Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

Dit protocol is een eenvoudige flow cytometrie gebaseerde test waardoor meting van mitochondriale membraan potentieel en mitochondriale massa in levende cellen. Standaard metabolische testen mislukken bij het werken met zeldzame populaties zoals de hematopoietische stamcellen. Deze methode stelt gebruikers in staat mitochondriale membraanprofilering te gebruiken bij het werken met een laag aantal cellen en om nieuwe metabole modulatoren van cellen zoals de HSCs te bepalen.

Bovendien u het combineren met downstream functionele tests zoals beenmergtransplantatie of kolonievormende testen om de functionaliteit van uw cellen na de cultuur te bepalen. Onze techniek kan worden benut voor de identificatie van nieuwe moleculen die de HSC-functie kunnen verbeteren in het kader van beenmergtransplantatie en hematopoietisch immuunherstel na ablatieve therapieën. Zoals beschreven in ons protocol, kan onze methode worden gebruikt om metabole geschiktheid van immuun T-cellen te evalueren.

Het is zeer belangrijk dat de cellen hebben minimale blootstelling aan licht na vlekken. Bovendien moet het gebruik van pompremmer verapamil worden opgenomen om de bijdrage van pompeflux te evalueren. Gebruikers moeten zich er echter van bewust zijn dat verapamil het ionische evenwicht diepgaand verstoord en niet kan worden gebruikt om het effect van een metabole modulator op het mitochondriale membraanpotentieel te evalueren.

Visuele demonstratie van deze methode is uiterst belangrijk omdat er een aantal kritieke stappen die men nodig heeft om in gedachten te houden bij het werken met een laag aantal cellen, en deze stappen zijn heel vaak ontbreekt in de reguliere kranten die gebruikers lezen op PubMed. Voor FAC sortering wordt de LKS-populatie, gedefinieerd door afstamming negatief, Sca1-positief, cKit-positief geïdentificeerd. Hematopoietische stamcellen van ongeveer vijf tot 10% van de cellen in de LKS-populatie worden geïdentificeerd door gating voor CD150 positieve, CD48 negatieve populatie, aangeduid als HSCs.

Na het sorteren van heatopoietische stamcellen, centrifugeer de buizen op 300 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het grootste deel van de supernatant zonder los te maken van de pellet, en laat 50 tot 80 microliters op de top van de cel pellet. Resuspend de celpellet in stamcelexpansiemedium tot een eindvolume van 200 microliters.

Bereid een steriele weefselkweek behandeld 96 U-bottom goed plaat, en identificeren van de putten waar de cellen zullen worden gekweekt. Breng 100 microliter van 2x basaal medium eerder bereid in deze putten. In de NR goed gemarkeerd, voeg twee microliters van een 100x nicotinamide riboside oplossing.

Breng 100 microliters van 2x basaal medium in putten voor kleurbeheersing. Zaad 100 microliters van bereide hematopoietische stamcellen bovenop de putten met 2x basaal medium. Zaad 100 microliter van hele beenmergcellen op putten gemarkeerd als kleuring controles.

Voeg 200 microliters autoclaved water toe in alle omringende putten om verdamping van putten die cellen bevatten te verminderen. Plaats de plaat ongestoord in een couveuse op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende 72 uur. Neem de plaat om nicotinamide riboside aan te vullen om de 24 uur, en zet het terug in de couveuse.

Voeg aan het einde van de cultuurperiode twee microliters van 100x TMRM-oplossing en twee microliters van 100x groene fluorescerende vlekoplossing toe in elk van de testputten. Voeg twee microliters van 100x TMRM in de TMRM kleuring controle goed. Voeg twee microliters van 100x groene fluorescerende vlek in de MitoTracker kleuring controle goed.

Bedek de bovenkant van de plaat met aluminiumfolie. en plaats de plaat terug in een couveuse op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende 45 minuten. Haal de plaat uit de couveuse en vercentrifuge het vijf minuten op 300 keer g.

Omkeren van de plaat om de supernatant te verwijderen, en voeg 200 microliter van standaard FACS buffer om opnieuw tepenen. Bedek de plaat met folie. Centrifugeren de plaat op 300 keer g gedurende vijf minuten.

Herhaal deze wasstap drie keer. Resuspend de cellen in 200 microliters van FACS buffer, en overdracht naar FACS buizen. Als u de monsters op de stroomcytometer wilt uitvoeren, laadt u eerst de enkele kleurregelaars in de machine en registreert u ten minste 5.000 gebeurtenissen in elke één voor één.

Druk in de software op Acquire en vervolgens Record op het dashboard om enkele kleurbesturingselementen te verkrijgen en op te nemen. Druk op Compensatie-instelling en klik op Compensatie berekenen om de compensatie te berekenen. Zodra de compensatie is toegepast, verwerven van de hematopoietic stamcelmonster, en registreren zo veel mogelijk gebeurtenissen.

Exporteer de FACS-bestanden van de cytometer en open het bestand op de analysesoftware. Gebruik op FlowJo voorwaartse spreiding en zijverstrooiingsgating om de celpopulatie te identificeren. Identificeer singlets in de volgende poorten en plot vervolgens de DAPI-negatieve fractie die levende cellen vertegenwoordigt.

Maak in de live celpoort een contourplot in het TMRM en groen fluorescerend vlekkanaal om respectievelijk mitochondriaal membraanpotentieel en massa te meten. Exporteer de gemiddelde fluorescentieintensiteit van deze twee kanalen in de live celpoort. Exporteer vervolgens het aandeel cellen in de TMRM low gate in alle monsters.

De nicotinamide riboside behandeling toonde een duidelijke toename van de TMRM lage bevolking. Het verhoogde ook aanzienlijk het aandeel cellen in de TMRM lage poort en toonde een significante verlaging van de TMRM fluorescentie intensiteit. Mitochondriale massa veranderde niet op nicotinamide riboside suppletie.

Bovendien werd de kleuring van de stamcelmarkering gecombineerd met mitochondriale kleuring na de cultuur. Met de gating strategie om hematopoietische stamcellen te identificeren, blootstelling aan nicotinamide riboside toonde een aanzienlijke toename van de TMRM lage populatie en een aanzienlijke daling van de TMRM fluorescentie intensiteit in gated HSCs. De groene fluorescerende mitochondriale vlek groen signaal bleef ongewijzigd in de twee omstandigheden.

Het is belangrijk om de kleurplaat te bedekken met aluminiumfolie om de blootstelling van licht aan gekleurde monsters te minimaliseren. Deze methode kan worden gecombineerd met downstream tests zoals beenmergtransplantatie en kolonievormende testen om de functionaliteit van uw stamcellen te bepalen. Dus deze techniek maakt een eenvoudige screening methode voor de identificatie van nieuwe metabole modulatoren van HSCs.