Name: Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Leer een kathetergebaseerde methode voor intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de hersenen van muizen en ratten na ischemische beroerte. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar celtherapie voor herstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het volgende: AHA Award 14SDG20480186 voor LC, Subject innovation team van Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 for BZ, en Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust grant 14-12A for KES and LC.

Alle procedures over dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky, en de juiste zorg werd genomen om stress of pijn in verband met chirurgie te minimaliseren.
1. Bereiding van injectiekatheter en chirurgische haken
<ol><li>Bouw de injectiekatheter (figuur 1). Verzamel de benodigde materialen, waaronder: MRE010, MRE025 en MRE050 buizen, 20 G, 26 G en 27 G injectienaalden (Figuur 2A),600 grit schuurpapier, superlijm en twee-component 5-minuten epoxy.<ol>
<li>Snijd 20 G en 26 G naalden op 1 cm van de naaldnaaf en polijst het uiteinde op schuurpapier (figuur 2B). Spoel de naalden door met 10 mL dubbel gedestilleerd water om de naaldboring schoon te maken. OPMERKING: Er worden twee verschillende ontwerpen(figuur 1) gebruikt. Ontwerp 1 heeft een enkele connector en wordt gebruikt voor het injecteren van oplossingen of suspensies. Ontwerp 2 heeft 20 G en 26 G Luer lock connectors voor injectie van cellen (20 G naald) en flush van het dode volume (26 G naald) om de levering van het volledige volume van NSC-bevattende oplossing te garanderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontwerp 1: Steek een 3-4 cm lange MRE010 katheter in een 15 cm lange MRE025 katheter en bevestig met superlijm.<ol>
<li>Sluit het andere uiteinde van de MRE025-buis aan op een segment van DE050-katheter en beveilig met superlijm. Steek een afgestomde 20 G naald in het resterende uiteinde van de MRE050 katheter en bevestig met superlijm (figuur 1).</li>
		<li>Verder versterken van de verbinding sites met epoxy lijm. Dit katheterontwerp is optimaal voor injectie van reagentia (zoals chemische of drugoplossingen of andere biologische zoals cytokines).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontwerp 2: Steek een 3-4 cm lange MRE010 katheter in een 15 cm lange MRE025 katheter en bevestig met superlijm.<ol>
<li>Sluit het andere uiteinde van de MRE025-buis aan op een segment van DE050-katheter en beveilig met superlijm. Steek een afgestomde 20 G naald in het resterende uiteinde van de MRE050 katheter en bevestig met superlijm.</li>
		<li>Steek een afgestomde 26 G naald in de MRE050 buis in de buurt van de punt van de eerste naald, na de richting van de injectiestroom, en veilig met superlijm (Figuur 1 en figuur 2C). Versterk beide naalden en het segment van de MRE050-buis met duidelijke epoxy(figuur 2C). Dit ontwerp maakt injectie van voertuigoplossing via naald 2 (26 G) na NSC-injectie door naald 1 (20 G) mogelijk om het dode volume in de katheter in de hersencirculatie te spoelen, waardoor de injectievolumes nauwkeuriger worden.</li>
		<li>Gebruik een 20 G naald voor NSC-injectie om schade aan de NSC's te minimaliseren, wat de levensvatbaarheid negatief kan beïnvloeden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na de bouw spoel je de katheters door met 10 mL dubbel gedestilleerd water, gevolgd door 70% ethanol, en week ze vervolgens 's nachts in 70% ethanol.</li>
	<li>Verwijder vóór de operatie de katheters van 70% ethanol en spoel met 10 mL steriele PBS en plaats ze in een autoclaved chirurgische gereedschapskist voor opslag en transport.</li>
	<li>Voorbereiding van de chirurgische haken<ol>
<li>Snijd een 1,5- 2 cm lange naaldschacht van een naald van 27 G en polijst beide uiteinden op schuurpapier tot het dof is. Gebruik vervolgens een kleine hemostatische klem om de schacht te buigen in een haak aan de ene kant en een ring-vorm aan de andere kant.</li>
		<li>Steek een 10-15 cm lange MRE025 katheter door de ring en bevestig met duidelijke chirurgische tape(figuur 2D). Maak nog 2 haken met dezelfde methode.</li>
		<li>Week alle haken en kathetersystemen in 70% ethanol tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van dieren: Levering, huisvesting, aanpassing van het milieu
<ol><li>Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen (10-12 weken, n=10/tijdpunt) en Wistar ratten (10-12 weken, n=10) werden gebruikt in deze studie.</li>
	<li>Huis ze in een milieuvriendelijke dierlijke vivarium met voedsel en water ad libitum.</li>
	<li>Laat ze zich minstens 1 week voor de beroerteoperatie aanpassen aan de omgeving. OPMERKING: Een muis en een rat stierf op 1 d na een beroerte operatie en een muis werd geëuthanaseerd op 3 d post-beroerte voorafgaand aan NSC injectie om humane redenen als gevolg van ernstige verlamming.</li>
