Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

Het extracellulaire blaasje veld heeft ontbrak genetisch kanfaald ongewervelde model om het eiwit en RNA signalen van extracellulaire blaasjes te bestuderen. Dit protocol stelt de methoden vast voor het verkrijgen van overvloedige, zuivere extracellulaire vikjes uit C.elegans. Dit is voldoende voor robuuste RNA-SEQ en proteomische analyse.

Wanneer de gesynchroniseerde cultuur C.elegans het voedsel van hun normale groeimiddelplaat hebben uitgeput, gebruik elastiekjes om een vijf micrometer nylon mesh filterd op een steriele fles te beveiligen en een vacuüm te beginnen. Giet de L1 wormen op het filter en geef een gelijk volume van medium over de worm aggregaten. Breng na het vortexen drie 10 microlitervolumes van de wormsuspensie over op een deksel van de wormteeltplaat en tel het aantal dieren in elke druppel.

Pas de wormsuspensie aan op twee dieren per microliter van vers medium en draai de suspensie opnieuw. Voeg vervolgens negen, 10 microliter druppels wormen toe aan een nieuw plaatdeksel en tel handmatig het aantal dieren in elke druppel. Bereken vervolgens het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde als percentage van elke wormpopulatie en bereken het totale aantal dieren in elke populatie.

Om de wormen voor te bereiden op de opwekking van secretoom, was de wormen met drie vijf minuten wasbeurten in 15 milliliter steriel M9-medium met 50 microgram per milliliter carbenicilline per plaat per wasbeurt met zachte werveling om de wormen te verjagen, waarbij de wasbeurten worden samengevoegd tot een 50 milliliter conische buis. Verdun na de laatste wasbeurt de wormen tot een dier per microliter S-Basel-oplossing, aangevuld met 2,5 microgram per milliliter cholesterol en 50 micromolarcarbenicillineconcentratie. Voeg vervolgens tot 400 milliliter van de worm suspensie toe aan een steriele twee liter onderste flaffled kolf.

Plaats de kolf op een cirkelvormige rotator op 20 graden Celsius en 100 rotaties per minuut gedurende 24 uur. Voor extracellulaire vesicle oogst, breng de wormen in een 50 milliliter conische buis voor centrifugatie en decanteren de supernatant door middel van een 0,22 micrometer vacuümfilter om eventuele deeltjes puin te verwijderen. Na het tellen, plaats een druppel zwevende wormen op een bacteriële gazon en score de dieren als bewegend, verlamd, of dood na 15 minuten.

Concentreer vervolgens de gefilterde supernatant tot 700 microliter met een geregenereerde nitrocellulose van 10 kilodalton moleculair gewicht cutoff filter en voeg 150 microliters verse S-Basel oplossing toe aan de reductie. Filter en vortex de resulterende oplossing en herhaal de reductie en filtratie nog twee keer zoals net aangetoond. Na de laatste filtratie, centrifugeren de supernatant om eventuele deeltjes en puin die kunnen hebben opgebouwd tijdens de behandeling te verwijderen en voeg protease remmer cocktail plus EDTA volgens de instructies van de fabrikant.

Om de kolom grootteuitsluiting voor te bereiden, decanteert u 15 milliliter zwevende agarose hars in een cartridge met lege zwaartekrachtstroomkolom. Wanneer de kolom is uitgelekt, voeg S-Basel oplossing totdat het hars bed is verpakt op een uiteindelijk volume van 10 milliliter. Vervang de harsbuffer door 40 milliliter steriele gefilterde S-Basel oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat de hars niet wordt verstoord en de zwaartekracht de buffer door de kolom kan afvoeren.

Zodra de bovenkant van de hars niet meer onder water staat, dop u de onderkant van de cartridge af om de stroom te stoppen en plaatst u een opvangbuis onder de kolom. Om de secretome fractionatie te starten, verwijder de dop en voeg onmiddellijk de geconcentreerde secretoomoplossing drop-wise toe aan de bovenkant van het kolombed, gevolgd door de toevoeging van een milliliter S-Basel oplossing drop-wise. Plaats een verse opvangbuis onder de kolom en vul het bovenste kolomreservoir langzaam met vijf milliliter S-Basel oplossing.

