Name: Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer een nauwkeurige LC-MS-methode voor kwantitatieve analyse van tien lipidklassen in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek detecteert isobare en isomere lipiden voor metabolismeonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de huidige en voormalige leden van het Titorenko laboratorium dankbaar voor discussies. Wij erkennen het Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry en het Centre for Structural and Functional Genomics (beide aan de Concordia University) voor uitstekende diensten. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN 2014-04482) en Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. werd ondersteund door de Concordia University Merit Award.

1. Bereiding van steriele media voor het kweken van gist
<ol><li>Bereid 90 mL van een compleet YP medium dat 1% (w/v) gistextract en 2% (w/v) bactopeptone bevat.</li>
	<li>Bereid 90 mL van een synthetisch minimaal YNB medium met 0,67% (w/v) gist stikstof basis zonder aminozuren, 20 mg/L L-histidine, 30 mg/L L-leucine, 30 mg/L L-lysine, en 20 mg/L uracil.</li>
	<li>Verdeel 90 mL van het volledige YP-medium eveneens in twee Erlenmeyer-kolven van 250 mL (d.w.z. 45 mL per stuk).</li>
	<li>Verdeel 90 mL van het synthetische minimale YNB-medium in twee Erlenmeyer-kolven van 250 mL (d.w.z. 45 mL per stuk).</li>
	<li>Autoclave de kolven met YP en YNB media op 15 psi/121 °C voor 45 min voor gebruik.</li>
</ol>2. Giststam
<ol><li>Gebruik de wilde soort stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).</li>
</ol>3. Het kweken van gist in het volledige YP medium met glucose
<ol><li>Autoclave een 20% (w/v) voorraadoplossing glucose bij 15 psi/121 °C gedurende 45 min voor gebruik.</li>
	<li>Voeg 5 mL van de steriele 20% (w/v) glucoseoplossing toe aan elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het steriele YP-medium bevatten voor een eindconcentratie van 2% glucose (w/v).</li>
	<li>Gebruik een microbiologische lus om cellen van het wilde type by4742 te inenten in elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het YP-medium met glucose bevatten.</li>
	<li>Kweek de cellen 's nachts bij 30 °C met rotatieschudden bij 200 tpm.</li>
	<li>Neem een aliquot van gist cultuur. Gebruik een hemocytometer om het totale aantal gistcellen per mL cultuur te bepalen.</li>
</ol>4. Overdracht van gist naar en kweken ze in de synthetische minimale YNB medium met glucose
<ol><li>Voeg 5 mL van de steriele 20% (w/v) glucoseoplossing toe aan elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het steriele YNB-medium bevatten tot een eindconcentratie van 2% glucose (w/v).</li>
	<li>Gebruik een steriele pipet om een volume van de 's nachts gistcultuur die het totale aantal van 5,0 x 107 cellen bevat, over te brengen in elk van de twee Erlenmeyer-kolven die het YNB-medium met glucose bevatten.</li>
	<li>Kweek de cellen gedurende ten minste 24 uur (of meer, als het experiment vereist) bij 30 °C met rotatieschudden bij 200 tpm.</li>
</ol>5. Voorbereiding van reagentia, labware en apparatuur voor lipideextractie
<ol><li>Bereid het volgende voor: 1) hoge kwaliteit (>99,9%) chloroform; 2) hoge kwaliteit (>99,9%) methanol; 3) 28% (v/v) ammoniumhydroxideoplossing in nanozuiver water; 4) glazen kralen (zuurgewassen, 425-600 μM); 5) een vortex met geschikte adapter; 6) 15 mL high-speed glazen centrifugebuizen met polytetrafluorethyleen gevoerde doppen; 7) 17:1 en 2:1 mengsels van chloroform en methanol; 8) een chloorform/methanol (2:1) mengsel met 0,1% ammoniumhydroxide (v/v); 9) ABC-oplossing (ammoniumbicarbonaat van 155 mM, pH = 8,0); 10) een mengsel van interne lipidenormen bereid in een mengsel van chloorvorm en methanol van 2:1 , zoals aangegeven in tabel 1; en 11) 2 mL glas monster flesjes met polytetrafluorethyleen gevoerde doppen voor de extractie van cellulaire lipiden.</li>
</ol>6. Voorbereiding van reagentia, labware en apparatuur voor LC
<ol><li>Bereid het volgende: 1) acetonitril/2-propanol/nano-zuiver water (65:35:5) mengsel; 2) een vortex met geschikte adapter; 3) een ultrasone sonicator; 4) glazen flesjes met inzetstukken voor een wellplate; 5) een LC-systeem dat is uitgerust met een binaire pomp, ontgasser en een autosampler; 6) een c18 achteruitfasekolom (2,1 mm; 75 mm; poriemaat 130 Å; pH-bereik van 1-11) gekoppeld aan een prekolomsysteem; 7) mengsel A: acetonitril/water (60:40); en 8) mengsel B: isopropanol/acetonitril (90:10).</li>
