
	<li>Sluit eerst de USB-extensie aan op de microcontroller-kaart.</li>
	<li>Strip de eind isolatie van twee korte kabels. Soldeer één zijde per kabel ofwel direct op de pinnen 0 en 2 van de microcontroller of op soldeer lugs, die op hun beurt op de respectievelijke pinnen worden geknipt. Krimp de andere uiteinden aan de adereindferregels en verbind ze met een glans klem zoals afgebeeld in Figuur 1.</li>
	<li>Koppel de banaanpluggen aan de multimeters. En krimp het andere uiteinde van elk van de vier kabels.</li>
	<li>Knip het verlengsnoer van de telefoon in twee delen en Demonteer en krimp de geleiders van de zijkant met de vrouwelijke connector. Controleer de continuïteit van de geleiders en pinnen.</li>
	<li>De eerste multimeter wordt gebruikt om de stroom in μA te meten (merk op dat de AC-modus expliciet moet worden ingesteld). Sluit het in een serie met een 120 kΩ voor weerstand aan pinnen vijf en zes van de RJ14 connector, overeenkomend met de buitenste elektrode paar van de Chopstick-elektrode.</li>
	<li>Koppel ten slotte de tweede multimeter, die zal worden gebruikt voor het meten van de transepitheliale voltage drop in mV, via de Luster terminal naar pinnen drie en vier van de RJ14 connector, overeenkomend met het binnenste elektrode paar van de Chopstick-elektrode.</li>
	<li>Monteer indien gewenst de installatie in een chassis.</li>
</ol>2. programmering van de microcontroller
<ol><li>Wijzig indien nodig de opgegeven broncode (aanvullend Codeer bestand 1). In de gegeven vorm, pinnen 0 en 2 wisselt tussen grond en + 5 V met 40 MS half-tijd van oscillatie. Zo wordt een vierkante Golf signaal met een amplitude van 5 V en een frequentie van ongeveer 12,5 Hz gegenereerd. De werkelijke waarden kunnen afwijken als gevolg van de onnauwkeurigheid van de tijd emitter van de microcontroller.</li>
	<li>Verbind de microcontroller met een desktopcomputer via een USB-poort en upload de broncode met bijpassende software25.</li>
</ol>3. registratie van spannings oscillogrammen (optioneel)
<ol><li>Bypass pinnen vijf en zes van de RJ14 connector met een 1 kΩ test weerstand en verbinding maken met een oscilloscoop.</li>
	<li>Controleer de frequentie, piekspanning en golfvorm. Digitaliseer en exporteer de gegevens.</li>
	<li>Indien gewenst, record oscillogrammen van een referentie-apparaat (EVOM) en de zelf-geassembleerde voltammeter ter vergelijking. Opmerking: in dit geval werden de gegevens opgenomen met een digitale opslag Scope HM 208. Omdat het een zeer elementaire digitale oscilloscoop is, kon het beeld intern worden gedigitaliseerd (bevroren), maar moest het worden getekend met een analoge PM 8143 X-Y recorder. De afbeelding is vervolgens gescand.</li>
</ol>4. celkweek en TEER meting
<ol><li>Zaad humaan choroid plexus Papilloma (HIBCPP) cellen op celkweek filter inserts met een poriegrootte van 3 μm in DMEM/F12 (Zie tabel van de materialen) met 10% foetaal kalf serum9. Kweek de cellen bij 37 °C in een verzadigde water atmosfeer met 5% CO2 , zoals beschreven door Dinner et al.9.</li>
	<li>Wanneer de filters een impedantie van 70 Ω ∙ cm2bereiken, verander dan in serum vrije DMEM/F12 en definieer het tijdpunt als dag 0.</li>
	<li>Sluit de elektrode aan op de RJ14-poort van de zelf-geassembleerde voltammeter en sluit de USB-stroomtoevoer aan. Stel de multimeters naar AC voltage mode (mV) en AC Current mode (μA), respectievelijk.<ol>
<li>U ook de elektrode aansluiten op een in de handel verkrijgbare referentie-apparaat en inschakelen volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steriliseer de elektrode in 80% ethanol gedurende 10 min en equilibreren in het juiste medium voor nog eens 10 min.</li>
	<li>Plaats de elektrode in beide compartimenten van een celcultuurfilterinvoegsysteem (het langere deel van de elektrode in het onderste compartiment en het kortere deel in het bovenste compartiment) dat een HIBCPP-cellaag bevat totdat de meetwaarden constant blijven.</li>
	<li>Voor een referentie-apparaat, noteer de impedantie direct of Bereken de impedantie volgens de wet van Ohm (R = U/I) voor de zelf-geassembleerde voltammeter. Houd er rekening mee dat de elektrode hoek de metingen beïnvloedt.</li>
	<li>Herhaal de TEER meting (stap 3 − 6) van dag 0 tot dag 4.</li>
</ol>