</ol>3. Cultuur van muis- en rattenneurale stamcellen (NSC's)
OPMERKING: NSC's werden geïsoleerd en gekweekt volgens een vastgesteld protocol20.
<ol><li>Muis<ol>
<li>Isolaat wildtype (WT) en GFP-gelabelde NSC's uit de E18 embryonale cortex van getimede zwangerschap vrouwelijke C57BL/6 muizen gekoppeld aan GFP-positieve mannelijke muizen (B6 ACTb-EGFP). Om GFP (+) embryo's te identificeren, observeer je de geoogste embryo's op een fluorescentiemicroscoop met behulp van het FITC-kanaal. GFP (+) embryo's leveren groen fluorescentiesignaal op, terwijl WT-embryo's slechts zwakke autofluorescentie vertonen(figuur 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rat<ol>
<li>Isoleer NSC's uit de subventriculaire zone (SVZ) van jongvolwassen WT-ratten. Label ze met DiI vlak voor de injectie volgens de instructies van de fabrikant21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur muis of rat NSCs totdat ze zich ontwikkelen tot neurosferen, en doorsnee ze wanneer de diameter van de bol bereikt ongeveer 100 μm (Figuur 3B). Gebruik de NSC's voor injectie tussen passages 3 en 5.</li>
	<li>Controleer hun stamceleigenschappen met behulp van een embryonaal stamcelmarkeringspaneel(figuur 3C).</li>
	<li>Verzamel op de dag van injectie NSC-bollen en los met de celloslatingsoplossing, hang in calcium- en magnesiumvrije PBS op tot een concentratie van 107 cellen/mL en plaats op nat ijs tot de injectie.</li>
</ol>4. Chirurgische voorbereiding
<ol><li>Markeer vóór de operatie een stip op de commerciële MCAO-hechting met een zilveren stift pen op 9 mm (voor muis) of 15 mm (voor rat) van de tip voor in-chirurgie referentie van invoeglengte. Autoclave de chirurgische instrumenten (schaar, tang) en instrumenten voor elke operatie, en warmte steriliseren ze in een glazen kraal sterilisator tussen operaties.</li>
	<li>Induceer anesthesie bij dieren met 5% isoflurane via inademing en behoud anesthesie met 1-2% isoflurane. Evalueer de diepte van anesthesie door observatie van algemene aandoeningen (ademhalingspatroon, snorbeweging en spontane lichaamscorrectie houding), hoornvliesreflex en reactie op teenknijpen.</li>
	<li>Leg dierlijke supine op een verwarmingskussen, en bereid de chirurgische plaats op het dier door het knippen en schrobben met betadine oplossing gevolgd door 70% ethanol. Bescherm de ogen van het dier tegen drogen door tijdens de operatie oogheelkundig zalf (bijvoorbeeld kunstmatige traanzalf) aan te brengen.</li>
	<li>Laat chirurgen grondig schrobben hun handen met een bacteriocidale scrub en draag een masker, steriele handschoenen, en een schone lab jas.</li>
</ol>5. Middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) beroerte chirurgie
OPMERKING: De operaties om ischemische beroerte te veroorzaken in een halfrond van muis of rat zijn vergelijkbaar in dat een hechting wordt geïntroduceerd in de interne halsslagader (ICA) om de bloedstroom af te beelden (Figuur 4)17,18,19,22. De voor hechting geselecteerde slagader verschilt echter op basis van de beschikbare bewerkingsruimte die nodig is voor de daaropvolgende stamcelinjectie. De rat heeft voldoende ruimte in het segment van de externe halsslagader (ERK) om twee afzonderlijke, sequentiële operaties (beroerte en NSC-injectie) mogelijk te maken, maar de muis niet, waardoor een alternatieve aanpak nodig is. Stroke-geïnduceerde cerebrale bloedstroom veranderingen, herseninfarct grootte en neurologische tekorten zijn gemeld zoals in de auteurs 'eerdere rapporten17,18,19.
<ol><li>Om ischemische beroerte te induceren, beginnen zowel muis en rat operaties met een middellijn incisie op het cervicale gebied, en isolatie van de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA), ECA en ICA (Figuur 4). Wees voorzichtig om niet te rekken, verplaatsen of knijpen de CCA of vagus zenuw. Aangezien de selectie van slagader en chirurgische stappen daarna verschillend zijn, zal mcao chirurgie op de muis en de rat afzonderlijk worden beschreven.</li>
	<li>MCAO chirurgie op de muis(Figuur 4A)<ol>
<li>Plaats drie gevlochten 6-0 nylon hechtingen onder de CCA(Figuur 4A, stap 1), en maak een strakke chirurgische knoop om het vat zo ver mogelijk van de splitsing af te sluiten met behulp van de proximale string(Figuur 4A, stap 2). Knip de hechtingseinden af.</li>
		<li>Maak een slipknot aan de distale kant van CCA (let op: niet te veel aanspannen als het zal worden vrijgegeven in stap 6) en een losse slipknot tussen de twee aangescherpte knopen (Figuur 4A, stap 2).</li>