</ol>7. Lipideextractie uit gistcellen
<ol><li>Neem een aliquot van gist cultuur. Gebruik een hemocytometer of meet OD600 om het totale aantal gistcellen per mL cultuur te bepalen.</li>
	<li>Neem een volume van gist cultuur die een totaal aantal van 5,0 x 107 cellen (3,3 eenheden OD600) bevat. Plaats dit volume van cultuur in een vooraf gekoelde 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
	<li>Oogst de cellen door centrifugeren op 16.000 x g voor 1 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 1,5 mL ijskoud nanozuiver water toe en was de cellen door centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 1 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 1,5 mL ijskoude ABC-oplossing toe en was de cellen door centrifugeren bij 16.000 x g voor 1 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg. De celpellet kan worden opgeslagen bij -80 °C voorafgaand aan de lipideextractie.</li>
	<li>Om te beginnen met de lipide extractie, ontdooien de cel pellet op ijs.</li>
	<li>Resuspend de celpellet in 200 μL ijskoud nanozuiver water. Breng de celvering over op een hoge sterkte glazen schroeftopcentrifugebuis met een met polytetrafluorethyleen gevoerde dop. Voeg aan deze buis het volgende toe: 1) 25 μL van het mengsel van interne lipidenormen bereid in chloorvorm/methanolmengsel (2:1); 2) 100 μL van 425-600 μM zuurgewassen glazen kralen; en 3) 600 μL chloorform/methanol (17:1) mengsel.</li>
	<li>Vortex de buis op hoge snelheid voor 5 min bij kamertemperatuur (RT) om de cellen te verstoren.</li>
	<li>Vortex de buis op lage snelheid voor 1 uur op RT om de extractie van lipiden te vergemakkelijken.</li>
	<li>Incubeer het monster gedurende 15 min op ijs om eiwitneerslag en de scheiding van de waterige en organische fasen van elkaar te bevorderen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis in een klinische centrifuge met 3.000 x g gedurende 5 min bij RT. Deze centrifugatiestap maakt het mogelijk om de bovenste waterige fase te scheiden van de onderste organische fase, die alle lipideklassen bevat.</li>
	<li>Gebruik een borosilicaat glaspipet om de lagere organische fase (~ 400 μL) over te brengen naar een andere 15 mL hoge sterkte glazen schroef top centrifuge buis met een polytetrafluorethyleen gevoerde dop. Verstoor de glazen kralen of de bovenste waterige fase tijdens een dergelijke overdracht niet. Houd de lagere organische fase onder de stroom van stikstofgas.</li>
	<li>Voeg 300 μL chloorform-methanol (2:1) mengsel toe aan de resterende bovenste waterige fase om de extractie van sfingolipiden en PA, PS, PI en CL. Vortex de buis krachtig gedurende 5 minuten bij RT mogelijk te maken.</li>
	<li>Centrifugeer de buis in een klinische centrifuge met 3.000 x g gedurende 5 min bij RT.</li>
	<li>Gebruik een borosilicaat glaspipet om de lagere organische fase (~ 200 μL) gevormd na centrifugering over te brengen naar de organische fase verzameld bij stap 7.13.</li>
	<li>Gebruik de stroom van stikstofgas om het oplosmiddel te verdampen in de gecombineerde organische fasen. Sluit de buizen met de lipidefilm onder de stroom van stikstofgas. Bewaar deze buizen op -80 °C.</li>
</ol>8. Scheiding van geëxtraheerde lipiden door LC
<ol><li>Voeg 500 μL acetonitril/2-propanol/nano-zuiver water (65:35:5) mengsel toe aan een buis met de lipidefilm verkregen bij stap 7.16. Vortex de buis 3x voor 10 s bij RT.</li>
	<li>Onderwerp de inhoud van de buis aan ultrasone sonicatie voor 15 min. Vortex de buis 3x voor 10 s bij RT.</li>
	<li>Neem 100 μL van een monster uit de buis en voeg het toe aan een glazen flacon met een wisselplaat die wordt gebruikt voor een wellplate. Elimineer luchtbellen in de wisselplaat voordat u deze in de putplaat pacing.</li>
	<li>Gebruik een LC-systeem om verschillende lipidesoorten te scheiden op een omgekeerde c18-kolom CSH gekoppeld aan een prekolomsysteem (zie Tabel met materialen). Houd tijdens de scheiding de kolom op 55 °C en bij een stroomsnelheid van 0,3 mL/min. Bewaar het monster in de wellplate bij RT.</li>
