Name: Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer co-enzym A kwantificeren in cellen en weefsels met behulp van HPLC-detectie. Deze methode biedt betrouwbare metingen van totale CoA-niveaus voor metabolisme- en neurodegeneratieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de financiering van gesponsord onderzoek dat wordt aangeboden door CoA Therapeutics, Inc., een dochteronderneming van BridgeBio LLC, de National Institutes of Health Grant GM34496, en de Amerikaanse Libanese Syrische geassocieerde liefdadigheidsinstellingen.

De in dit protocol bedoelde dier procedure is uitgevoerd volgens de protocollen 323 en 556 en is specifiek goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité.
1. voorbereiding van de oplossingen
Opmerking: gebruik ultrapuur water voor alle oplossingen en indien aangegeven in procedures.
<ol><li>Bereid 1 mM kaliumhydroxide (KOH) in water.</li>
	<li>Bereid 0,25 M KOH in water.</li>
	<li>Bereid 1 M Trizma-HCl in water en breng aan op pH 8,0.</li>
	<li>Bereid 100 mM monobromobimane (mBBr) in acetonitril (Optima grade). Stock oplossingen van mBBr zijn stabiel bij-20 °C gedurende vele maanden op voorwaarde dat ze in het donker worden bewaard omdat blootstelling aan licht de monobromobimane kan fotolyseren tot bimane26.</li>
	<li>Voorbereiding van de reinigings buffer voor de kolom van de Solid phase-extractie (SPE): 50% methanol (Optima-kwaliteit) + 2% azijnzuur.</li>
	<li>Elutie buffer voorbereiden voor SPE-kolom: 95% ethanol (HPLC-kwaliteit) met 50 mM ammonium formaat.</li>
</ol>2. bereiding van het CoA-bimane-standaard
<ol><li>Koop een hoogwaardige CoA-standaard van een betrouwbare bron (bijv. Avanti Polar lipids, Inc.).</li>
	<li>Bereid een hoge concentratie voorraadoplossing van CoA in 20 mM Tris, pH 8. De hoeveelheid CoA in de hoge concentratie kolf wordt bepaald of bevestigd door de spectrofotometrische extinctie bij λ 260 nm (Vogele = 16.800 M-1∙ cm-1). Voeg 4-voudige molaire overmaat mBBr toe; Vortex op hoog voor 10 s. Bijvoorbeeld, voor 10 mM CoA in buffer, toevoegen 40 mM mBBr. De mBBr wordt extra toegevoegd om ervoor te zorgen dat al het CoA wordt afgeleid.</li>
	<li>Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 4 uur in het donker zonder te schudden om het CoA te derivatiseren met mBBr. mBBr reageert met de thiol groep van het CoA, en het is pH en temperatuur afhankelijk27. Toevoeging van de mBBr zet CoA om in een in water oplosbaar fluorescerende (of ultraviolette absorbant) CoA-bimane (CoA-bimane; Figuur 2).</li>
	<li>Voeg 100 μL azijnzuur toe en Vortex op hoog voor 10 s om de reactie te stoppen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g om eventuele precipiterende stof te verwijderen.</li>
	<li>Reinig het supernatant met behulp van een SPE-kolom om de niet-gereageerd mBBr (hieronder beschreven) te verwijderen. Filtratie en centrifugeren van het eluaat is niet nodig na het opruimen van de SPE-kolom (punt 5,8).</li>
	<li>Verzamel het eluaat uit de SPE-kolom met de CoA-bimanen in een vooraf gewogen buis, droog onder stikstofgas, weeg en bouw een standaard kalibratiekromme met bekende hoeveelheden CoA-bimanen.<ol>
<li>Controleer de CoA-bimane-standaard voor zuiverheid door HPLC (zie hieronder) met extinctie detectie bij zowel λ 260 (adenine moiety) als λ 393 (bimane groep) en toeval van beide pieken in het chromatogram.</li>
		<li>Bevestig de hoeveelheid van de CoA-bimane-standaard in de hoge concentratie kolf met behulp van λ 260 nm (Vogele = 16.800 M-1∙ cm-1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registreer de HPLC-retentietijd voor de identificatie van CoA-bimanen in experimentele monsters met behulp van de CoA-bimane-standaard.</li>
	<li>Bewaar aliquots van de hoge concentratie voorraad van de CoA-bimane-standaard beschermd tegen licht en bewaard bij-20 °C gedurende maximaal 2 jaar. Vermijd herhaald ontdooien en opnieuw invriezen.</li>
</ol>3. extractie en derivatisering van CoA in gekweekte cellen
<ol><li>Oogst aanhandige cellen in cultuur bij het naderen van late subconfluente dichtheden. Bijvoorbeeld, menselijke HepG2/C3A cellen worden gekweekt tot een dichtheid van 6-8 x 106, of HEK 293t cellen worden gekweekt tot een dichtheid van ~ 1,3 x 107 per 100 mm schotel.<ol>