		<li>Snijd een kleine incisie (~ 1/4 - 1/3 van de omtrek) dicht bij de proximale knoop op de CCA met microscissors (Figuur 4A, stap 3), en zorgvuldig invoegen van de commerciële siliconen rubber gecoate 7-0 nylon vaste hechting(Figuur 4A, stap 4). Zet deze hechting vast met de middelste snaar, scherper(figuur 4A, stap 5) om geen bloedlekkage van de incisie en geen beweging van de siliconen rubber gecoate nylon filament door de terugstroom van ICA, terwijl nog steeds waardoor de vooruitgang van de hechting in de richting van de ERK met een zachte druk door de pincetten.</li>
		<li>Laat de bovenste (distale) slipknot(figuur 4A, stap 6) los en ga de nylon hechting in de ICA tot de punt de splitsing voor 9 mm passeert (met behulp van de zilveren markering op de hechting als referentie). Draai de bovenste twee slipknots aan om de hechting vast te stellen en de terugstroom van het bloed te voorkomen.</li>
		<li>Trek de gloeidraad 1 uur later(Figuur 4A, stap 7) en ligate de CCA met behulp van de middelste knoop om bloedingen te voorkomen (Figuur 4A, stappen 5-7 in omgekeerde volgorde, definitieve resultaten zoals te zien in stap 8). Laat de bovenste knoop los. Sluit de wond met 4-0 chirurgische hechting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MCAO chirurgie op rat (Figuur 4B)<ol>
<li>Plaats twee gevlochten 6-0 nylon hechtingen onder de ERK(Figuur 4B, stap 1), en maak een strakke knoop aan het distale uiteinde zoveel mogelijk(Figuur 4B, stap 2).</li>
		<li>Plaats vatclips op de ICA en CCA om de arteriële bloedstroom af te beelden(figuur 4B, stap 3). Een slipknot kan worden gebruikt als alternatief voor een vatclip.</li>
		<li>Maak een kleine incisie op de ERK met microscissors(Figuur 4B, stappen 3-4), steek een commerciële siliconen rubber bekleed 6-0 nylon filament (Figuur 4B, stap 5), en veilig goed met een slipknot op de ERK.</li>
		<li>Laat de vaartuigclip op de ICA los, zet de gloeidraad in de ICA tot de zilveren markering (15 mm) de splitsing bereikt(figuur 4B, stap 6), en zet de hechting vervolgens vast met de2e knoop op de ERK(figuur 4B, stap 6).</li>
		<li>Na 1 uur ischemie trekt u deze gloeidraad terug en ligate de incisie om bloedingen te voorkomen(figuur 4B, stap 7), verwijder de vaatclip van CCA (eindresultaat in stap 8) en sluit u de wond met 4-0 chirurgische hechting.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Herstel
<ol><li>Na een beroerte operatie, plaats dieren op een verwarmingskussen totdat ze volledig weer bij bewustzijn.</li>
	<li>Zorg voor analgesie via onderhuidse injectie. Breng dieren terug naar hun kooien thuis met toegang tot water en voedsel ad libitum.</li>
</ol>7. Intra-arteriële injectie
<ol><li>Was de hele katheter met 70% ethanol en geniet 's nachts tot gebruik. Sluit vlak voor de injectie het Luerslot van de naald aan met een steriele spuit en was de gehele lumenkant van het kathetersysteem met 10 mL steriele PBS.</li>
	<li>Tijdvenster en voorbereiding voor NSC-injectie OPMERKING: Op basis van ervaring en rapporten van andere onderzoeksteams is de timing voor NSC-injectie cruciaal om zowel proefpersonen als exogene NSC's te overleven. In onze pilot studie leidde injectie van NSC's op vroege tijdstippen (binnen de eerste 6 uur na reperfusie) tot een hogere mortaliteit. Zo hebben we later injectietijdpunten getest en het tijdvenster tussen 2 d (48 uur) tot 3 d (72 uur) na een beroerte veilig en draaglijk voor dieren getest en efficiënt in het bereiken van intraparenchymale distributie van NSC's. De hierin gepresenteerde resultaten zijn van dieren die NSC-injectie op 3 d na letsel hebben ontvangen.<ol>
<li>Stel de injectiesnelheid van de spuitpomp in op 20 μL/min voor muizen en 50 μL/min voor ratten. Overmatige snelheid of duur van de injectie kan leiden tot systemische volumeoverbelasting, waarvoor muizen kwetsbaarder zijn dan ratten.</li>
		<li>Kortom, op 3 d na een beroerte operatie, verdoven de dieren met isoflurane en leg ze supine op een verwarmingskussen.</li>
		<li>Heropen de cervicale wond en stel de ERK, ICA en CCA opnieuw bloot(figuur 5, stap 1). Bepaal net als bij de beroerteoperaties de injectieroute op basis van de soort. Gebruik de CCA voor NSC injectie in de muis, en de ERK voor de rat23.</li>
	</ol></li>
	<li>Intra-arteriële injectie via de CCA in muis<ol>
<li>Plaats twee 6-0 gevlochten nylon hechtingen onder de CCA. Maak een losse slipknot met elk van hen tussen de splitsing en lagere knopen van de vorige beroerte operatie (Figuur 5, stap 2).</li>
		<li>Draai de bovenste slipknot aan en maak vervolgens een kleine incisie boven de onderste knoop(figuur 5, stap 3). Steek een MRE010 katheter door de incisie(figuur 5, stap 4) en zet met de middelste knoop zonder de injectiestroom te blokkeren(figuur 5, stap 5). Terugstroom van bloed moet zichtbaar zijn in de katheter bij het loslaten van de bovenste knoop en het aanpassen van de katheterpositie.</li>