<ol><li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li>
<li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li>
<li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li>
<li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+%28HIBCPP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li>
<li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069(2012).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li>
<li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture%3A+expression+of+polarized+phenotype%2C+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li>
<li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture%3A+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li>
<li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells%3A+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li>
<li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture%3A+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li>
<li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li>
<li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).</li>
<li>Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorthrup%2C+E+%22Methods+of+Measuring+Electrical+Resistance%22">Methods of Measuring Electrical Resistance</a>. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li>
<li>Esch, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+porous+polymer+membranes+for+integration+of+gastrointestinal+tract+epithelium+with+microfluidic+%27body-on-a-chip%27+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices.</a> Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).</li>
<li>Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).</li>
<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).</li>
<li>Hufnagl, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Time+Resolved+Transepithelial+Impedance+Spectroscopy+Of+Caco+2+Monolayers+Relying+on+Lithographically+Patterned+Basolateral+Electrode+Cell+Arrays%22">Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays</a>. , University of Vienna. (2010).</li>
<li>Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimer%C3%A0%2C+A+%22World+Congress+on+Medical+Physics+and+Biomedical+Engineering.+International+Federation+of+Medical+and+Biological+Engineering+Proceedings%22">World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings</a>. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere conflicten van belang.

Voordat een zelfgemaakte voltammeter kan worden gebruikt in een dagelijkse routine, is het essentieel om het apparaat te controleren op de juiste functie. In ons geval werd een halve tijd van oscillatie van 40 MS (12,5 Hz) geprogrammeerd, maar de effectieve oscillatie tijd bleek 60 MS (16,7 Hz). Deze onnauwkeurigheid van de tijd emitter van de microcontroller had geen detecteerbare impact op TEER-metingen. Het is misschien het beste om de werkelijke frequentie te bepalen met behulp van de frequentie-instelling van een va...

