Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie
5 oktober 2019
Hier laten we zien hoe je een goedkope volt-Amperemeter opzetten met programmeerbare uitgangsfrequentie die kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand metingen.
Meting van de transepitheliale elektrische impedantie wordt sinds de jaren tachtig gebruikt om de samenvloeiings- en barrièrefunctie van epitheliale monolagen in de celcultuur te bepalen. De onderliggende techniek is een vier-terminal sensing die verschillende paren van stroom-dragende en spanning-sensing elektroden gebruikt om nauwkeurigere metingen te maken. Er zijn verschillende commercieel beschikbare apparaten om transepitheliale impedantie te meten, maar ondanks het gebruiksgemak en de hoge betrouwbaarheid, zijn er ook enkele nadelen als de niet-vertaalbare outputfrequentie en hun duur.
Zo vertegenwoordigen we hoe we een kosteneffectieve en programmeerbare volt-ammeter kunnen bouwen. In eerste instantie willen we laten zien hoe TEER-meting met commercieel beschikbare apparaten werkt. Om dit te doen, hadden we gekweekt een cel laag van choroid plexus epitheel papilloma cellen op Transwell filters met een porie grootte van drie micrometer.
Deze instelling is beschreven door Schroten et al. als in vitro model van de bloed-cerebrospinale vloeistof barrière. Nu is een eetstokelektrode verbonden met een epitheel volt-ammeter.
Het apparaat is ingeschakeld en ingesteld om de weerstand te meten. De elektrode wordt gesteriliseerd in 80% ethanol en vervolgens geëquilibreerd in een geschikt medium. De te meten impedantie dient als referentiewaarde om de betrouwbaarheid van de volt-ammeter te evalueren die daarna zal worden geassembleerd.
In dit voorbeeld nemen we een impedantie van 680 ohm op. Laten we beginnen met de montage van een low-budget volt-ammeter met programmeerbare uitgangsfrequentie. Allereerst heb je een standaard USB-lader nodig en een USB-verlengsnoer als vijf-volt gelijkstroomvoeding.
Een 8-bits microcontroller op een USB-ontwikkelbord wordt dan gebruikt om een vierkante golfstroom te genereren. Vier kabels met bananenpluggen zijn aangesloten op twee standaard multimeters om spanning en stroom te meten. Zorg ervoor dat de multimeters in staat zijn om stroom te meten in een reeks van sommige microampers met TrueRMS.
Een vrouwelijke RJ14 connector is te vinden op standaard telefoonkabels. Zorg ervoor dat de connector zes pinnen heeft waarvan ten minste de binnenste vier zijn bedraad. Tot slot heb je een aantal standaard uitrusting nodig, zoals onze kabels, een glansterminal, een weerstand van 120 kiloohm en wat gereedschap als isolatiestrippers, een krimpmiddel, draadeind ferrules en soldeerbout.
Het apparaat wordt precies zo geassembleerd als in het lay-outdiagram. In eerste instantie is de USB-extensie aangesloten op de microcontroller. Tijdens normaal gebruik wordt het aangedreven door een vijf-volt DC USB-lader, die gemakkelijk kan worden aangesloten op een personal computer voor de programmering.
Twee kabels zijn gestript en geploesteerd met draad einde ferrules aan de ene kant. De andere kant wordt gesoldeerd, hetzij rechtstreeks om nul en twee van de microcontroller pin of aan soldeer lugs, die op hun beurt worden geknipt op de respectieve pinnen. Vervolgens worden de stroomleverende kabels aangesloten op een glansterminal.
De eerste multimeter zal worden gebruikt om stroom te meten en is in serie verbonden met 120 kiloohm weerstand en een stroom-passerende chopstick elektroden. Deze regeling zorgt ervoor dat de uitgangsstroom beperkt is, zodat de meting geen invloed heeft op de levensvatbaarheid van de cel. De vier geleiders van het telefoonuitbreidingskoord worden ontmanteld en aan ferrules zoals getoond voordien geploerigeerd.