		<li>Plaats een vatclip op de ERK, injecteer 1 x 106 GFP-NSC's via deze katheter op 20 μL/min gedurende 5 minuten met een spuitpomp, gevolgd door een flush met 50-100 μL PBS bij dezelfde snelheid.</li>
		<li>Na injectie bindt u de CCA boven de incisie met de bovenste slipknoop en trekt u de MRE010-katheter(figuur 5, stap 6) in. Draai en trim de middelste knoop en de bovenste knoop. Verwijder de vaartuigclip uit de ERK. Raadpleeg de uiteindelijke afbeelding in figuur 5, stap 7.</li>
		<li>Sluit de wond met 4-0 chirurgische hechting.</li>
		<li>Na voldoende herstel op een verwarmingskussen en onderhuidse pijnstillende injectie, breng je de dieren terug naar hun kooi thuis.</li>
	</ol></li>
	<li>Intra-arteriële injectie via de ERK bij rat<ol>
<li>Tijdelijk occlude de ERK en CCA met vat clips (Figuur 5, stap 2).</li>
		<li>Maak een kleine incisie aan de proximale zijde vanERK (figuur 5, stap 3), steek de MRE010-katheter in en bevestig met een knoop(figuur 5, stap 4).</li>
		<li>Verwijder beide scheepsclips, injecteer 5 x 106 NSC's in 100 μL PBS bij 50 μL/min gedurende 2 min, gevolgd door een flush met 50-100 μL PBS (figuur 5, stap 5) met dezelfde snelheid, met behulp van een gemotoriseerde spuitpomp.</li>
		<li>Na injectie occlude de CCA en ECA met vat clips opnieuw en ligate de ERK aan de proximale kant van de tweede incisie na terugtrekking van de injectiekatheter (Figuur 5, stap 6).</li>
		<li>Verwijder de twee vatclips(figuur 5, stap 7) en sluit de wond met 4-0 chirurgische hechting.</li>
		<li>Na voldoende herstel op een verwarmingskussen en onderhuidse pijnstillende injectie, breng je de dieren terug naar hun kooi thuis.</li>
	</ol></li>
	<li>Histologische test<ol>
<li>Verzamel hersenen van muizen en ratten die een ischemische beroerte hebben gekregen, gevolgd door injectie van NSC's of voertuigoplossing na euthanasie en intracardieperfusie met 4% paraformaldehyde bij 1 d (muis en rat), 7 d (muis) en 30 d (muis) na injectie. Elk van deze vier groepen bestond uit 5 NSC en 5 voertuig geïnjecteerd dieren.</li>
		<li>Fix hersenen 's nachts en cryopreserve in 30% sacharose voor 3 d.</li>
		<li>Sluit de hersenen in in OCT, snijd op 40 μm dikte, en onderzoeken de verdeling van NSCs na immunostaining met celspecifieke markers, met inbegrip van gliafibrillaire zure eiwitten (GFAP, astrocyten), Tuj1 (volwassen neuronen), en doublecortine (DCX, onrijpe neuronen). OPMERKING: Vanwege het ontbreken van een rattenstam die GFP uitdrukt, gebruikten we DiI, een voorbijgaand fluorescerend label, voor ratten NSCs, die alleen relatief korte termijn observatie mogelijk maakt. Vandaar, NSC distributie werd alleen onderzocht op 1 d na beroerte bij ratten.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+research+in+2017%3A+surgical+progress+and+stem-cell+advances%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li>
<li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+therapy+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li>
<li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9, 154(2018).</li>
<li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li>
<li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li>
<li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li>
<li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li>
<li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li>
<li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li>
<li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758(2017).</li>
<li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive%2C+migrate%2C+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li>
<li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li>
<li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery%3A+the+pulmonary+first-pass+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li>
<li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke%3A+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li>
<li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+delivery+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li>
<li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155(2015).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li>
<li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967(2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li>
<li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001(2013).</li>
<li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li>
<li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system%3A+Design+considerations+and+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li>
<li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intracerebroventricular+%28ICV%29+injection+of+autologous%2C+non-engineered%2C+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+%28ADSVF%29+for+neurodegenerative+disorders%3A+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li>
</ol>