	<li>Gebruik de mobiele fasen die bestaan uit mengsel A (acetonitril/water [60:40 (v/v)]) en mengsel B (isopropanol/acetonitril [90:10 (v/v)]). Voor een positieve wijze van detectie van ouderionen die zijn gemaakt met behulp van de elektrosprayionisatie (ESI) ionenbron, de ESI (+) modus, bevatten de mobiele fasen A en B ammoniumformate bij de uiteindelijke concentratie van 10 mM. Voor een negatieve wijze van ouderionendetectie bevatten de ESI (-) modus, de mobiele fasen A en B ammoniumacetaat bij de eindconcentratie van 10 mM.</li>
	<li>Gebruik een monstervolume van 10 μL voor de injectie in zowel de ESI-modus (+) als de ESI (-) modus.</li>
	<li>Scheid verschillende lipidesoorten per LC met behulp van de volgende LC-gradiënt: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 10-21 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).</li>
	<li>Voer extractie-spaties uit als het eerste monster, tussen elke vier monsters en als laatste monster. Trek de achtergrond af om gegevens te normaliseren.</li>
	<li>Een representatief totaal ionenchromatogram uit LC/MS-gegevens van lipiden die zijn gewonnen uit cellen van de wilde soortstam BY4742, is weergegeven in figuur 1.</li>
</ol>9. Massaspectrometrische analyse van lipiden gescheiden door LC
<ol><li>Gebruik een massaspectrometer uitgerust met een HESI (verwarmde elektrospray ionisatie) ionenbron om lipiden te analyseren die door LC werden gescheiden. Gebruik de instellingen in tabel 2.</li>
	<li>Gebruik de Fourier transform analyzer om ouderionen (MS1) te detecteren met een resolutie van 60.000 en binnen het massabereik van 150-2.000 Da.</li>
	<li>Gebruik de instellingen in tabel 3 om secundaire ionen (MS2) te detecteren.</li>
</ol>10. Identificatie en kwantificering van verschillende lipideklassen en soorten door verwerking van ruwe gegevens van LC-MS/MS
<ol><li>Zie de Tabel met materialen voor software voor het identificeren en kwantificeren van verschillende lipiden uit ruwe LC-MS/MS-bestanden. Deze software maakt gebruik van de grootste lipide database, met meer dan 1,5 miljoen lipide ionprecursoren (MS1) en hun voorspelde fragmentionen (MS2). De software maakt ook gebruik van MS1 pieken voor lipide quantitatie en MS2 voor lipide identificatie. Een representatief chromatogram van twee isomeric fosfatische vormen (34:0) die dezelfde m/z-waarde hebben, maar verschillende retentietijden, evenals hun MS1- en MS2-spectra, zijn weergegeven in respectievelijk figuur 2, figuur 3en figuur 4.</li>
	<li>Zoek LC-MS raw-bestanden met full-scan MS1-gegevens en gegevensafhankelijke MS2-gegevens voor gratis (ongesteriliseerde) vetzuren (FFA), cardiolipine (CL), fytoceramide (PHC), fytosphingosine (PHS), fosphatidylcholine (PC), fosphatidy lethanolamine (PE), fosphatidylglycerol (PG), fosphatidylinositol (PI), fosphatidylserine (PS), en triacylglycerol (TAG) lipide klassen met behulp van een m / z tolerantie van 5 ppm voor voorloper ionen en 10 ppm voor productionen. Andere zoekparameters worden weergegeven in tabel 4. Volg de instructies in de gebruikershandleiding van de software. De identiteit van interne lipidenormen en lipidesoorten met ongebruikelijke vetzuursamenstelling moet handmatig worden geverifieerd.</li>
	<li>Gebruik de Lipid Data Analyzer<a href="http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml" target="_blank">(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),</a>MZmine 2<a href="http://mzmine.github.io/" target="_blank">(http://mzmine.github.io/)</a>of XCMS<a href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html" target="_blank">(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)</a>software om ruwe gegevens van LC-MS/MS te verwerken.</li>
</ol>

<ol><li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+era%3A+accomplishments+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Review%22%5BJournal%5D)">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li>
<li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+coming+to+grips+with+lipid+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li>
<li>Brügger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li>
<li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li>
<li>Eisenberg, T., Büttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+and+cell+death+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li>
<li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+liponecrosis%2C+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li>
<li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals%3A+searching+for+activators+of+liponecrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li>
