Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

De evaluatie van moleculaire profielen in lokale weefsels is een cruciale stap naar het begrijpen van het werkingsmechanisme van actieve geneesmiddelen, aangezien ze worden geëvalueerd in ziekterelevante preklinische modellen. Op het gebied van artritis onderzoek, de lokale weefsel omgeving van belang is de kleine gewicht-dragende gewrichten die zijn samengesteld uit een complex mengsel van bot, kraakbeen, spier, en immuuncellen. Hier beschrijven we een betrouwbare robuuste methode voor de mechanische verstoring en/of verpulvering van deze complexe weefselomgeving in een cryogenisch gecontroleerde omgeving.

Deze methode kan vervolgens worden gebruikt om downstream proteomische en transcriptie profilering inspanningen voor de vaststelling van moleculaire handtekeningen van de ziekte te genereren uit een enkele uniforme monsterbron. Deze methode genereert een homogeen poeder in tegenstelling tot veel andere oude technieken. Bovendien zorgt de oude temperatuurisolatieprocedure voor de isolatie van hoogwaardig RNA.

Deze methode kan vervolgens worden gebruikt voor het genereren van downstream proteomische en transcriptie profilering waardoor moleculaire karakterisering van relevante ziekte trajecten van belang. Deze methode kan inzichten bieden aan elk onderzoeksveld dat moleculaire handtekeningen uit weefsels ontleedt. De methode kan worden uitgebreid tot elk complex weefselsysteem dat dichte en moeilijk te scheiden bestanddelen heeft.

Hoewel we niet hebben geëvalueerd op dit punt, konden we zien potentiële toepassing op dichte kraakbeen weefsels zoals oren of botten. De tijd-kritische aard van de overdracht van het poeder naar buizen voor het wegen is iets dat de praktijk vergt. Als er te veel tijd wordt genomen, zal het poeder beginnen te ontdooien en amorf worden.

Het is belangrijk om het aantal monsters te beperken tot 10 tot 15 totdat u zich comfortabel voelt met de procedure. Op de dag van weefselverwerking, prechill alle benodigde instrumenten op droogijs gedurende minimaal 10 minuten. Draag thermische handschoenen om te voorkomen dat u wordt geschaad door de extreme kou.

Breng vervolgens elk van de geprepareerde muizenpoot over in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en maak onmiddellijk de vrieskou in vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren poten op negatieve 80 graden Celsius. Vul een vrieshuis met vloeibare stikstof en laat deze minstens 10 minuten in evenwicht komen.

Plaats het onbewerkte monster op droogijs en bewaar het daar om vries-/dooicycli te voorkomen. Breng vervolgens een achterpoot over in een voorgekoelde grote polycarbonaat slijpen flacon met een onderste stalen stekker. Steek het voorgekoelde stalen botslichaam in en sluit de meervoudigcarbonaat slijpsel met de voorgekoelde topstalbout.

Breng de grote polycarbonaat slijpffekjes met de monsters in de voorgevulde vriesmolen en sluit het deksel met de rubberen sluiting aan de voorzijde van het instrument. Laat de monsters een minuut afkoelen in de vloeibare stikstof. Stel vervolgens de vriesmolen in op het programma van één minuut met 10 cycli per seconde.

Druk op de run-knop en wacht tot de vriesmolen zijn cyclus heeft voltooid. Open hierna het deksel van de vriesmolen en haal de grote polycarbonaatslijm flacon eruit. Plaats de slijpbladl in een afzuigkap en verwijder de bovenste stalen stekker door neerwaartse druk op de zwarte handgreep te plaatsen totdat de stalen stekker uit de polycarbonaatbuis schuift.

Breng de geopende slijpblad op droogijs en gebruik voorgekoelde tangen om het stalen botslichaam te verwijderen. Breng het bevroren poeder in een voorgekoelde conische buis van 50 milliliter. Weeg tussen 30 en 50 milligram bevroren poeder af in een gelaagde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor RNA-extractie en tussen 100 en 200 milligram voor eiwitextractie.

Bewaar de verpulverde monsters bij negatieve 80 graden Celsius en ga binnen 24 uur over tot RNA- en eiwitisolatie. Voeg eerst 10 microliter bèta-mercaptoethanol toe voor elke milliliter RLT-buffer. Bereken het volume RLT-buffer dat overeenkomt met een verhouding van 23,3 milliliter per milligram weefsel en voeg het juiste volume RLT-buffer met bèta-mercaptoethanol toe aan de buis met bevroren poeder.

Vortex het monster op 3,000 RPM gedurende 10 seconden. Gebruik een een milliliter pipetter om krachtig op en neer te pipette 10 keer en vortex het monster weer op 3,000 RPM voor 20 seconden. Centrifuge op 13.000 keer g gedurende twee minuten en breng 700 microliter van de supernatant over naar een verse buis.

Voeg 700 microliter van 70% ethanol toe aan deze buis en laad 700 microliter van het monster op een RNA-zuiveringskolom. Centrifugeren de buis met een snelheid van ten minste 10,000 keer g gedurende 30 seconden. Gooi de doorstroom weg en laad het resterende deel van het monster op de kolom RNeasy en centrifuge de buis opnieuw met een snelheid van ten minste 10,000 keer g gedurende 30 seconden.