Stamceltherapie voor neurologische aandoeningen bevindt zich nog in een vroeg verkennend stadium. Een belangrijk probleem is dat er geen vaste methode is voor voldoende levering van SCs of NSC's in de hersenen.
Hoewel exogene SCs/NSC's in de hersenen kunnen worden gedetecteerd na intraveneuze (IV), intraperitoneale (IP) of intraparenchymale/intracerebrale injectie, heeft elke leveringsbenadering nadelen. De detecteerbare populatie in de hersenen wordt geschat op zeer laag met perifere injectie...

Stamceltherapie (SC) heeft een enorm potentieel als behandeling voor neurologische aandoeningen, waaronder beroerte, hoofdtrauma en dementie1,,2,,3,,4,,5,6. Een efficiënte methode om exogene SCs aan de zieke hersenen te leveren blijft echter problematisch2,6,7,8,9,,10,11,12,13. SC's die via perifere leveringsroutes worden geleverd, waaronder intraveneuze (IV) of intraperitoneale (IP)-injectie, zijn onderhevig aan eerste-pass-filtering in de microcirculatie, met name in de longen, lever, milt en spier8,,9,13,14, waardoor de kans op accumulatie van cellen in niet-doelgebieden toeneemt. De invasieve intracerebrale injectiemethode resulteert in gelokaliseerde schade aan hersenweefsel en een zeer beperkte verspreiding van SC's in de buurt van de injectieplaats2,6,8,14,15,16. We hebben onlangs een katheter-gebaseerde intra-arteriële injectie methode om exogene neurale SCs leveren, die hier wordt beschreven toegepast in een knaagdier model van focal ischemische beroerte. We induceren tijdelijke (1 h) ischemie-reperfusie letsel in een halfrond met behulp van een siliconen rubber gecoate gloeidraad om de linker middelste hersenslagader (MCA) in de muis of rat17,,18,19occlude . In dit model hebben we reproducibly waargenomen ongeveer 75-85% depressie van cerebrale bloedstroom (CBF) in ipsilaterale hemisfeer met Laser Doppler of Laser speckle imaging17,19, waardoor consistente neurologische tekorten17,18,19.
Voor tijdbesparende doeleinden wordt de video ingesteld om twee keer de normale snelheid en routinematige chirurgische ingrepen af te spelen, zoals huidvoorbereiding en wondsluiting met hechting en het gebruik en de installatie van de gemotoriseerde spuitpomp worden niet gepresenteerd. De methode van intra-arteriële levering van NSC's wordt aangetoond in de context van het midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model van experimentele beroerte bij knaagdieren. Daarom nemen we de voorbijgaande ischemische beroerteprocedure op om later aan te tonen hoe de tweede operatie, de intra-arteriële injectie, wordt uitgevoerd met behulp van de vorige chirurgische plaats op hetzelfde dier. De haalbaarheid van intra-arteriële NSC levering in knaagdier slag modellen wordt aangetoond door het beoordelen van de distributie en overleving van exogene NSC's. De werkzaamheid van NSC-therapie om hersenpathologie en neurologische disfunctie te verzachten, wordt afzonderlijk gerapporteerd.