<li>Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li>
<li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li>
<li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid%3A+cellular+functions+and+disease+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83(2019).</li>
<li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li>
<li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obese+and+anorexic+yeasts%3A+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li>
<li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li>
<li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li>
<li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+peroxisomes%3A+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+%27em+up+or+burn+%27em+down%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li>
<li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li>
<li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li>
<li>Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology%3A+structure+and+signaling+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li>
<li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li>
<li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li>
<li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeissman%2C+J+%22Guide+to+Yeast+Genetics%3A+Functional+Genomics%2C+Proteomics%2C+and+Other+Systems+Analyses%22">Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses</a>. , Academic Press. Burlington. (2010).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li>
<li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li>
<li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li>
<li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li>
<li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li>
<li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li>
<li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMSD%3A+LIPID+MAPS+structure+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li>
<li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De volgende voorzorgsmaatregelen zijn belangrijk voor de succesvolle uitvoering van het hier beschreven protocol:
1. Chloroform en methanol zijn giftig. Ze halen efficiënt verschillende stoffen uit oppervlakken, waaronder laboratoriumplasticware en uw huid. Behandel deze organische oplosmiddelen daarom voorzichtig door het gebruik van kunststoffen te vermijden in stappen die contact met chloroform en/of methanol inhouden, met behulp van borosilicaatglaspipetten voor deze stappen, en spoel deze...

Een lichaam van bewijs geeft aan dat lipiden, een van de belangrijkste klassen van biomoleculen, een essentiële rol spelen in vele vitale processen binnen een eukaryotische cel. Deze processen omvatten de assemblage van lipide tweelagen die het plasmamembraan en de membranen rond cellulaire organellen vormen, het vervoer van kleine moleculen over celmembranen, reactie op veranderingen in de extracellulaire omgeving en intracellulaire signaaltransductie, opwekking en opslag van energie, import en export van eiwitten die beperkt zijn tot verschillende organellen, vesiculaire handel in eiwitten binnen het endomembraansysteem en eiwitafscheiding, en verschillende vormen van gereguleerde celdood1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
De ontluikende gist S. cerevisiae, een eencellig eukaryotisch organisme, is met succes gebruikt om een aantal van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de essentiële rollen van lipiden in deze vitale cellulaire processen4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae is een waardevol modelorganisme voor het blootleggen van deze mechanismen omdat het vatbaar is voor uitgebreide biochemische, genetische, celbiologische, chemische biologische, systeembiologische en microfluïdedsectieanalyses21,22,23,24,25. Verdere vooruitgang in het begrijpen van mechanismen waardoor lipidemetabolisme en intracellulair transport bijdragen aan deze vitale cellulaire processen vereist gevoelige massaspectrometrietechnologieën voor de kwantitatieve karakterisering van het cellulaire lipidoom, het begrijpen van de lipidoom moleculaire complexiteit, en het integreren van kwantitatieve lipideomics in een multidisciplinair platform van systeembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.
