Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Dit protocol biedt een nauwkeurige en reproduceerbare methode voor het kwantificeren van tien verschillende lipidenklassen van Saccharomyces cerevisiae met behulp van een enkele extractiemethode en een enkele LC-MS-methode. Deze methode maakt de detectie en kwantificering van isobarische en isomerische lipidische soorten met verschillende chemische en fysische eigenschappen mogelijk. Voor saccharomyces cerevisiae cultuur, eerst 5 ml steriele 20% glucose voorraad oplossing toe te voegen aan elk van de twee Erlenmeyer kolven met steriele YNB medium aan een uiteindelijke concentratie van 2%glucose.

Gebruik vervolgens een steriele pipet om een volume van een 's nachts gistcultuur met vijf keer tien tot de zevende gistcellen in elke kolf over te brengen en de kolven minstens 24 uur bij 30 graden Celsius te kweken met rotatieschuding bij 200 omwentelingen per minuut. Voor lipide extractie, bepalen het totale aantal gistcellen per milliliter van de cultuur en de overdracht van vijf keer tien naar de zevende cellen in een 15 ml centrifuge buis. Voeg ijskoud nano-zuiver water toe om het totale volume tot 15 ml te brengen en verzamel de cellen door centrifugatie.

Stel de gistkorrel opnieuw op in 15 ml ijskoude iso-tonic ammoniumbicarbonaatbuffer voor een tweede centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in 1,5 ml verse ijskoude ammoniumbicarbonaatoplossing. Bewaar de pellet aan het einde van de centrifugatie op 80 graden celsius tot de extractie. Om te beginnen met de lipide extractie, ontdooien de cel pellet op ijs voor het opnieuw opschorten van de cellen in 200 microliters van ijskoud nano-zuiver water.

Breng in een rookkap de celsuspensie over op een 15 ml, hoogrkglas, schroeftopcentrifugebuis met een polytetrafluorethythyleen gevoerde dop en voeg 25 microliters toe van een intern lipidenstandaardmengsel, bereid in 2:1 chloroform methanol. 100 microliter van 425 tot 600 micromolarzuur gewassen glazen kralen en 600 microliter van een 17:1 chloroform methanol aan de buis. Vortex de buis op hoge snelheid gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te verstoren.

Gevolgd door vortexing voor een uur bij lage snelheid bij kamertemperatuur om lipide extractie te vergemakkelijken. Aan het einde van de extractie, broeden het monster gedurende 15 minuten op ijs, om eiwit neerslag en de scheiding van de waterige en organische fasen te bevorderen. Aan het einde van de incubatiecentrifugeren, centrifugeren het monster om de bovenste waterige fase verder te scheiden van de onderste organische fase en, in de rookkap, gebruik maken van een borosilicaat glas pipet om de onderste organische fase over te brengen naar een nieuwe 15 ml hoge sterkte glazen schroef top centrifuge buis met een polytetrafluorethyleen bekleed dop.

Plaats de onderste organische fase onder de stroom van stikstofgas en voeg in de rookkap 300 microliter van een 2:1 chloroform methanolmengsel toe aan de resterende bovenste waterige fase. Om fosfatidicacid, fosfoïdicylserine, fosforlinositool en cardiolipide extractievortex de buis gedurende vijf minuten krachtig te vergemakkelijken bij kamertemperatuur voordat het monster wordt gecentrifugeerd. Gebruik een borosilicaat glaspipet om de onderste organische fase over te brengen in de onderste organische fase onder stikstof en verdampen het oplosmiddel in de gecombineerde organische fasen in de rookkap.

Sluit vervolgens de buizen van lipidefolie onder de stroom stikstofgas en bewaar de monsters op 80 graden Celsius. Voor vloeibare chromatografie, scheiding van de geëxtraheerde lipiden op 500 microliters van een 63:35:5 aceto-nitril-2-propanol nano-zuiver water mengsel aan de buis van lipide film en vortex drie keer gedurende tien seconden per vortex bij kamertemperatuur. Onderwerp de buis inhoud aan ultrasone sonicatie gedurende 15 minuten voor vortexing de buis drie keer gedurende tien seconden per vortex zoals net aangetoond.