<table><tbody><tr><td>20 G naald</td><td>Becton &amp; Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>26 G naald</td><td>Becton &amp; Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>27 G naald</td><td>Becton &amp; Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 hechtdraad met naald</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>6-0 nylon hechtdraad</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td><td>oplossing voor celdetachment</td></tr><tr><td>mesje</td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Buprenorfine-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorfine-SR Lab&reg;</td><td>analgesie (0,6-1 mg/kg over 3 d)</td></tr><tr><td>Calcium/magnesium vrij PBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-0500</td><td>NSC dissociatie</td></tr><tr><td>DCX antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>MCAO filament voor muis</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>MCAO filament voor rat</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>MRE010 katheter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>MRE025 katheter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>MRE050 katheter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>Nu-Tears Zalf</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Ointment</td><td>oogverzorging tijdens chirurgie</td></tr><tr><td>S&amp;T Pincet - SuperGrip Tips JF-5TC Gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>S&amp;T Pincet - SuperGrip Tips JF-5TC Recht</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>spuitpomp</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Tuj1 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>tweedelige 5 minuten epoxy</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>voorbereiding van injectiekatheter</td></tr><tr><td>Vannas veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>vasculaire klemmen</td><td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Zeiss microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td>microscopie</td></tr></tbody></table>

intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de rat en mouse brain: toepassing op cerebrale ischemie

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neurale stamcel (NSC) therapie is een opkomende innovatieve behandeling voor beroerte, traumatisch hersenletsel en neurodegeneratieve aandoeningen. In vergelijking met intracraniale levering, intra-arteriële toediening van NSC's is minder invasief en produceert een meer diffuse distributie van NSC's binnen de hersenen parenchyma. Verder, intra-arteriële levering maakt de eerste-pass effect in de hersenen circulatie, het verminderen van het potentieel voor het vangen van cellen in perifere organen, zoals lever en milt, een complicatie in verband met perifere injecties. Hier beschrijven we de methodologie, bij zowel muizen als ratten, voor de levering van NSC's via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) aan het ipsilaterale halfrond na een ischemische beroerte. Met behulp van GFP-gelabelde NSC's illustreren we de wijdverspreide verspreiding die op het knaagdierilaterale halfrond wordt bereikt op 1 d, 1 week en 4 weken na de postischemische levering, met een hogere dichtheid in of nabij de ischemische letsellocatie. Naast de overleving op lange termijn, tonen we bewijs van differentiatie van GFP-gelabelde cellen na 4 weken. De intra-arteriële leveringsbenadering die hier voor NSC's wordt beschreven, kan ook worden gebruikt voor toediening van therapeutische verbindingen, en heeft dus een brede toepasbaarheid op uiteenlopende CNS-letsel- en ziektemodellen voor meerdere soorten.