<li>Gebruik routinematig dubbele of drievoud culturen voor COA-bepalingen. Incuberen afzonderlijke cultuur gerechten parallel met de monster celculturen om het levensvatbare celgetal te bepalen. Bereken de hoeveelheid CoA per 106-107 cellen na HPLC-zuivering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirate cultuurmedium van het gerecht. Spoel cellen snel op de schaal met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om eventueel rest medium te verwijderen en de PBS van het gerecht te halen. Spoel cellen snel met ijskoud water om de resterende PBS te verwijderen en het water snel van het gerecht te zuigen. Vermijd het verstoren van de aanhankelijke cellen bij het toevoegen van de PBS of water.</li>
	<li>Voeg 1 mL ijskoud water toe aan het kweek gerecht. Schrael cellen in het koude water in de schaal en breng de celsuspensie over in een glazen reageerbuis met 400 μL 0,25 M KOH en 1,5 mL water.<ol>
<li>Meng de suspensie krachtig door Vortex op hoog voor 10 s. Bedek vervolgens strak met paraffine folie en inbroed bij 55 °C gedurende 1 uur zonder te schudden in een waterbad. De pH van het monster moet ≥ 12 zijn. De hoge pH is belangrijk voor het hydrolyseren van het CoA thioesters en kan indien nodig worden aangepast met extra aliquots van KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oogst gekweekte cellen die in suspensie groeien door centrifugeren bij lage snelheid: 136 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Was een keer met ijskoude PBS, spoel vervolgens kort opnieuw met koud water en breng uiteindelijk in 2,5 mL koud water en 400 μL 0,25 M KOH. Meng krachtig en inincuberen bij 55 °C zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Voeg 160 μL van 1 M Trizma-HCl en 10 μL 100 mM mBBr toe en meng door Vortex op hoog voor 10 s. Dit brengt de pH tot ongeveer 8 ter ondersteuning van de mBBr-reactie met gratis CoA. Bedek en inbroed monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker voor de mBBr om te reageren met het thiol van CoA.</li>
	<li>Voeg 100 μL azijnzuur toe en meng door Vortex op hoog voor 10 s om de reactie te stoppen</li>
	<li>Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 15 minuten om neergeprecipiteerd celafval te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder en bewaar supernatant in een glazen reageerbuis voor de clean-up van de SPE-kolom die hieronder wordt beschreven.</li>
</ol>4. extractie en derivatisering van CoA in weefsels
<ol><li>Afwijkende dierlijke weefsel stukken, ongeveer 0,5 cm doorsnede of kleiner, en DEP kort (1-2 s) op absorberend papier en vervolgens vlam in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C tot de verwerking. CoA in weefsels wordt gehydrolyseerd of omgezet in een thio ester indien niet ingevroren. Deze stap is belangrijk voor het verkrijgen van de maximale opbrengst van CoA in weefsels.</li>
	<li>Weeg bevroren weefsel stukken (5 – 60 mg) snel af voordat u de analyse start en noteer het gewicht voor elk monster. Deze bepaling van het natte gewicht wordt gebruikt voor de berekening van het CoA-gehalte na HPLC-zuivering. Vermijd volledige ontdooien van de weefsel stukken.</li>
	<li>Voeg 2 mL van 1 mM KOH toe aan een glazen reageerbuis (bijv. 13 mm x 100 mm wegwerp) bestemd voor het inbrengen van een sonde en weefsel verstoring met een rotor-stator homogenisator. Houd de buis op ijs tot het gebruik. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de monsters worden gehomogeniseerd bij een koude temperatuur en CoA wordt niet vernietigd als gevolg van de warmte die wordt gegenereerd tijdens de homogenisatie.</li>
	<li>Overdracht en homogeniseren van weefsel (30 – 40 mg) in de glazen reageerbuis (met koude 1 mM KOH) voor 30 s. Vermijd het volledig ontdooien van het weefsel.</li>
	<li>Voeg 500 μL van 0,25 M KOH; Vortex op hoog voor 10 s en blijf op ijs totdat alle monsters zijn gehomogeniseerd. Dit zal de pH van het monster boven 12 brengen om het CoA thioesters te hydrolyseren tot een totaal CoA (gratis CoA + gehydrolyseerd CoA thioesters).</li>