Breng 100 microliter van het monster in een glazen flacon met een insert gebruikt voor een 24 put plaat en elimineren eventuele bubbels in de insert. Plaats de wisselplaat in een put van een 24 putplaat en laad een omgekeerde fase C18 kolom CSH gekoppeld aan een voorkolom in het vloeibare chromatografiesysteem. Stel de kolomtemperatuur in op 55 graden Celsius en de stroom op 300 microliter per minuut.

Wanneer alle parameters zijn ingesteld, laadt u tien microliter van een extractie leeg voordat u het eerste monster laadt. Scheid vervolgens de verschillende lipidesoorten met behulp van de vloeibare chromatografiegradiënt, zoals aangegeven. Er wordt een representatief totaal ionenchromatogram gegenereerd uit de LC-MS-gegevens voor de lipiden die uit de cellen worden geëxtraheerd.

Voor massaspectrometrische analyse van de geëxtraheerde lipiden, laad de monsters op een massaspectrometer uitgerust met een verwarmde elektro-spray ionisatie-ionisatiebron en stel de analyseparameters zoals beschreven in de tabel. Gebruik de Fourier Transform Analyzer om MS-1 bovenliggende ionen te detecteren bij een resolutie van 60,000 en binnen het massabereik van 150-2000 daltons. Detecteer vervolgens de secundaire ionen MS-2 met behulp van de instellingen zoals aangegeven in de tabel.

Om verschillende lipiden uit brede tandem LC-MS-bestanden te identificeren en te kwantificeren, lc-MS raw-bestanden te doorzoeken met volledige scan MS-1-gegevens en gegevens die afhankelijk zijn van MS-2-gegevens gratis, niet-geverifieerde vetzuren, cardio-lipide, fytocerimide, fytosphyngoceen, fosfoidylcholine, fosfarmidylethanolamine, fosphatydlglycerol, fossphatydlinositol, fossphatydlserine en triacylglycerol lipidenklassen met behulp van een massa gedeeld door ladingtolerantie van vijf delen per miljoen voor voorlopers en tien delen per miljoen voor productionen. Volg vervolgens de instructies in de handleiding voor de software om interne lipidenormen en lipidesoorten met ongebruikelijke vetzuursamenstellingen te identificeren. Deze gevoelige tandem LC-MS methode maakt de identificatie en kwantificering van moleculaire soorten lipiden in concentraties zo laag als 0,165 picomolar per microliter.

Deze grens van kwantificering verschilt van verschillende lipideklassen binnen een breed scala van concentraties. Deze methode kan worden gebruikt om de efficiëntie van ionisatie voor lipiden te verhogen met behulp van alternatieve mobiele fase additieven voor de elektrospray ionisatie massaspectrometrie. Elk van deze alternatieve mobiele fase additieven kan worden gebruikt voor zowel de normale fase en omgekeerde fase LC kolommen.

De door botsing geïnduceerde dissociatiemethode is gunstig indien deze wordt gebruikt in combinatie met het ammoniumacetaat mobiele faseadditief voor de elektrospray ionisatie negatieve modus van massaspectrometrie, omdat het onder deze omstandigheden de efficiëntie van MS-1 lipide ionenfragmentatie in MS-2-producten mogelijk maakt. In tegenstelling, de hoge energie, collisional dissociatie methode is gunstig indien gebruikt in combinatie met het ammonium formate mobiele fase additief voor de elektro-spray ionisatie positieve modus van massaspectrometrie als onder deze omstandigheden, het maakt een toename van de efficiëntie van MS-1 lipide ionen fragmentatie in MS-2 producten. Meng de fasen niet tijdens het verzamelen van de organische fase.

Sluit de buizen onder de stroom stikstofgas. Elimineer een bel in de insert en sluit de kolom in de juiste richting. Als de identiteit van een piek niet kan worden bepaald door LC-MS, kan MS-NMR worden gebruikt om de structuur van dat molecuul af te leiden.