Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Dit protocol biedt een robuust, reproduceerbaar model van alfa synuclein accumulatie in primaire dopamine neuronen voor het bestuderen van de mechanismen en behandelingen die deze accumulatie kunnen reguleren. Voorgevormde alfa-synucleinfibrils induceren progressieve, zeer reproduceerbare eiwitaccumulatie in combinatie met geautomatiseerde beeldvorming en onbevooroordeelde beeldanalyse, dit protocol vergemakkelijkt een relatief snelle, gemiddelde tot hoge doorvoerscreening van alfa-synucleinaccumulatieremmende vrachtwagens. Progressieve alpha-synuclein accumulatie kan een van de factoren afbreuk doen aan de neuronale functie bij de ziekte van Parkinson en bepaalde nucleaire lichamen.

Nieuwe moleculen blokkeren van dergelijke accumulatie kan nieuwe therapieën voor neuro degeneratie. Wij geloven dat dit protocol is een belangrijke stap voor de oprichting van een standaard en betrouwbaar instrument om moleculaire mechanismen reguleren alpha-synuclein accumulatie in Dopamine neuronen te bestuderen. Het aantonen van de procedure zal Julia Konovalova, een promovendus uit mijn laboratorium.

Voor het opzetten van de primaire embryonale midbraincelcultuur, voeg 50 microliter dopamine, het neuron medium, toe aan elke put van de Poly-L-Ornithine gecoate 96 putplaat en gebruik een 100 microliter pipettepunt om het medium aan te trekken terwijl tegelijkertijd de bodem van elke put in een cirkelvormige richting krabt om de coating aan de omtrek van elke put te verwijderen. Een poly-L-Ornithine gecoate eiland zal blijven in het midden van elke put. Voeg 10 microliter medium toe aan het midden van elk gecoate eiland om micro-eilanden te maken.

Het opzetten van primaire embryonale midbrain culturen van muis embryonale dag 13.5 muisembryo's. Pool alle geoogste midbrainvloeren in dezelfde 1,5 milliliter buis en was de monsters drie keer met 500 microliter calcium- en magnesiumvrije HBSS per wasbeurt. Vervang na de laatste wasbeurt de HBSS met 0,5% trypsine voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg aan het einde van de incubatie 500 microliters van een vers bereide DNase I in FBS-oplossing toe aan het gedeeltelijk verteerde weefsel en gebruik een ge siliconen glazen pipet met een vuurgepolijste punt om het weefsel te tritureren. Wanneer slechts kleine, nauwelijks zichtbare deeltjes kunnen worden waargenomen, kunnen deze weefselfragmenten zich op de bodem van de microcentrifugebuis vestigen en deze supernatant overbrengen in een lege 15 milliliter conische polypropyleenbuis. Voeg een milliliter HBSS toe aan de buis met DNase I in FBS en meng meerdere malen door pipetten.

Breng één milliliter van deze oplossing over aan de resterende weefseldeeltjes en trituraat de steekproeven opnieuw. Trek vervolgens de verteerde celsuspensie met de buis van supernatant zonder de resterende weefselfragmenten over te brengen nadat het weefselmonster nog een keer tritureert met de resterende DNase I en FBS in HBSS-sediment de verzamelde cellen door centrifugatie en het aanzuigen van de supernatant zonder de pellet te verstoren. Was de cellen twee keer in twee milliliter van opgewarmde dopamine neuron medium per wasbeurt.

En resuspend de cellen op een drie keer 10 aan de krachtcellen per zes microliters van verse warme, middelgrote concentratie in een microcentrifuge buis. Verwijder vervolgens het medium van elk eerder voorbereid micro-eiland en meng de cellen met zachte pipet voordat u een 10 microliter pipet gebruikt om zes microliter cellen aan elk micro-eiland toe te voegen. Wanneer alle cellen zijn toegevoegd, vul de lege putten aan de randen van de plaat met 150 microliter water of PBS en plaats de plaat in de celkweek incubator voor een uur.

Aan het einde van de incubatie voeg 100 microliters van verse dopamine neuron medium aan elke put en de plaat terug te keren naar de incubator. Op dag acht van de celcultuur in een laminaire stroomkap toe te voegen op 3,75 microliter van 100 microgram per milliliter van voorgevormde fibrils aan elke experimentele put, en 3,75 microliter van PBS aan elke controle goed. Bij het werken met PFS voorzichtig zijn over ongewenste eiwitverontreiniging en daarna reinigen van de kap en alle PF geassocieerde instrumenten met 1%SDS en 70%ethanol.

