Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur

Aangezien de microvasculaire stroom varieert tussen haarvaten en veranderingen in een tijdsloop van seconden, is een methode voor de continue kwantificering van de stroom over hele velden nodig. Het personeel maakt een bijna continue meting van de stroomsnelheden over hele microscoopvelden mogelijk, binnen enkele uren, die anders maanden zouden duren om handmatig te verkrijgen. Hoewel deze procedures eenvoudig zijn, zal visuele demonstratie nieuwe gebruikers aanzienlijk helpen om voor het eerst door personeel te navigeren.

Als u TrakEM2 wilt gebruiken om het vasculaire netwerk te definiëren, selecteert u eerst Bestand, Nieuw en TrakEM2 Blank om een nieuw leeg TrakEM2-project in te stellen en selecteert u de nieuwe map met de afzonderlijke afbeelding uit de film als de projectmap. De TrakEM2 ramen gaan open. Klik met de rechtermuisknop in het hoofdwerkgebied en selecteer Afbeelding importeren en importeren.

Navigeer naar de opgeslagen afbeelding en selecteer de afbeelding. Klik opnieuw met de rechtermuisknop in het hoofdwerkgebied en selecteer Canvas/Laagset weergeven en Automatisch wijzigen. Klik vervolgens links in het hoofdwerkvenster.

De afbeelding vult het werkgebied. Als u de gebieden in de afbeelding met het vasculaire netwerk wilt selecteren, klikt u in het kleinere TrakEM2-venster met de rechtermuisknop op sjabloon Alles en selecteert u Nieuwe onderliggende en gebiedslijst toevoegen. Sleep sjabloon Alles in het kleinere TrakEM2-venster naar Projectobjecten, zonder titel.

Sleep vervolgens sjabloon Alles, gebiedslijst, naar Projectobjecten, projecten zonder titel, Alles. Onder Projectobjecten, zonder titel, is nu de gebiedslijst Alles aanwezig. In het hoofdvenster TrakEM2 onder het tabblad Z-ruimte is een balk met het label Gebiedslijst gemaakt.

Klik hier om de lijst te selecteren. Selecteer in het hoofdvenster TrakEM2 het penseelgereedschap en klik tijdens het rollen van het muiswiel op Shift om een penseelgrootte te selecteren die kleiner is dan de diameter van de vasculatuur van belang. Druk op Control S om het project op te slaan.

Met behulp van de penseel gereedschap, verf het vasculaire netwerk, met uitzondering van een onscherpe gebieden. Wanneer de etikettering is voltooid, klikt u met de rechtermuisknop in het hoofdvenster TrakEM2 en selecteert u Export- en gebiedslijsten als labels. Selecteer Schalen, 100% en exporteer alle gebiedslijst in het pop-upvenster.

Sluit de TrakEM2-vensters en selecteer Ja om het project op te slaan. De afbeelding van gebiedslijst wordt geopend en kan worden weergegeven als een lege, zwarte afbeelding. Selecteer afbeelding, aanpassen en Helderheid/contrast in het hoofdmenu van Fiji.

Klik in het venster Helderheid en contrast op Automatisch en de gebiedslijst wordt zichtbaar. Selecteer afbeelding, opzoektabellen en opzoekttafel omkeren in het hoofdmenu van Fiji. Sla deze afbeelding van zwarte labels op de witte achtergrond op als een t-i-f-bestand en sluit de afbeelding.

Open het labelsbestand in Fiji en selecteer Plug-ins, Skeleton en Skeleton Eyes. Sla vervolgens de afbeelding Skeleton Eyes op als een t-i-f-bestand. Als u een nieuw personeelsproject wilt maken, selecteert u Plug-ins, macro's en Project Openen/maken en volgt u de aanwijzingen om een configuratiebestand te maken of bij te werken.

Navigeer in het menu Project openen/maken naar en selecteer de map Invoerbestand van het project en de invoerfilm- en skeletbestanden. Voer de waarden in voor de maximale gemeten snelheid, de in kaart gebrachte maximumsnelheid, de minimale segmentlengte, de pixelgrootte en de framesnelheid. Schakel het selectievakje Flikkeringen in als de afbeeldingen periodieke achtergrondintensiteit hebben flikkeren en klik op OK. Pas de parameters aan voor de beste visualisatie van de gegevens.

Stel de in kaart gebrachte maximumsnelheid in op ongeveer 95 procent van de gegevens, zodat de gegevens worden toegewezen over het volledige bereik van de kleurschaal. Als u het skelet wilt analyseren, selecteert u Plug-ins, macro's en Skeleton analyseren. Het skeletbestand wordt geopend en de manager regio van belang wordt geopend en uitgevoerd.