Epitheliale en endotheliale cellen functioneren als cellulaire grenzen, scheiden van de apicale en basolateraal zijden van het lichaam. Als ze zijn verbonden door middel van nauwe kruispunten, is passieve substantie diffusie door de paracellulaire ruimten beperkt1, resulterend in de vorming van een selectief permeabele barrière. Verschillende kunstmatige barrière systemen zijn ontwikkeld2 met behulp van microvasculaire endotheliale cellen (hbmec, bloed-hersen barrière3,4,5,6,7), vaatvlies plexus Epitheelcellen (hibcpp/pcpec, bloed-cerebrospinale vloeistof barrière8,9,10,11,12,13,14), colorectale adenocarcinoom cellen (CaCO-2, gastro-intestinale modellen15), of luchtweg/alveolaire cellijnen (pulmonale modellen16,17). Deze systemen bestaan meestal uit cellen die zijn gekweekt in een monolaag op permeabele membranen (d.w.z. filter insert-systemen) om toegang te geven tot de apicale en basolateraal zijden. Het is belangrijk dat de integriteit van het modelsysteem overeenkomt met de in vivo omstandigheden. Daarom zijn er verschillende technieken ontwikkeld om de barrièrefunctie te analyseren door de paracellulaire diffusie van Tracer verbindingen over de cellaag te meten. Deze stoffen zijn voorzien van van sucrose, kleurstof gelabelde albumine, FITC-gelabelde inuline of kleurstof gelabeld dextranen2. Chemische kleurstoffen kunnen cellen echter onbruikbaar maken voor verdere experimenten. Om barrière systemen niet invasief te bewaken, kan meting van transepitheliale/transendotheliale elektrische weerstand (teer) over een cellulaire monolaag worden gebruikt2,18,19. Omdat bipolaire elektrode systemen worden beïnvloed door de elektrode polarisatie impedantie bij de elektrode-elektrolyt-interface, worden tetrapolar-metingen over het algemeen gebruikt om deze beperking te overwinnen20. De onderlegtechniek is een vier-terminale sensing (4T) die voor het eerst werd beschreven in 1861 door William Thomson (Lord Kelvin)21. In het kort, de stroom wordt geïnjecteerd door een paar stroom-dragende elektroden terwijl een tweede paar spanning-sensing elektroden wordt gebruikt voor het meten van de spanningsdaling20. Tegenwoordig, zogenaamde Chopstick elektroden bestaan uit een paar dubbele elektroden, elk met een zilver/zilverchloride pellet voor het meten van spanning en een zilveren elektrode voor het passeren van de huidige2. De elektrische impedantie wordt gemeten tussen de apicale en het basolaterale compartiment met de cellaag daartussenin (Figuur 1). Een vierkante Golf signaal met een frequentie van meestal 12,5 Hz wordt toegepast op de buitenste elektroden en de resulterende wisselstroom (AC) gemeten. Bovendien wordt de potentiële druppel over de cellaag gemeten door het tweede (binnenste) elektrode paar. De elektrische impedantie wordt vervolgens berekend volgens de wet van Ohm. TEER-waarden worden genormaliseerd door vermenigvuldiging van de impedantie en het oppervlak van de cellaag en worden meestal uitgedrukt als Ω ∙ cm2.
Er zijn systemen waarin cellen en elektroden op een meer verfijnde manier worden gerangschikt, maar zijn ook gebaseerd op het 4T-meetprincipe en kunnen worden gebruikt met dezelfde meetapparatuur. EndOhm systemen, bijvoorbeeld, waarin het filter wordt ingebracht, bevatten een kamer en dop met een paar concentrische elektroden met dezelfde structuur als de Chopstick-elektrode. De vorm van de elektroden zorgt voor een meer uniforme stroom dichtheids stroming over het membraan, waardoor de variatie tussen metingen wordt verminderd. Nog complexer (maar ook accurater) is een Ussing kamer, waarbij een cellaag twee kamers scheidt die gevuld zijn met Ringer's Solution22. De kamer zelf kan worden verstoken met zuurstof, CO2, of N2, en geroerd of aangevuld met experimentele stoffen. Als Ion transport over de cellaag optreedt, kan een potentiaalverschil worden gemeten door twee voltage-sensing elektroden in de buurt van het weefsel. Deze spanning wordt geannuleerd door twee stroomdragende elektroden die naast de cellaag zijn geplaatst. De gemeten stroom geeft dan het netto Ion-transport en de transepitheliale weerstand, die de barrière-integriteit weerspiegelt, kan worden bepaald22. De teer meting kan ook worden toegepast op Body-on-a-chip systemen die de barrière modellen23,24vertegenwoordigen. Deze systemen na te bootsen in vivo omstandigheden van de cellen en vaak bestaan uit verschillende soorten cellen, gestapeld bovenop elkaar in lagen.
Het volgende protocol legt uit hoe u een kosteneffectieve en betrouwbare voltammeter instellen met programmeerbare uitgangsfrequentie die geen statistisch significante verschillen in TEER oplevert in vergelijking met commercieel verkrijgbare meetsystemen.