Zodra de kabel is voorbereid, moet u de continuïteit van geleiders en pinnen testen. In ons voorbeeld zijn pin drie tot zes verbonden met de witte, bruine, groene en gele geleider. Nu pin vijf en zes, dat is groen en geel, zijn aangesloten op de glans terminal om spanning toe te passen op de buitenste elektrode paar.
Ten slotte moet u de tweede multimeter, die zal worden gebruikt om de transepitheliale spanningsval te meten, aansluiten op pinnen drie en vier, dat wil zeggen, in ons voorbeeld, op de witte en bruine geleider. We besloten om de installatie te monteren in een goedkoop kunststof chassis. Voor het eerste gebruik moet de microcontroller geprogrammeerd worden.
De broncode is geschreven in C+en kan worden geüpload via een USB. Maak kortom nul vast in een middenuitgangsmodus. Wanneer ingeschakeld, zal de functie lus beginnen af te wisselen als pinnen tussen de grond en plus vijf volt met een variabele vertraging.
In ons voorbeeld gebruikten we een theoretische halve oscillatietijd van 40 milliseconden. Laten we eens kijken hoe de meetresultaten zich verhouden tot de referentiewaarden die we eerder hadden verkregen. De eetstokelektrode wordt verplaatst naar de onlangs geassembleerde volt-ammeter.
Het apparaat wordt in drie stappen ingeschakeld. Dat wil zeggen, het aansluiten van een USB-lader, het schakelen van de linker multimeter naar AC spanning meting, en het schakelen van de tweede multimeter naar microampere. Let op, die wisselstroom moet expliciet worden geselecteerd.
In dit voorbeeld wordt de potentiële daling van het Transwell-filtersysteem gemeten als ongeveer 25 millivolt, terwijl we een stroom van 37,1 microamperes registreren. Volgens de wet van Ohm kan elektrische impedantie eenvoudig worden berekend op 674 ohm, wat zeer dicht bij de referentiewaarde van 680 ligt. We hebben aangetoond dat de meetwaarden betrouwbaar zijn over een bereik van nul tot 1,8 kiloohms.
Zo kan de beschreven volt-ammeter zowel voor de eerste experimenten als voor verdere studies worden gebruikt. Als uw resultaten echter worden gepubliceerd, u uw gegevens altijd ondersteunen door molecuulstroom over de respectieve cellaag te meten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een kosteneffectieve methode voor het meten van de transepitheliale elektrische impedantie met behulp van een programmeerbare volt-ampèremeter, ontworpen voor gebruik met eetstok-elektroden. Deze benadering verbetert de toegankelijkheid van weerstandsmetingen in epitheliale monolagen, die essentieel zijn voor het beoordelen van de barrièrefunctie in celkweek.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Elektrische impedantiemetingen
- Beoordeling van de barrièrefunctie
Achtergrond
- De meting van de transepitheliale elektrische impedantie wordt sinds de jaren 80 gebruikt om epitheliale monolagen te evalueren.
- Standaardapparatuur voor deze meting kan kostbaar zijn en biedt mogelijk geen aanpasbare outputfrequenties.
- Deze studie presenteert een betaalbaar alternatief dat de precisie en betrouwbaarheid behoudt.
Gebruikte methoden
- De assemblage van een volt-amperemeter met behulp van standaard elektronische componenten.
- Choroïde plexus epitheliale papilloomcellen, gekweekt op Transwell-filters als modelsysteem.
- Implementatie van vierpuntmeting om de meetnauwkeurigheid te verbeteren.
Belangrijkste resultaten
- De geassembleerde volt-amperemeter leverde betrouwbare impedantiemetingen op, waarbij de gemeten waarden nauw aansloten bij de referentiewaarden.
- Elektrische impedantiemetingen vertoonden een betrouwbaarheidsbereik van 0 tot 1,8 kiloohms.
- De meetresultaten valideerden de bruikbaarheid van het apparaat voor zowel de initiële experimenten als voor verdere studies.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een haalbare en kosteneffectieve oplossing voor het uitvoeren van elektrische weerstandsmetingen in celculturen.