Klik in de manager Interessegebied op Alles weergeven en label en klik op OK. Als u de tijdsintervallen wilt selecteren, selecteert u Plug-ins, macro's en tijdsintervallen bewerken en wacht u tot de macro gedurende de totale tijd voor de film een kymograaf uit één segment genereert. Gebruik de plus- en mintoetsen om de grootte van de kymograaf zo nodig te vergroten en gebruik het gereedschap Rechthoekselectie om een rechthoek rond elk tijdsinterval te tekenen. Druk op de Toets T of klik op de knop Toevoegen om een tijdsintervalselectie op te nemen en herhaal de selectie voor zoveel tijdsintervallen als gewenst.

Als u de parameterkeuzes wilt evalueren, selecteert u drie tot vier tijdsintervallen en voltooit u de analyse voor alleen die intervallen. Klik op OK wanneer de tijdsintervalselectie is voltooid. Er verschijnt een pop-upvenster wanneer de geselecteerde intervallen zijn opgeslagen in de projectmap.

Klik op OK. Als u de stroom wilt analyseren, selecteert u Plug-ins, macro's en Flow analyseren. Het dialoogvenster Dialoog van stroomparameters analyseren opent en geeft de waarden weer die zijn ingevoerd in de stap Project openen/maken. Bewerk deze waarden indien nodig en klik op OK. Het dialoogvenster Namen van uitvoerbestand opent en geeft de namen weer die zijn ingevoerd in de stap Project openen/maken.

Bewerk deze namen indien nodig en klik op OK om de stroomanalyse te starten. Wanneer een dialoogvenster voor dialoog wordt weergegeven waarin wordt aangegeven dat de stroom is geanalyseerd, klikt u op OK om de analyseresultaten op te slaan in CSV-spreadsheetbestanden. Als u ruimtelijke kaarten wilt maken, selecteert u Plug-ins, macro's en ruimtelijke kaarten produceren.

In het venster Ruimtelijke kaartparameters worden de waarden weergegeven die zijn ingevoerd in de stap Project openen/maken. Bewerk deze waarden indien nodig en klik op OK. Een temporele reeks ruimtelijke kaarten van stroomsnelheden wordt gegenereerd met elke kleur die een stroomsnelheid aangeeft. Blader door de gegenereerde stapel van één afbeelding per interval om de ruimtelijke en temporele variaties in de stroom te visualiseren en sla de stapel op als een a-v-i-bestand om het bestand als een film te delen.

Staff Analysis genereert de volledige telling van de microvasculaire snelheden over hele microscoopvelden, over perioden die zich uitstrekken van seconden tot minuten. Bijvoorbeeld, met behulp van een enkele afbeelding in deze tijdreeks van het microvasculaire netwerk in de lever van een muis, werd het gegenereerde geskeletteerde beeld gebruikt om de as van de microvasculaire stroom te definiëren, waardoor de door het personeel gegenereerde kaart van individuele vasculaire segmenten kon worden geïdentificeerd voor latere stroomkwantificering. Uit de afzonderlijke vasculaire segmenten gegenereerd uit het geskeletteerde beeld, kymografen kunnen worden gegenereerd die de intensiteit langs elk lijnsegment in de tijd.

De tijdsintervallen Skeleton en User Supply kunnen worden gebruikt om de kymograaf van elk segment op te splitsen in afzonderlijke segmenttijdintervallen. Het personeel identificeert vervolgens de overheersende hoek in de kymograaf van elk segmenttijdinterval en biedt de berekende snelheidsmetingen als CSV-gegevensbestanden. Personeel CSV output kan worden gebruikt om de totale snelheid verdeling te analyseren om het plotten van de snelheid in de individuele vasculaire segmenten in de tijd mogelijk te maken.

En kan worden gevisualiseerd als stapels van kleurgecodeerde snelheid kaart beelden. Houd er rekening mee dat de resultaten die afkomstig zijn van het personeel afhankelijk zijn van de kwaliteit van de beeldreeks, met betrekking tot de samplestabiliteit, framesnelheid, resolutie en signaal-ruisverhouding. De Staff Velocity Map Outputs maken een intuïtieve verkenning van ruimtelijke stroompatronen mogelijk, terwijl de CSV-uitgangen van staff CSV de statistische analyse van de stroomsnelheden mogelijk maken, zowel binnen als tussen behandelingsgroepen.