<table><tbody><tr><td>120 kOhm weerstand</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Banaanstekker kabels</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Kabels</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Chopstick elektrode</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Chopstick elektrode (alternatief)</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr><td>Krimptang</td><td></td><td></td><td>Algemeen gereedschap</td></tr><tr><td>Digispark / ATtiny85</td><td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td><td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco (Thermo Fisher)</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal calf serum (FCS)/Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Filter inserts 3&micro;m transparant</td><td>Greiner Bioone</td><td>662631</td><td></td></tr><tr><td>HIBCPP</td><td></td><td></td><td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td></tr><tr><td>Isolatiestrikker</td><td></td><td></td><td>Algemeen gereedschap</td></tr><tr><td>Lusterklem</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>HAMEG</td><td>Digital Storage Scope HM 208</td><td></td></tr><tr><td>Plotmachine</td><td>PHILIPS</td><td>PM 8143 X-Y recorder</td><td></td></tr><tr><td>Software Arduino</td><td>https://www.arduino.cc</td><td>Arduino 1.8.9</td><td></td></tr><tr><td>Loodbout</td><td></td><td></td><td>Algemeen gereedschap</td></tr><tr><td>Loodhulzen</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Telefoonkabel met RJ14 (6P4C) connector</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Testweerstand</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX04</td><td></td></tr><tr><td>True-RMS multimeters</td><td>VOLTCRAFT</td><td>VC185</td><td></td></tr><tr><td>USB oplader</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>USB verlengsnoer</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr><tr><td>Voltohmmeter voor TEER meting</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>EVOM</td><td></td></tr><tr><td>Voltohmmeter voor TEER meting (alternatief)</td><td>Merck Millicell</td><td>ERS</td><td></td></tr><tr><td>Kabeleindenhulzen</td><td></td><td></td><td>Algemeen (generiek) apparatuur</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige benadering om teer metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand (TEER) is sinds de jaren tachtig gebruikt om de confluentie en permeabiliteit van in vitro Barrier modelsystemen te bepalen. In de meeste gevallen worden Chopstick-elektroden gebruikt om de elektrische impedantie tussen het bovenste en onderste compartiment van een celcultuurfilterinvoegsysteem met cellulaire monolagen te bepalen. Het filtermembraan stelt de cellen in staat om te hechten, te polariseren en te communiceren door nauwe kruisingen te bouwen. Deze techniek is beschreven met een verscheidenheid van verschillende cellijnen (bijvoorbeeld cellen van de bloed-hersen barrière, bloed-cerebrospinale vloeistof barrière, of gastro-intestinale en pulmonaire tractus). TEER meetapparatuur kan gemakkelijk worden verkregen van verschillende leveranciers van laboratoriumapparatuur. Er zijn echter kostenbesparende en aanpasbare oplossingen denkbaar als een geschikte voltammeter zelf wordt geassembleerd. Het algemene doel van deze publicatie is het opzetten van een betrouwbaar apparaat met programmeerbare uitgangsfrequentie dat kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor TEER-meting.

Om de werking van een zelf-geassembleerde voltammeter te vergelijken met zijn in de handel verkrijgbare tegenhanger, werd een spannings oscillogram van beide apparaten opgenomen.
Zoals weergegeven in Figuur 2a, heeft het referentie-instrument een vierkant Golf signaal gegenereerd met een amplitude van 80 MV en een oscillatie tijd van 80 MS, wat overeenkomt met een frequentie van 12,5 Hz, bij het...

Hier laten we zien hoe je een goedkope volt-Amperemeter opzetten met programmeerbare uitgangsfrequentie die kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand metingen.