De huidige methoden voor de massaspectrometrie-ondersteunde kwantitatieve lipidomica van gistcellen en cellen van andere eukaryotische organismen zijn niet voldoende veelzijdig, robuust of gevoelig. Bovendien zijn deze momenteel gebruikte methoden niet in staat om verschillende isobarische of isomeric lipidesoorten van elkaar te onderscheiden. Hier beschrijven we een veelzijdige, robuuste en gevoelige methode die het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) mogelijk maakt voor kwantitatieve analyse van belangrijke cellulaire lipiden van S. cerevisiae.

<table><tbody><tr><td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 series LC system</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent1100 Wellplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367A</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium formate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11550</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>750332</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2 clinical centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Ceramide</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860517</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>CSH C18 VanGuard</td><td>Waters</td><td>186006944</td><td>Pre-column system</td></tr><tr><td>Free fatty acid (19:0)</td><td>Matreya</td><td>1028</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &mu;M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>Lipid Search software (V4.1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>V4.1</td><td>LC-MS/MS analysis software</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Sigma</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850340</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850704</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM1502</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylserine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840028</td><td></td></tr><tr><td>Reverse-phase column CSH C18</td><td>Waters</td><td>186006102</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860669</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>Tricylglycerol</td><td>Larodan, Malmo</td><td>TAG Mixed FA</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base without amino acids</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-15-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast strain BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van saccharomyces cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipiden zijn structureel diverse amphipathic moleculen die onoplosbaar zijn in water. Lipiden zijn essentiële bijdragen aan de organisatie en functie van biologische membranen, energieopslag en -productie, cellulaire signalering, vesiculaire transport van eiwitten, organelle biogenese, en gereguleerde celdood. Omdat de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is een eencellige eukaryote vatbaar voor grondige moleculaire analyses, het gebruik ervan als een model organisme geholpen onthullen mechanismen koppelen lipide metabolisme en intracellulair vervoer aan complexe biologische processen binnen eukaryotische cellen. De beschikbaarheid van een veelzijdige analytische methode voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van belangrijke klassen lipiden in een gistcel is cruciaal voor het verkrijgen van diepgaande inzichten in deze mechanismen. Hier presenteren we een protocol om vloeibare chromatografie te gebruiken in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor de kwantitatieve analyse van belangrijke cellulaire lipiden van S. cerevisiae. De beschreven LC-MS/MS methode is veelzijdig en robuust. Het maakt de identificatie en kwantificering van talrijke soorten (waaronder verschillende isobarische of isomische vormen) binnen elk van de 10 lipideklassen mogelijk. Deze methode is gevoelig en maakt identificatie en kwantificering van sommige lipidesoorten mogelijk bij concentraties tot 0,2 pmol/μL. De methode is met succes toegepast op de beoordeling van lipidomen van hele gistcellen en hun gezuiverde organellen. Het gebruik van alternatieve mobiele faseadditieven voor elektrosprayionisatiemassaspectrometrie in deze methode kan de efficiëntie van ionisatie voor sommige lipidesoorten verhogen en kan daarom worden gebruikt om hun identificatie en kwantificering te verbeteren.

Onze methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke cellulaire lipiden in een gistcel met behulp van LC-MS/MS was veelzijdig en robuust. Het stelde ons in staat om 10 verschillende lipideklassen in S. cerevisiae cellen gekweekt in het synthetische minimale YNB medium in eerste instantie met 2% glucose te identificeren en te kwantificeren. Deze lipideklassen omvatten vrije (ongesteriliseerde) vetzuren (FFA), CL, fytoceramide (PHC), fytosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI...