	<li>Inincuberen monsters bij 55 °C gedurende 2 uur in een waterbad zonder schudden om hydrolyse te ondersteunen.</li>
	<li>Voeg 150 μL van 1 M Trizma-HCl en 10 μL 100 mM mBBr toe; Vortex op hoog voor 10 seconden. Dit brengt de pH naar ongeveer 8 om de mBBr-reactie te ondersteunen met gratis CoA.</li>
	<li>Inincuberen monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker om te waarborgen dat alle CoA-derivaten met mBBr worden afgeleid.</li>
	<li>Voeg 100 μL azijnzuur toe en Vortex op hoog voor 10 s om de reactie te stoppen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 15 minuten tot pellet neergeprecipiteerd celpuin.</li>
	<li>Verwijder en bewaar supernatant in een glazen reageerbuis voor de clean-up van de SPE-kolom (hieronder beschreven).</li>
</ol>5. voorbeeld opschonen met de kolom vaste fase extractie (SPE)
<ol><li>Bij kamertemperatuur, elke wegwerp 2-(2-pyridyl)-ethyl silicagel kolom (1 mL grootte) met 1 mL van de reinigings buffer om ervoor te zorgen dat de pyridyl functionele groep is geprotoneerd en zal fungeren als een anionenwisselaar. 2-(2-pyridyl)-ethyl silicagel is een zwakke anionenwisselaar die ideaal is voor CoA-bimanen bij een basis pH. 2-(2-pyridyl)-ethyl silicagel heeft een pKa van 6 en de elutie wordt gedaan pH ≥ 7.</li>
	<li>Voeg een monster supernatant (stap 4,11) toe aan de kolom en verzamel eluaat.</li>
	<li>Spoel de kolom tweemaal met 1 mL reinigings buffer om onbewaarde soorten te verwijderen.</li>
	<li>Reinig de kolom eenmaal met 1 mL water.</li>
	<li>Spoel de kolom tweemaal met 1 mL elutie buffer in een aparte glazen reageerbuis (12 mm x 75 mm) om het CoA-bimane te verzamelen.</li>
	<li>Droge CoA-bimane monster in buis onder stikstof gas te droogheid. Het gedroogde monster is stabiel bij kamertemperatuur tot verder gebruik. Afdichting en volledig bedekken de buis en de winkel.</li>
	<li>Als u klaar bent voor HPLC-analyse, hervat u het monster in 300 μL water en meng u krachtig door Vortex op hoog voor 10 s.</li>
	<li>Breng het resuspendeerde monster over in een centrifugebuis filter (0,22 μm cellulose acetaat, 2 mL) en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 5.000 x g om eventuele precipitaat te verwijderen.</li>
	<li>Breng gefilterd monster over naar een glazen injectieflacon die geschikt is voor HPLC-injectie.</li>
</ol>6. HPLC-zuivering en-meting van CoA-bimane
<ol><li>Buffers voorbereiden. Buffer A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Buffer B: acetonitril (Optima-kwaliteit).</li>
	<li>Schakel het HPLC-systeem in. Opmerking: het HPLC-systeem in ons laboratorium is een watere2695 Scheidingsmodule die is uitgerust met een 2489 ultraviolette (UV-VIS) extinctie detector en een 2475 fluorescentiedetector die wordt aangestuurd met de Empower 3-software. Het systeem heeft ook een geautomatiseerde monster injector.</li>
	<li>Injecteer elk monster (bv. 20 μL) voor scheiding op een Gemini C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm kolom met behulp van het programma in tabel 1 met een debiet van 0,5 ml/min. De kolomtemperatuur is 25 °C. Meet de extinctie van de UV/zichtbare detector bij λ 393 nm en de fluorescentiedetectie bij λex = 393 nm, λem = 470 nm. De retentietijd wordt bepaald door een CoA-bimane-standaard curve uit te voeren voor elke set samples.</li>
	<li>Noteer het gebied onder de CoA-bimane piek voor elk monster en vergelijk met de standaard curve om pmol van CoA-bimane geïnjecteerd op de HPLC-kolom te berekenen. De CoA-bimane extinctie standaard curve wordt gebruikt voor weefselmonsters, en de CoA-bimane fluorescentie standaard curve wordt gebruikt voor weefselcultuur monsters.</li>
	<li>Aangezien de waarden van het CoA-bimane het totale CoA voor elk monster vertegenwoordigen, normaliseert u het aantal levensvatbare cellen voor kweek monsters of mg nat gewicht voor weefselmonsters (Figuur 6). Als alternatief berekent u de totale CoA-waarden na normalisering naar DNA of eiwitgehalte voor elk monster. DNA-of eiwitgehalte kan afzonderlijk worden bepaald met behulp van monster aliquots die worden verwijderd tijdens de monstervoorbereiding voorafgaand aan KOH addition.</li>
</ol>