- De bevindingen zijn van groot belang voor het verbeteren van technieken in biologisch onderzoek en de beoordeling van eigenschappen van cellagen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Kosteneffectieve en programmeerbare TEER-meetoplossingen maken een schaalbare beoordeling van de epitheliale barrièrefunctie mogelijk, wat vroege target-validatie en mechanische risicoreductie bij geneesmiddelenonderzoek ondersteunt. Door betrouwbare kwantitatieve impedantiedata te leveren, vergroot deze aanpak het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen van de bloed-hersenbarrière, de bloed-hersenvochtbarrière, gastro-intestinale barrières en pulmonaire barrières. De methode ondersteunt de triage van portefeuilles door biologische onzekerheid in workflows voor lead-identificatie te verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door kwantitatieve beoordeling van de barrière-integriteit in ziekterelateerde celmodellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door genetische of farmacologische perturbaties te correleren met meetbare veranderingen in de transepitheliale weerstand.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanistische risicoreductie door reproduceerbare, frequentie-programmeerbare impedantie-readouts te bieden die de vorming van tight junctions en de gezondheid van de monocuier weerspiegelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de barrièrefunctie in high-throughput compatibele formaten.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbaarheid van de assay mogelijk door programmeerbare outputfrequentie en vierpuntsmeting, waardoor meetvariabiliteit tussen runs wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor meerdere cellijnen en Transwell-formaten dankzij het kostenefficiënte, aanpasbare hardware-ontwerp.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door ziekterelevante barrièremetrische gegevens te leveren die voorspellend zijn voor de in vivo permeabiliteit en weefselintegriteit.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door verbindingen die de barrièrefunctie verstoren vroegtijdig in de pipeline te identificeren.
- Afstemming van biomarkers: Maakt het mogelijk om veranderingen in TEER te correleren met translationele biomarkers van epitheliale gezondheid en modulatie van tight junctions.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische barrièrebeoordeling, waardoor een datagestuurde progressie mogelijk wordt gemaakt op basis van functionele epitheliale integriteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door genetische of farmacologische interventies te koppelen aan meetbare veranderingen in de epitheliale impedantie.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve impedantie-outputs die een betrouwbare vergelijking van testcondities binnen compound-bibliotheken mogelijk maken.
- Analytics: Levert nauwkeurige weerstandsmetingen (bereik 0–1,8 kΩ) en frequentie-programmeerbare signalen die statistische vergelijking en datanormalisatie ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door menselijke barrièresystemen (bijv. bloed-cerebrospinale vloeistof) te modelleren met gevalideerde cellijnen.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een herbruikbare, kosteneffectieve mogelijkheid voor de beoordeling van de barrièrefunctie over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door mechanistische ambiguïteit in barrière-gerelateerde mechanismen te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door programmeerbare frequentiecontrole en een vierterminalige detectiearchitectuur.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de interne assemblage van betrouwbare TEER-systemen mogelijk te maken, waardoor de afhankelijkheid van dure commerciële apparatuur wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert risicogecorrigeerde prioritering door barrière-verstorende risico's in een vroeg stadium te identificeren, wat de kans op uitval in een laat stadium beperkt.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist basiskennis van elektronica voor de assemblage, inclusief het solderen, crimpen en doorvoeren van aangepaste kabels en connectoren.
- Is afhankelijk van toegang tot een USB-ontwikkelbord, een 8-bits microcontroller, standaard multimeters met TrueRMS-microampère-functionaliteit en een weerstand van 120 kΩ voor stroombegrenzing.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van de elektrodevoorbereiding, mediumequilibratie en meettiming om reproduceerbare resultaten te garanderen.
- Vereist aanpassing van de positionering en stabilisatietechnieken van de chopstick-elektrode bij toepassing op verschillende Transwell-poriegroottes of diktes van de cellaag.
- Beperkt tot impedantiemetingen binnen het bereik van 0–1,8 kΩ; systemen met een hogere weerstand kunnen aanpassingen aan de stroombegrenzingsweerstand of de versterkingsfactor van de amplifier vereisen.