Gooi de doorstroom weg en was de kolom door 700 microliter RW1-buffer toe te voegen en gedurende 30 seconden minstens 10,000 keer g te centen. Als de uitvoerende optie DNAse-spijsvertering wordt 350 microliter rw1 toegevoegd voorafgaand aan de behandeling met DNAse. En na de behandeling met DNAse wordt nog eens 350 microliter RW1 toegevoegd.

Was vervolgens de kolom twee keer door 500 microliters RPE-buffer toe te voegen en centrifuge met een snelheid van ten minste 10.000 keer g gedurende 30 seconden om ervoor te zorgen dat de stroom door elke keer wordt weggegooid. Droog de kolom daarna met een snelheid van minstens 10.000 keer g gedurende twee minuten. Elute het RNA door het toevoegen van 50 microliters water en centrifugeren met een snelheid van ten minste 10,000 keer g gedurende twee minuten.

Verzamel de flow-through en breng deze over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Bepaal de hoeveelheid RNA met behulp van de methode van de onderzoeker van keuze en op te slaan op negatieve 80 graden Celsius voor verdere analyse. Verdun de 10X cel lysis stock oplossing tot 1X cel lysis voorraad oplossing met cel cultuur kwaliteit water.

Reconstrueer de proteaseremmer cocktailset met één milliliter water om een 100X proteaseremmer voorraad te maken. Voeg 100 milliliter proteaseremmer toe aan 9,9 milliliter 1x cellysebuffer om een 1X uiteindelijke voorraadoplossing te verkrijgen. Voeg vier microliters van ijskoude cel lyse buffer voor elke milligram weefsel poeder en voeg een vijf millimeter roestvrij stalen kraal aan de buis.

Vortex de buis op 3,000 RPM gedurende 60 seconden. Breng de buis over op nat ijs en ga door naar het volgende monster. Bovendien, onderzoekers kunnen vinden dat het plaatsen van de doos verticaal kan een betere mengen met de kraal te vergemakkelijken.

Na een uur, centrifugeren de buizen op 10,000 keer g en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatants in een verse buis om ervoor te zorgen dat de vetlaag op de top te voorkomen. Bepaal de totale eiwitconcentratie.

Aliquot elk monster in 1,5 milliliter microcentrifuge buizen en bewaar ze op negatieve 80 graden Celsius tot klaar om verdere analyse uit te voeren. In deze studie wordt een cryogene verpulveringsmethode gebruikt om murinepoten te verwerken om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit uit de weefsels te verbeteren en de analyse mogelijk te maken van moleculaire profielen geassocieerd met ontstekingsreacties. Een representatieve gel beeld visualisatie toont de RNA gewonnen uit voorpoten van CIA muizen.

De 28S rRNA en de 18S rRNA banden geven aan dat alle monsters voldoende intact RNA hebben. Een representatieve spreidingsplot van de totale eiwitconcentraties op basis van eiwit BCA analyse wordt hier getoond. De totale eiwitconcentraties van naïeve muizen, CIA-muizen of CIA-muizen onder verschillende behandelingen zijn vergelijkbaar tussen groepen.

Luminex-analyses worden vervolgens uitgevoerd om de concentraties van inflammatoire cytokinen en chemokines in het eiwitextract te bepalen. Een representatieve spreidingsplot van de concentraties van genormaliseerde cytokines en chemokines onthult dat in vergelijking met naïeve muizen, verschillende cytokinen zijn verhoogd in CIA muizen en behandeling met anti-IL17A antilichaam aanzienlijk remt de productie van verschillende cytokines. Microarray analyse wordt uitgevoerd om transcriptome veranderingen in de CIA en behandeling-gerelateerde effecten te evalueren.

Een representatieve warmtekaart plot van genen aanzienlijk toegenomen in CIA muizen in vergelijking met naïeve muizen wordt hier getoond. Bij het uitvoeren van deze procedure is het van cruciaal belang voor onderzoekers om de tijd dat de buis en het poeder uit droogijs worden gehouden te minimaliseren. Dit helpt het ontdooien van het poeder en de daaropvolgende problemen met het gedegradeerde RNA en eiwit te voorkomen.

De hoge kwaliteit van de moleculaire handtekeningen gegenereerd door deze techniek stelt onderzoekers in staat om het unieke profiel te ondervragen dat een therapeutisch zal geven en maakt het verder mogelijk voor de differentiatie van mechanismen die kunnen worden gebruikt om artritis aandoeningen te behandelen. Deze techniek kan worden gebruikt om een aantal dichte weefsels zoals oren en botten te extraheren om moleculaire handtekeningen in deze weefsels van belang verder te evalueren. Begrijpen hoe therapeutica moduleren de moleculaire kenmerken van de ziekte stellen ons in staat om beter te evalueren welke specifieke signalering trajecten worden gemoduleerd.

En misschien nog belangrijker, welke trajecten zijn niet geregeld met het therapeutische mechanisme wordt geëvalueerd. Bij het werken met vloeibare stikstof en droogijs is het noodzakelijk om persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken, waaronder goed beoordeelde handschoenen en gezichtsschilden. Blootstelling van de huid voor meer dan een paar seconden kan leiden tot ernstige brandwonden.

Bij het werken met grote hoeveelheden droogijs is het belangrijk om in een goed geventileerde ruimte te werken, omdat droogijs kooldioxide vrijgeeft.