<ol><li>Abiko, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbiko%2C+Y+%22Metabolic+Pathways%22">Metabolic Pathways</a>. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).</li>
<li>Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A%3A+Back+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li>
<li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li>
<li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pantothenate+kinase+gene+%28PANK2%29+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li>
<li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li>
<li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107(2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li>
<li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li>
<li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871(2012).</li>
<li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li>
<li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013(2015).</li>
<li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li>
<li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399(2018).</li>
<li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104(2017).</li>
<li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-4%27-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260(2017).</li>
<li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li>
<li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li>
<li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li>
<li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li>
<li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isolation+procedure+for+short-%2C+medium-%2C+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li>
<li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li>
<li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanes+.17.+%28Haloalkyl%29-1%2C5-Diazabicyclo%5B3.3.0%5DOctadienediones+%28Halo-9%2C10-Dioxabimanes%29+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol%2C+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li>
<li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).</li>
<li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toyoda+A%2CChohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li>
<li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A%2C+dephospho-coenzyme+A%2C+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li>
<li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li>
</ol>

MWF, CS en SJ schreven de krant, MWF en CS verstrekte de gegevens en de cijfers, COR ontwierp de experimenten en heeft het manuscript kritisch bekeken. SJ en Cor zijn uitvinders op een octrooiaanvraag in behandeling (PCT/US17/39037) "kleine molecuul modulatoren van pantothenaat kinases" gehouden door St. Jude children's Research Hospital die betrekking heeft op de PZ-2891 compound waarnaar wordt verwezen in dit artikel.

Hier tonen we een betrouwbare, stapsgewijze procedure voor het kwantificeren van totaal CoA in cellen en dierlijke weefsels met een breed scala aan lineaire detectie die toegankelijk is in veel laboratoria met een HPLC met een absorptie-of fluorescentie-uitgangs detector. Als alternatief is massaspectrometrie een veelgebruikte techniek voor het evalueren van CoA-en CoA-thioesters, maar is niet algemeen beschikbaar vanwege de kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde kennis die nodig is voor de ontwikkeling van ...