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Meting van de transepitheliale elektrische impedantie wordt sinds de jaren tachtig gebruikt om de samenvloeiings- en barrièrefunctie van epitheliale monolagen in de celcultuur te bepalen. De onderliggende techniek is een vier-terminal sensing die verschillende paren van stroom-dragende en spanning-sensing elektroden gebruikt om nauwkeurigere metingen te maken. Er zijn verschillende commercieel beschikbare apparaten om transepitheliale impedantie te meten, maar ondanks het gebruiksgemak en de hoge betrouwbaarheid, zijn er ook enkele nadelen als de niet-vertaalbare outputfrequentie en hun duur.Zo vertegenwoordigen we hoe we een kosteneffectieve en programmeerbare volt-ammeter kunnen bouwen. In eerste instantie willen we laten zien hoe TEER-meting met commercieel beschikbare apparaten werkt. Om dit te doen, hadden we gekweekt een cel laag van choroid plexus epitheel papilloma cellen op Transwell filters met een porie grootte van drie micrometer.Deze instelling is beschreven door Schroten et al. als in vitro model van de bloed-cerebrospinale vloeistof barrière. Nu is een eetstokelektrode verbonden met een epitheel volt-ammeter.Het apparaat is ingeschakeld en ingesteld om de weerstand te meten. De elektrode wordt gesteriliseerd in 80% ethanol en vervolgens geëquilibreerd in een geschikt medium. De te meten impedantie dient als referentiewaarde om de betrouwbaarheid van de volt-ammeter te evalueren die daarna zal worden geassembleerd.In dit voorbeeld nemen we een impedantie van 680 ohm op. Laten we beginnen met de montage van een low-budget volt-ammeter met programmeerbare uitgangsfrequentie. Allereerst heb je een standaard USB-lader nodig en een USB-verlengsnoer als vijf-volt gelijkstroomvoeding.Een 8-bits microcontroller op een USB-ontwikkelbord wordt dan gebruikt om een vierkante golfstroom te genereren. Vier kabels met bananenpluggen zijn aangesloten op twee standaard multimeters om spanning en stroom te meten. Zorg ervoor dat de multimeters in staat zijn om stroom te meten in een reeks van sommige microampers met TrueRMS.Een vrouwelijke RJ14 connector is te vinden op standaard telefoonkabels. Zorg ervoor dat de connector zes pinnen heeft waarvan ten minste de binnenste vier zijn bedraad. Tot slot heb je een aantal standaard uitrusting nodig, zoals onze kabels, een glansterminal, een weerstand van 120 kiloohm en wat gereedschap als isolatiestrippers, een krimpmiddel, draadeind ferrules en soldeerbout.Het apparaat wordt precies zo geassembleerd als in het lay-outdiagram. In eerste instantie is de USB-extensie aangesloten op de microcontroller. Tijdens normaal gebruik wordt het aangedreven door een vijf-volt DC USB-lader, die gemakkelijk kan worden aangesloten op een personal computer voor de programmering.Twee kabels zijn gestript en geploesteerd met draad einde ferrules aan de ene kant. De andere kant wordt gesoldeerd, hetzij rechtstreeks om nul en twee van de microcontroller pin of aan soldeer lugs, die op hun beurt worden geknipt op de respectieve pinnen. Vervolgens worden de stroomleverende kabels aangesloten op een glansterminal.De eerste multimeter zal worden gebruikt om stroom te meten en is in serie verbonden met 120 kiloohm weerstand en een stroom-passerende chopstick elektroden. Deze regeling zorgt ervoor dat de uitgangsstroom beperkt is, zodat de meting geen invloed heeft op de levensvatbaarheid van de cel. De vier geleiders van het telefoonuitbreidingskoord worden ontmanteld en aan ferrules zoals getoond voordien geploerigeerd.Zodra de kabel is voorbereid, moet u de continuïteit van geleiders en pinnen testen. In ons voorbeeld zijn pin drie tot zes verbonden met de witte, bruine, groene en gele geleider. Nu pin vijf en zes, dat is groen en geel, zijn aangesloten op de glans terminal om spanning toe te passen op de buitenste elektrode paar.Ten slotte moet u de tweede multimeter, die zal worden gebruikt om de transepitheliale spanningsval te meten, aansluiten op pinnen drie en vier, dat wil zeggen, in ons voorbeeld, op de witte en bruine geleider. We besloten om de installatie te monteren in een goedkoop kunststof chassis. Voor het eerste gebruik moet de microcontroller geprogrammeerd worden.De broncode is geschreven in C+en kan worden geüpload via een USB. Maak kortom nul vast in een middenuitgangsmodus. Wanneer ingeschakeld, zal de functie lus beginnen af te wisselen als pinnen tussen de grond en plus vijf volt met een variabele vertraging.In ons voorbeeld gebruikten we een theoretische halve oscillatietijd van 40 milliseconden. Laten we eens kijken hoe de meetresultaten zich verhouden tot de referentiewaarden die we eerder hadden verkregen. De eetstokelektrode wordt verplaatst naar de onlangs geassembleerde volt-ammeter.Het apparaat wordt in drie stappen ingeschakeld. Dat wil zeggen, het aansluiten van een USB-lader, het schakelen van de linker multimeter naar AC spanning meting, en het schakelen van de tweede multimeter naar microampere. Let op, die wisselstroom moet expliciet worden geselecteerd.In dit voorbeeld wordt de potentiële daling van het Transwell-filtersysteem gemeten als ongeveer 25 millivolt, terwijl we een stroom van 37,1 microamperes registreren. Volgens de wet van Ohm kan elektrische impedantie eenvoudig worden berekend op 674 ohm, wat zeer dicht bij de referentiewaarde van 680 ligt. We hebben aangetoond dat de meetwaarden betrouwbaar zijn over een bereik van nul tot 1,8 kiloohms.Zo kan de beschreven volt-ammeter zowel voor de eerste experimenten als voor verdere studies worden gebruikt. Als uw resultaten echter worden gepubliceerd, u uw gegevens altijd ondersteunen door molecuulstroom over de respectieve cellaag te meten.