Op het juiste experimentele eindpunt na het bevlekken voor de markeringen van belang, laad de 96 goed cultuurplaat op een hoge inhoud plaat scanner uitgerust met een 10 X doelstelling. Pas de instellingen aan volgens de specificaties van de 96 putplaat, zoals het speltype, de fabrikant, de grootte, de afstand tussen de putten en het type en het volume van het medium. Selecteer het beeldgebied van de putten om alle cellen in elk micro-eiland te bedekken en gebruik er een goed om de automatische focus op de DAPI-expressie aan te passen.

Kalibreer de verwervingstijd voor elk fluorescerend kanaal op basis van de intensiteit van de kleuring in de controleputten en pas de parameters aan, zodat de dopaminecellen in de voorgevormde fibril behandelde controleputten die fosfossen 129 alfasynleinde aggregaten in de celsoucleaten herbergen, duidelijk worden onderscheiden waardoor een ondubbelzinnige kwantificering van het fosfosaat 129 alfasynsosen positief en negatieve cellen mogelijk is. Vervolgens beeld alle geselecteerde putten tegelijkertijd in alle kanalen met behulp van precies dezelfde parameters voor elke put. Open cellprofiler-analist voor de analyse van de beelden en selecteer de V2_THpos.

eigenschappenbestand. Als u gesegmenteerde cellen wilt sorteren in fosfosfosjele 129 alfasynuclein positieve en negatieve cellen, stelt u eerst het aantal fetchcellen in op 50 willekeurige cellen en klikt u op ophalen om afbeeldingen van de gesegmenteerde cellen te laden. Sleep ten minste 30 cellen naar de bijbehorende opslaglocatie onder aan het venster.

selecteer gebruik snelle zachte boosting met 50 max regels of willekeurige forest classifiers en klik op trein. Stel ophalen in op 50 positieve cellen en klik op ophalen om voorbeeld positieve fosfossene 129 alpha synuclein cellen gescoord volgens de trein classifier of set fetch tot 50 negatieve cellen te verwerven en klik ophalen om voorbeeld negatieve fosfossenrine 129 alpha synuclein cellen te verwerven volgens de trein classifier. Wanneer de resultaten bevredigend zijn, klik op score alle om een resultaten tabel een samenvatting van het aantal fosfossenrine 129 alpha synuclein positieve en negatieve dopamine neuronen in elke put te genereren.

Een paar dagen na het plating een homogeen verspreide cultuur kan worden waargenomen door licht microscopie binnen de micro-eiland gemaakt vóór de beplating. Primaire neuronen vestigen zich op de gecoate plaat bodem homogeen en vast te stellen neuronale projecties. In dit beeld kan een kleine klomp cellen met een diameter van minder dan 150 micro meters worden waargenomen.

Immuno kleuring van de controle onbehandelde primaire muis mid-brain culturen met neuronale cel markers 15 dagen na beplating onthult een beperkte gehechtheid van de cellen binnen de micro-eilanden in het midden van de plaat putten. Dopamine neuronen immuno gelabeld met tyrosine hydroxylase marker verspreid over het micro-eiland in een monolaag gescheiden van elkaar zonder klonterende. In alfa-synuclein voorgevormde fibril behandelde culturen, pS129 alpha synuclein positieve insluitsels kunnen ook worden waargenomen.

Behandeling met in vitro voorgevormde fibrils gedurende zeven dagen veroorzaakt geen significante afname van tyrosine hydroxylase positieve neuron nummers in vergelijking met andere experimentele groepen. Behandeling met gliacellijn afgeleid neurotrofe factor echter, vermindert het percentage van pS129 alpha-synuclein positieve opname, herbergen tyrosine hydroxylase positieve dopamine neuronen. Voordat u micro-eilanden maakt, moet u ervoor zorgen dat de met Poly-L ornithine gecoate putten stevig worden gewassen.

Zorg er ook voor dat u verse media te gebruiken bij het plating nieuwe hersenculturen. De methode kan worden gecombineerd met genbewerking en farmacologische remmers om de effecten van specifieke genen en gedachtegolven op nucleonaggregatie te bestuderen. We gebruiken deze methode routinematig om nieuwe moleculen te screenen die alfasynucleinaccumulatie remmen.

Hebben aangetoond dat de accumulatie beschermde effecten van TDN en momenteel het analyseren van een aantal kleine kandidaat moleculen.