Co-enzym A (CoA) is een essentiële cofactor in alle levende organismen en wordt gesynthetiseerd uit pantotheenzuur, ook wel pantothenaat (het zout van pantotheenzuur) of vitamine B5. CoA is de belangrijkste intracellulaire drager van organische zuren, met inbegrip van korte-keten-zuren zoals acetaat en succinaat, tak-keten zuren zoals propionaat en methylmalonaat, lange-keten vetzuren zoals palmitaat en OLEAAT, zeer lange-keten vetzuren zoals meervoudig onverzadigde vetzuren en xenobiotica zoals valproïnezuur. Het organisch zuur vormt een thio ester binding enzymatisch met CoA om het gebruik ervan als substraat in meer dan 100 reacties in intermediair metabolisme1mogelijk te maken. CoA thioesters zijn ook allosterische regelgevers en transcriptionele activatoren. Het wordt nu gewaardeerd2 dat de cellulaire totale COA-levering is gereguleerd3,4; de beschikbaarheid van CoA kan dus worden beperkt en dat CoA-tekortkomingen catastrofaal kunnen zijn, zoals blijkt uit erfelijke genetische aandoeningen die van invloed zijn op CoA-biosynthese5. Pantothenate kinase katalyseert de eerste stap in CoA biosynthese (Figuur 1) en pantothenaat kinase geassocieerde neurodegeneratie, genaamd pkan, wordt veroorzaakt door mutaties in het PANK2 gen6. CoA-synthase, gecodeerd door het Coasyn -gen, katalyseert de laatste twee stappen in COA-biosynthese (Figuur 1) en Coasy eiwit-geassocieerde neurodegeneratie, genaamd Copan, wordt veroorzaakt door een mutatie in het coasyn Gene7. Zowel PKAN als CoPAN zijn erfelijke neurodegeneratieve ziekten geassocieerd met ijzer ophoping in de hersenen en CoA-tekortkomingen ten ondermeer de pathologieën van de ziekte.
Cellulaire niveaus van totaal CoA variëren tussen de weefsels8 en het totale COA kan verhogen of verlagen onder een verscheidenheid van fysiologische, pathologische en farmacologische toestanden. Lever CoA stijgt tijdens brandstof overschakelen van de Fed naar de nuchtere staat9, en lever COA niveaus zijn abnormaal hoog in leptine-deficiënte zwaarlijvige muizen10. Lever CoA afneemt in reactie op chronische ethanol inname11. Hersenen CoA-niveaus in de Pank2 Knockout muismodel zijn depressief tijdens de perinatale periode, maar later in de volwassen fase hersenen COA-inhoud is gelijkwaardig aan wild-type niveaus, wat duidt op een adaptieve COA reactie tijdens ontwikkeling12. Manipulatie van weefsel-COA-inhoud door Transgenese of genafgifte methoden beïnvloedt metabole en neurale functies13,14,15. De preklinische ontwikkeling van mogelijke therapieën voor pkan of Copan omvat de COA-metingen van cellen of weefsels als indicatoren voor de werkzaamheid16,17,18,19,20 . Evaluatie van al deze voorwaarden en hun metabole of functionele gevolgen vereist een kwantitatieve methode voor het meten van het totale CoA.
Een nauwkeurige, betrouwbare assay voor het meten van CoA in biologische monsters is een technische uitdaging in veel laboratoria. Helaas zijn er geen sondes beschikbaar om CoA-of CoA-thioesters in intacte cellen te evalueren of te kwantificeren, hoewel analogen van natuurlijke CoA-thioesters op grote schaal zijn gebruikt als mechanistische sondes in studies van CoA-ester met behulp van enzymen21. De omzetting van CoA, met een vrije sulfhydrylgroep (-sh) groep, naar een CoA thio ester (of omgekeerd) is snel in cellen of dierlijk weefsel tijdens overdracht naar een andere omgeving en tijdens cel lysis. Talrijke acyl-CoA-synthetases en acyl-CoA-thioesterasen in cellen bemiddel de interconversies binnen de CoA-groep en aanvullende enzymen die gebruikmaken van CoA thioesters als substraten blijven actief in biologische monsters totdat ze worden geblust door chemische of fysische Betekent. De off-loading van acyl-groepen van CoA naar carnitine door acyl-transferases is een voorbeeld binnen het netwerk van reacties dat de CoA/CoA thio ester distributie kan veranderen. Radioactieve tracers kunnen worden gebruikt om de frequenties van de CoA-synthese in cellen te meten. De huidige methoden voor het meten van CoA-en CoA-derivaten in biologische monsters zijn22 beoordeeld en omvatten gekoppelde enzymatische spectrofotometrische assays, hogedrukvloeistofchromatografie en op massaspectrometrie gebaseerde procedures. Deze methoden zijn echter vaak gericht op specifieke CoA-moleculaire soorten en zijn blind voor variatie van het totale CoA-zwembad. De gekoppelde enzymatische assays vereisen over het algemeen grotere hoeveelheden input materiaal als gevolg van lage detectie gevoeligheden en hebben een beperkt bereik van lineariteit.
Ons laboratorium heeft een betrouwbare procedure ontwikkeld voor de kwantificering van totaal CoA in gekweekte cellen en dierlijke weefsels. De strategie omvat de hydrolyse van alle CoA-thioesters om alleen gratis CoA te leveren tijdens de monstervoorbereiding, in plaats van inspanningen te leveren om het gehele spectrum van CoA-soorten te behouden en te analyseren. De procedure is een compilatie van afzonderlijke gepubliceerde methoden voor monstervoorbereiding, COA-derivatisering, zuivering en identificatie na hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en kwantificering van het guarderivaten CoA door absorptie of fluorescentiedetectie23,24,25. De door deze procedure verkregen CoA-bepalingen hebben ons inzicht in de CoA-regulatie en de ontwikkeling van een therapeutische aanpak voor de behandeling van CoA-tekortkomingen mogelijk gemaakt.