Na het verzamelen van de eerste twee milliliter eluaat, snel veranderen de buizen om de volgende vier milliliter te verzamelen. Gebruik een geregenereerde nitrocellulose 10 kilodalton moleculair gewicht cutoff spin filter om de extracellulaire vesicle met kolom eluate concentreren tot 300 microliter en breng het filter retentaat naar een lage bindende microcentrifuge buis. Was vervolgens het filtermembraan twee keer met 100 microliter S-Basel-oplossing op 20 seconden vortexing per wasbeurt en combineer de wasbeurt met het oorspronkelijke retentaat voor een eindmonstervolume van 500 microliters.

Om de extracellulaire vesikels voor te bereiden op kwantificering door stromingscytometrische analyse, voeg 840 microliter S-Basel oplossing en 60 microliters gezuiverde extracellulaire vesicles toe aan een microcentrifugebuis. Voeg 300 microliter van het monster toe in twee extra microcentrifugebuizen, samen met zeven microliters van een geschikte potentiometrische sonde per buis. Voeg zeven microliters van 1%Triton X-100 toe aan de laatste buis en meng alle buizen door te vortexen.

Plaats een sonicatortip in het midden van de buis van het derde monster en pulseer het monster 10 keer op 20% vermogen en een 30%-taakcyclus. Voeg vervolgens 300 microliters S-Basel-oplossing toe aan twee controlemicrocentrifugebuizen en voeg zeven microliters sonde toe aan de kleurstof alleen buis. Label de tweede buis Buffer Only.

Vervolgens broeden alle buizen gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht voor hun analyse door stroom cytometrie volgens de standaard protocollen. Als u de gegevens wilt analyseren, opent u de bestanden in de juiste cytometrische analysesoftware. Stel een rechthoekige poort vanaf de bovenkant van het perceel overspannen van de kleine hoek licht strooiniveau op een keer 10 tot de twee tot een keer 10 naar de vier en het brengen van de poort naar beneden totdat het bevat ongeveer 2,5% van de totale gebeurtenissen.

Geef de poort naar de sonde en kopieer en plak de poort op de andere twee monster- en controledatacels. Exporteer de analyse vervolgens naar een spreadsheet. Hier worden representatieve resultaten van 10 biologische replica's getoond.

De variabiliteit tussen repliceert is niet significant en de typische standaardfout van het gemiddelde van de populatiegrootte is iets meer dan 10%De overdracht van dieren tussen platen resulteert in ongeveer 10% verlies van dieren, terwijl ongeveer 20% van de dieren verloren gaat in de sacharose flotatiestap. Gemiddeld zullen 1.000 jongvolwassen dieren van het wildtype één microgram eiwitten van meer dan 10 kilodalton in hun omgeving afscheiden. Wanneer deze fractie verder wordt gescheiden door de grootte uitsluiting chromatografie, het totale eiwit elution profiel toont een kleine eiwit piek tussen twee tot zes milliliter en een grote piek na acht milliliter.

De extracellulaire vikjes bevinden zich in de eerste vijf milliliter van de kolomegelatie. In een directe vergelijking van de stroming cytometrie kenmerken tussen C.elegans en menselijke extracellulaire blaasjes, een histogram van C.elegans extracellulaire blaasjes, gesorteerd door kleine hoek lichtverstrooiing, toont aan dat alle van de preparaten piek op een gemiddelde fluorescentie intensiteit van ongeveer een keer 10 tot de derde. De potentiometrische sonde DI-8-ANEPPS, labels robuust C.elegans extracellulaire vikjes en de overvloed aan gezuiverde extracellulaire vikjes gesorteerd door de DI-8-ANEPPS expressie is niet significant verschillend tussen C.elegans en cel cultuur afgeleide preparaten.

De monsters die door deze procedure zijn voorbereid, zijn vatbaar voor alle typische downstream extracellulaire blaasanalysemethoden, waaronder RNA-SEQ, stroomcytometrie, nanodeeltjestrackinganalyse en proteomische analyse. Het vaststellen van methoden voor het zuiveren van C.elegans extracellulaire blaasjes stelt onderzoekers in staat om dit eenvoudige ongewervelde model te gebruiken om de genetische paden en fysiologische processen te bestuderen die de extracellulaire blaasjesamenstelling beïnvloeden.