a-simple-approach-to-perform-teer-measurements-using-self-made-volt

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De productie, de kalibratie en het gebruik van niet-invasieve vibrerende sondes naar bio-elektrische stroom te meten in de verschillende biologische systemen wordt beschreven.

Meting van bio-elektrische stroom met een Vibrating Probe

Een protocol voor een vaste-fixed beam-ontwerpen met behulp van een laser Doppler vibrometer (LDV), met inbegrip van de meting van de frequentie afstemmen, wijziging van tuning mogelijkheden, en het vermijden van apparaatfout en stiction, wordt gepresenteerd. De superioriteit van de LDV-methode over de netwerkanalyse blijkt toe te schrijven aan zijn hogere modus vermogen.

Design en karakterisatie methodologie voor efficiënte Wide Range afstembare MEMS Filters

Deze studie verbetert de nauwkeurigheid van de elektromagnetische debietmeter door excitatiegolfvormen te optimaliseren, meertraps filtering toe te passen en gebruik te maken van op Complex Programmable Logic Device (CPLD) gebaseerde rectificatie. Een nieuwe, op golfvormen gebaseerde detectiemethode voor lege leidingen verhoogt de betrouwbaarheid. Experimenten tonen een nauwkeurigheid van 0,1% binnen 0,1-15 m/s, wat de industriële toepasbaarheid valideert.

Uiterst nauwkeurige elektromagnetische flowmeter met detectie van lege leidingen via complexe programmeerbare logische apparaatgebaseerde golfvormherkenning

In dit werk is het protocol besproken voor het ontwerpen en ontwikkelen van een E-Eye-Enable POCT-apparaat om Fe, Cr, As en F te detecteren in milieumonsters, biologische monsters en voedsel en dranken. Er zijn bijna 2000 monsters getest en de resultaten komen overeen met de gouden standaardtechniek.

TD-DFT Geleide geavanceerde E-Eye Sensing-techniek voor kwantificering ter plaatse van Fe, Cr, F en As in de milieu-, biologische en voedselmonsters

In deze video laten we zien hoe om te fabriceren en gebruiken microfabricated na reeks detectoren (mPADs) om modulaties van cellulaire contractiliteit te beoordelen.

Microfabricated Post-Array-Detectoren (mPADs): een benadering van mechanische krachten Isoleer

Deze video laat zien hoe u een programmeerbare trekker te gebruiken om patch pipetten en scherpe elektroden te maken voor elektrofysiologie. Dezelfde procedure kan gebruikt worden om een ​​verscheidenheid van glazen instrumenten, waaronder injectienaalden te maken.

Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Deze procedure laat zien hoe de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om snel en gemakkelijk identificeren van de beste elektroporatie voorwaarden voor muis embryonale fibroblasten (MEF) of andere primaire cellen. Overwegingen voor het oplossen van problemen worden ook besproken in de bijbehorende video.

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Opschorting immunocytochemische kleuring van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) voor het celoppervlak markers (SSEA-3/SSEA-4) werd bereikt op basis van het gebruik van een zelfgemaakte Cytospin apparaat tot een monolaag van cellen voor observatie en kwantificering te creëren.

Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.

FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid

Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te...

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Leer een kosteneffectieve methode voor TEER-metingen met een zelfgemaakte programmeerbare volt-amperemeter en chopstick-elektroden. Deze aanpak maakt betrouwbare impedantiemetingen in epitheliale monolagen toegankelijk voor celbiologisch onderzoek.

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

Meer video's verkennen