<table><tbody><tr><td>2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>coenzyme A</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870700</td><td></td></tr><tr><td>Gemini C18 3 &mu;m 100 &Aring; HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>monobromobimane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Tip probe tissue disrupter</td><td>Omni International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X centrifuge tube filter</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Fisher</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2475 fluorescence detector</td><td>Waters</td><td>2475</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2489 UV-Vis detector</td><td>Waters</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>Waters e2695 separations module</td><td>Waters</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van co-enzym a in cellen en weefsels

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Opkomende onderzoek is gebleken dat het cellulaire co-enzym A (CoA) levering kan worden beperkt met een nadelig effect op de groei, metabolisme en overleving. Meting van cellulaire CoA is een uitdaging vanwege de relatief lage overvloed en de dynamische omzetting van gratis CoA naar CoA thioesters die, op zijn beurt, deelnemen aan talrijke metabole reacties. Een methode wordt beschreven die tijdens de monstervoorbereiding door potentiële valkuilen navigeert om een assay te leveren met een breed lineair detectiebereik dat geschikt is voor gebruik in vele biomedische laboratoria.

Een relatief snelle en betrouwbare methode voor de detectie van totaal CoA in gekweekte cellen en weefsels is ontwikkeld door het thiol van CoA te derivatiseren tot een fluorescerende stof met behulp van mBBr, en vervolgens de afgeleide CoA-bimane te zuiveren met behulp van omgekeerde fase HPLC. Een standaard curve wordt eerst gegenereerd, waar bekend en toenemende hoeveelheden van de CoA-bimane standaard worden individueel geïnjecteerd en de gebieden onder de pieken in de CoA-bimane chromatogrammen worden uitgezet als e...

Deze methode beschrijft de monstervoorbereiding uit gekweekte cellen en dierlijk weefsel, extractie en derivatisering van coenzym A in de monsters, gevolgd door hogedrukvloeistofchromatografie voor zuivering en kwantificering van het guarderivaten coenzym a door absorptie of fluorescentiedetectie.

Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Coenzyme A, kortweg CoA genoemd, is een belangrijke cofactor in de cellulaire stofwisseling. Kwantitatieve metingen onthullen veranderingen die gebeuren met voedings- en hormonale toestanden in diermodellen. Deze methode kwantificeert de totale hoeveelheid cellulaire CoA, inclusief CoA derivaten en gratis CoA, in een eenvoudige, betrouwbare methode.Verschillende soorten neurodegeneratie met hersenijzeraccumulatie worden geassocieerd met mutaties in de genen van het CoA biosynthetische traject. Deze methode kan worden toegepast op elk biologisch systeem, omdat alle organismen coa nodig hebben om te overleven, groei en functie. Een eerste keer onderzoeker kan worstelen met de eerste stappen in de voorbereiding van het monster, waar het belangrijk is om de monsters absoluut koud te houden en ze vervolgens snel over te brengen naar kaliumhydroxide.Beperk het aantal monsters in een partij voordat u overbrenging naar kaliumhydroxide, en oefen met de overdracht voordat u met de experimentele monsters werkt. Veel onderzoekers zijn niet bekend met vaste fase extractie bij de voorbereiding van biologische monsters voor latere biochemische analyse. Om te beginnen, incubeer drievoud drievoud cultuur gerechten in parallel, twee voor biochemische analyse en een voor de bepaling van levensvatbare celnummer.Wanneer de cultuur de late subconfluent dichtheden benadert, bijvoorbeeld, menselijke HepG2/C3A cellen gegroeid tot een dichtheid van zes tot acht keer 10 tot de zes of HEK 293T cellen gegroeid tot een dichtheid van ongeveer 1,3 keer 10 tot de zeven per 100-millimeter schotel, oogst de aanhangende cellen in de cultuur. Voeg vervolgens een milliliter ijskoud water toe aan hetzelfde kweekgerecht. Schraap cellen in het koude water in de schotel en breng de celsuspensie over in een glazen reageerbuis met 400 microliter van 0,25-molaire kaliumhydroxide en 1,5 milliliter water om de pH boven de 12 te brengen.Meng de vering krachtig door vortexing op hoog gedurende 10 seconden. Bedek dan strak met paraffine film, en uitbroeden op 55 graden Celsius gedurende een uur zonder te schudden in een waterbad. Voeg vervolgens 160 microliter van een molaire Trizma-hydrochlorideoplossing en 10 microliter van 100 millimolar mBBr toe.Meng door vortexing op hoog voor 10 seconden. Dit brengt de pH tot ongeveer acht om de mBBr reactie met gratis CoA te ondersteunen. Bedek de buis met paraffinefilm en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende twee uur in het donker voor de mBBr om te reageren met de thiol van het CoA.Voeg na twee uur 100 microliter azijnzuur toe en meng door 10 seconden te vortexen om de reactie te stoppen. Een precipitatie vormt zich in de buis. Vervolgens centrifuge op 2.000 keer g gedurende 15 minuten.Om het neergeslagen celpuin te verwijderen, breng je het supernatant over en sla je het op in een glazen reageerbuis voor de clean-up van de vaste faseextractiekolom. Voeg voorafgaand aan de analyse twee milliliter kaliumhydroxide toe aan een glazen reageerbuis die is ontworpen voor het inbrengen van een sonde en weefselverstoring met een rotor-statorhomogenisator. Houd de buis op ijs tot gebruik.Weeg de bevroren weefselstukken snel af en leg het natte gewicht voor elk monster vast. Breng het weefsel in de glazen buis, en homogeniseren het weefsel voor 30 seconden. Vermijd volledige ontdooiing van het weefsel.Voeg 500 microliter van 0,25-molaire kaliumhydroxide toe. Vortex op hoog voor 10 seconden, en blijf op ijs. Dit brengt de pH van het monster boven de 12 om de CoA-thioesters te hydrolyseren om het totale COA op te leveren.Bedek de buis met paraffinefilm. De bereiding van gekweekte cellen en de bereiding van weefsels zijn de meest kritieke stappen in deze procedure. Het is belangrijk om snel hoge kaliumhydroxide toe te voegen om coa-afbraak te voorkomen.Incubeer de monsters op 55 graden Celsius gedurende twee uur in een waterbad zonder te schudden om hydrolyse te ondersteunen. Voeg vervolgens 150 microliter van een molaire Trizma-hydrochloride en 10 microliter van 100-millimolar mBBr toe om de pH op ongeveer acht te brengen voor het ondersteunen van de mBBr-reactie met vrij CoA. Vortex op hoog gedurende 10 seconden.Bedek de buis met paraffinefilm en broed de monsters twee uur lang in het donker op kamertemperatuur uit om ervoor te zorgen dat het CoA wordt afgeleid met mBBr. Voeg daarna 100 microliter azijnzuur toe en draaikolk gedurende 10 seconden op hoog om de reactie te stoppen. Centrifuge op 2.000 keer g gedurende 15 minuten om neergeslagen celpuin te pelleteren en breng het supernatant over in een glazen reageerbuis voor de clean-up van de vaste faseextractiekolom.Bij kamertemperatuur, equilibrate elke een-milliliter wegwerp 2-2-pyridyl-ethyl silica gel kolom met een milliliter wasbuffer om ervoor te zorgen dat de pyridyl functionele groep is protonated en zal functioneren als een anion wisselaar. Vervolgens pipette het monster supernatant op de kolom, en het verzamelen van de eluate. Was de kolom twee maal met een milliliter wasbuffer en eenmaal met een milliliter water om niet-gekleurde soorten te verwijderen.Vervolgens, in een aparte glazen reageerbuis, was de kolom twee keer met een milliliter elutie buffer om de CoA-bimane te verzamelen. Droog het CoA-bimane monster in de buis onder stikstofgas. Seal, volledig dek de buis, en op te slaan op min 20 graden Celsius.Wanneer het klaar is voor HPLC-analyse, wordt het monster opnieuw opgetrokken in 300 microliter water en meng krachtig door gedurende 10 seconden op hoog te draaien. Breng het opnieuw opgespente monster over in een centrifugebuisfilter en vercentrifuge gedurende 10 minuten op 5.000 keer g om eventuele neerslag te verwijderen. Breng het gefilterde monster vervolgens over naar een glazen flacon die geschikt is voor HPLC-injectie.In deze studie toont een representatief HPLC-profiel de bewaartijd van de CoA-bimane-standaard op de C18 HPLC-kolom. Steeds meer van de CoA-bimane standaard werden individueel geïnjecteerd, en de gebieden onder de pieken in de CoA-bimane chromatogrammen werden uitgezet als functie van de input CoA-bimane. De standaardcurve weerspiegelde de omvang van de absorptie van CoA-bimane op een golflengte van 393 nanometer.De fluorescentie van CoA-bimane werd ook weerspiegeld op de excitatiegolflengte van 393 nanometer en emissiegolflengte van 470 nanometer. Latere HPLC-scheiding en typische detectieprofielen voor muislever of menselijke gekweekte C3A-cellen worden hier aangegeven door rode pieken, met een retentietijd tussen 11 en 12 minuten met behulp van het elutieprogramma. Als de reactie met mBBr geen detecteerbare resultaten oplevert, moet de hoeveelheid Trizma-HCl mogelijk worden aangepast om de pH te verlagen tot ongeveer acht.Het is mogelijk om extra cellulaire moleculen te detecteren die sulfhydryl of thioestermoieties als bimanederivaten bevatten. Glutathion-bimane kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd met de HPLC-methode. Deze techniek zal andere onderzoekers in staat stellen om de mogelijke rol van CoA disfunctie geassocieerd met metabole onbalans te onderzoeken, zoals dierlijke modellen van type 2 diabetes.Onderzoekers moeten persoonlijke beschermingsmiddelen gebruiken bij het werken met organische oplosmiddelen die worden gebruikt voor de winning in vaste fase.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates a quantification technique for CO2 released during substrate oxidation using 14C-radiolabeled substrates. The released 14CO2 is trapped in an alkaline solution and quantified by a scintillation counter. The oxidation of different substrates varies between tissues and reflects the pathophysiological condition of the tissue.