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Dit protocol biedt een nauwkeurige en reproduceerbare methode voor het kwantificeren van tien verschillende lipidenklassen van Saccharomyces cerevisiae met behulp van een enkele extractiemethode en een enkele LC-MS-methode. Deze methode maakt de detectie en kwantificering van isobarische en isomerische lipidische soorten met verschillende chemische en fysische eigenschappen mogelijk. Voor saccharomyces cerevisiae cultuur, eerst 5 ml steriele 20% glucose voorraad oplossing toe te voegen aan elk van de twee Erlenmeyer kolven met steriele YNB medium aan een uiteindelijke concentratie van 2%glucose.Gebruik vervolgens een steriele pipet om een volume van een 's nachts gistcultuur met vijf keer tien tot de zevende gistcellen in elke kolf over te brengen en de kolven minstens 24 uur bij 30 graden Celsius te kweken met rotatieschuding bij 200 omwentelingen per minuut. Voor lipide extractie, bepalen het totale aantal gistcellen per milliliter van de cultuur en de overdracht van vijf keer tien naar de zevende cellen in een 15 ml centrifuge buis. Voeg ijskoud nano-zuiver water toe om het totale volume tot 15 ml te brengen en verzamel de cellen door centrifugatie.Stel de gistkorrel opnieuw op in 15 ml ijskoude iso-tonic ammoniumbicarbonaatbuffer voor een tweede centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in 1,5 ml verse ijskoude ammoniumbicarbonaatoplossing. Bewaar de pellet aan het einde van de centrifugatie op 80 graden celsius tot de extractie. Om te beginnen met de lipide extractie, ontdooien de cel pellet op ijs voor het opnieuw opschorten van de cellen in 200 microliters van ijskoud nano-zuiver water.Breng in een rookkap de celsuspensie over op een 15 ml, hoogrkglas, schroeftopcentrifugebuis met een polytetrafluorethythyleen gevoerde dop en voeg 25 microliters toe van een intern lipidenstandaardmengsel, bereid in 2:1 chloroform methanol. 100 microliter van 425 tot 600 micromolarzuur gewassen glazen kralen en 600 microliter van een 17:1 chloroform methanol aan de buis. Vortex de buis op hoge snelheid gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te verstoren.Gevolgd door vortexing voor een uur bij lage snelheid bij kamertemperatuur om lipide extractie te vergemakkelijken. Aan het einde van de extractie, broeden het monster gedurende 15 minuten op ijs, om eiwit neerslag en de scheiding van de waterige en organische fasen te bevorderen. Aan het einde van de incubatiecentrifugeren, centrifugeren het monster om de bovenste waterige fase verder te scheiden van de onderste organische fase en, in de rookkap, gebruik maken van een borosilicaat glas pipet om de onderste organische fase over te brengen naar een nieuwe 15 ml hoge sterkte glazen schroef top centrifuge buis met een polytetrafluorethyleen bekleed dop.Plaats de onderste organische fase onder de stroom van stikstofgas en voeg in de rookkap 300 microliter van een 2:1 chloroform methanolmengsel toe aan de resterende bovenste waterige fase. Om fosfatidicacid, fosfoïdicylserine, fosforlinositool en cardiolipide extractievortex de buis gedurende vijf minuten krachtig te vergemakkelijken bij kamertemperatuur voordat het monster wordt gecentrifugeerd. Gebruik een borosilicaat glaspipet om de onderste organische fase over te brengen in de onderste organische fase onder stikstof en verdampen het oplosmiddel in de gecombineerde organische fasen in de rookkap.Sluit vervolgens de buizen van lipidefolie onder de stroom stikstofgas en bewaar de monsters op 80 graden Celsius. Voor vloeibare chromatografie, scheiding van de geëxtraheerde lipiden op 500 microliters van een 63:35:5 aceto-nitril-2-propanol nano-zuiver water mengsel aan de buis van lipide film en vortex drie keer gedurende tien seconden per vortex bij kamertemperatuur. Onderwerp de buis inhoud aan ultrasone sonicatie gedurende 15 minuten voor vortexing de buis drie keer gedurende tien seconden per vortex zoals net aangetoond.Breng 100 microliter van het monster in een glazen flacon met een insert gebruikt voor een 24 put plaat en elimineren eventuele bubbels in de insert. Plaats de wisselplaat in een put van een 24 putplaat en laad een omgekeerde fase C18 kolom CSH gekoppeld aan een voorkolom in het vloeibare chromatografiesysteem. Stel de kolomtemperatuur in op 55 graden Celsius en de stroom op 300 microliter per minuut.Wanneer alle parameters zijn ingesteld, laadt u tien microliter van een extractie leeg voordat u het eerste monster laadt. Scheid vervolgens de verschillende lipidesoorten met behulp van de vloeibare chromatografiegradiënt, zoals aangegeven. Er wordt een representatief totaal ionenchromatogram gegenereerd uit de LC-MS-gegevens voor de lipiden die uit de cellen worden geëxtraheerd.Voor massaspectrometrische analyse van de geëxtraheerde lipiden, laad de monsters op een massaspectrometer uitgerust met een verwarmde elektro-spray ionisatie-ionisatiebron en stel de analyseparameters zoals beschreven in de tabel. Gebruik de Fourier Transform Analyzer om MS-1 bovenliggende ionen te detecteren bij een resolutie van 60,000 en binnen het massabereik van 150-2000 daltons. Detecteer vervolgens de secundaire ionen MS-2 met behulp van de instellingen zoals aangegeven in de tabel.Om verschillende lipiden uit brede tandem LC-MS-bestanden te identificeren en te kwantificeren, lc-MS raw-bestanden te doorzoeken met volledige scan MS-1-gegevens en gegevens die afhankelijk zijn van MS-2-gegevens gratis, niet-geverifieerde vetzuren, cardio-lipide, fytocerimide, fytosphyngoceen, fosfoidylcholine, fosfarmidylethanolamine, fosphatydlglycerol, fossphatydlinositol, fossphatydlserine en triacylglycerol lipidenklassen met behulp van een massa gedeeld door ladingtolerantie van vijf delen per miljoen voor voorlopers en tien delen per miljoen voor productionen. Volg vervolgens de instructies in de handleiding voor de software om interne lipidenormen en lipidesoorten met ongebruikelijke vetzuursamenstellingen te identificeren. Deze gevoelige tandem LC-MS methode maakt de identificatie en kwantificering van moleculaire soorten lipiden in concentraties zo laag als 0,165 picomolar per microliter.Deze grens van kwantificering verschilt van verschillende lipideklassen binnen een breed scala van concentraties. Deze methode kan worden gebruikt om de efficiëntie van ionisatie voor lipiden te verhogen met behulp van alternatieve mobiele fase additieven voor de elektrospray ionisatie massaspectrometrie. Elk van deze alternatieve mobiele fase additieven kan worden gebruikt voor zowel de normale fase en omgekeerde fase LC kolommen.De door botsing geïnduceerde dissociatiemethode is gunstig indien deze wordt gebruikt in combinatie met het ammoniumacetaat mobiele faseadditief voor de elektrospray ionisatie negatieve modus van massaspectrometrie, omdat het onder deze omstandigheden de efficiëntie van MS-1 lipide ionenfragmentatie in MS-2-producten mogelijk maakt. In tegenstelling, de hoge energie, collisional dissociatie methode is gunstig indien gebruikt in combinatie met het ammonium formate mobiele fase additief voor de elektro-spray ionisatie positieve modus van massaspectrometrie als onder deze omstandigheden, het maakt een toename van de efficiëntie van MS-1 lipide ionen fragmentatie in MS-2 producten. Meng de fasen niet tijdens het verzamelen van de organische fase.Sluit de buizen onder de stroom stikstofgas. Elimineer een bel in de insert en sluit de kolom in de juiste richting. Als de identiteit van een piek niet kan worden bepaald door LC-MS, kan MS-NMR worden gebruikt om de structuur van dat molecuul af te leiden.

quantitative-analysis-cellular-lipidome-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Dit protocol zal de extractie en analyse van vrije en geësterde bioactieve vetzuren uit cellen demonstreren. Vetzuren worden nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van stabiele isotoopverdunning, chirale vloeistofchromatografie, electronenvangst-atmosferische chemische ionisatie-meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

Hier presenteren we een protocol te kwantificeren en kwalificeren van elke soort van de sphingomyelinase met behulp van meerdere reactie controle en MS/MS/MS mode, respectievelijk.

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Leer een nauwkeurige LC-MS-methode voor kwantitatieve analyse van tien lipidklassen in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek detecteert isobare en isomere lipiden voor metabolismeonderzoek.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Meer video's verkennen