Substrate Oxidation Assay in Cultured Cells: An In Vitro Assay to Quantify Substrate Oxidation in Cells by Measuring Radioactive Signals from Trapped CO2

This video demonstrates an in vitro technique to assess iron bioavailability in complex food sources. The technique combines the simulation of human digestion along with iron uptake by differentiated Caco-2 cells. Intracellular ferritin formation acts as a marker for cellular iron uptake.

Caco-2 Cell Bioassay: An In Vitro Method for Measuring Iron Bioavailability in Complex Food Sources

Veranderde niveaus van intracellulair heem worden geassocieerd met veelvoorkomende ziekten zoals kanker. Daarom is er behoefte aan het meten van de niveaus van heembiosynthese in verschillende cellen. Het doel van dit protocol is om een snelle en gevoelige methode te bieden om de niveaus van heemsynthese in verschillende cellen te meten en te vergelijken.

Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen

Hier laten we geïsoleerde humane bloedplaatjes kan worden gebruikt als een toegankelijke ex vivo model metabole aanpassingen studeren in reactie op de remmer complex I rotenon. Deze benadering maakt gebruik van isotopische tracering en relatieve kwantificatie door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en kan worden toegepast op een verscheidenheid van studieopzetten.

LC-MS analyse van menselijke bloedplaatjes als een platform voor het bestuderen van mitochondriaal Metabolisme

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.

Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

De Caco-2 cel bioassay voor ijzer (Fe) biologische beschikbaarheid vertegenwoordigt een kosteneffectieve en veelzijdige aanpak om fe biologische beschikbaarheid te beoordelen van voedingsmiddelen, voedingsproducten, supplementen, maaltijden en zelfs dieetregimes. Grondig gevalideerd voor menselijke studies, vertegenwoordigt het de state-of-the-art voor studies van fe biologische beschikbaarheid.

De Caco-2 Cell Bioassay voor het meten van de biologische beschikbaarheid van ijzer in levensmiddelen

Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Dit protocol beschrijft een in vitro test voor het meten van de cellulaire lipideopname in endotheelcellen na stimulatie met BODIPY-C12 en BODIPY-C16 fluorescerende analogen van verzadigde vetzuren met lange en zeer lange ketens. Deze methode is efficiënt en kan worden aangepast aan andere celtypen en biedt een nuttige benadering voor het bestuderen van het lipidenmetabolisme.

Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

Leer co-enzym A kwantificeren in cellen en weefsels met behulp van HPLC-detectie. Deze methode biedt betrouwbare metingen van totale CoA-niveaus voor metabolisme- en neurodegeneratieonderzoek.

Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels

Meer video's verkennen