GFP-gelabelde NSC's werden gemakkelijk gedetecteerd in de ischemische hersenen, meestal in het ipsilaterale halfrond, vooral in de penumbra en langs de letselrand(figuur 6). De examinator was blind tijdens beeldvorming en analyse.
Bijvoorbeeld, op 1 d na injectie, NSC's werden gedetecteerd in de muis hippocampus. Een subset van NSC's toonde co-expressie van de onrijpe neuron marker DCX in de dentate gyrus, zelfs op dit vroege tijdstip(figuur 6...

Een methode voor het leveren van neurale stamcellen, aanpasbaar voor het injecteren van oplossingen of schorsingen, via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) na ischemische beroerte wordt gemeld. Geïnjecteerde cellen worden breed verspreid over de hersenen parenchyma en kan worden gedetecteerd tot 30 d na de bevalling.

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Beroerte is de belangrijkste oorzaak van sterfte en invaliditeit wereldwijd. Hoewel trombose en chirurgische verwijdering van cerebrale vasculaire occlusie kan worden uitgevoerd bij bepaalde patiënten, zijn er nog steeds een dringende behoefte aan effectieve therapieën tegen een beroerte. Hier demonstreren we een katheter-gebaseerde, intra-arteriële levering van stamcellen aan het ischemische halfrond als een potentieel regime voor beroertetherapie.Eerst introduceren we hoe we de injectiekatheter en chirurgische haken kunnen bereiden. We ontwierpen twee soorten injectiekatheters voor intra-arteriële injectie. Ontwerp een wordt gebruikt voor injectie van een oplossing of suspensie die niet hoeft te spoelen van de buis.Ontwerp twee maakt injectie van neurale stamcellen mogelijk, gevolgd door een flush van het dode volume om het volledige volume te leveren. Voor het bouwen van een set injectiekatheters hebt u 26 meter en 20 meter naalden nodig, een lengte van 10 tot 15 centimeter van MRE 25 katheter en drie centimeter lengte van MRE 50 en MRE 10 katheters. Snijd zowel naald tips en polijsten het metalen uiteinde op schuurpapier om de buis te heropenen en glad de randen en vervolgens s

intra-arterial-delivery-neural-stem-cells-to-rat-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een niet-virale manier van levering van genetische constructen tot een bepaald gebied van wonen knaagdieren hersenen. De methode bestaat uit plasmide voorbereiding, micropipet fabricage, neonatale rattenpup chirurgie, micro-injectie van het construct,...

Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie

De autoloog bloed injectie model van intracerebrale bloeding bij muizen beschreven in dit protocol maakt gebruik van de dubbele injectietechniek te minimaliseren het risico van het bloed reflux tot de naald baan, geen anticoagulantia in het pompsysteem, en elimineert alle dode ruimte en uitbreidbaar slangen in het systeem.

Autoloog bloed injectie tot spontane intracerebrale bloeding in Muizen Model

Midden cerebrale arterie (MCA) ligatie is een techniek om focale cerebrale ischemie studie in diermodellen. In deze methode wordt de middelste hersenslagader blootgesteld door craniotomie en geligeerd door cauterisatie. Deze methode geeft zeer reproduceerbare infarct volumes en hogere post-operatieve overlevingskansen in vergelijking met andere methoden beschikbaar.

De toepassing van permanente midden cerebrale slagader Ligatie in de muis

Preklinische modellen van intracerebrale bloeding worden gebruikt om bepaalde aspecten van klinische ziekte na te bootsen. Daardoor kunnen mechanismen van letsel en potentiële therapeutische strategieën worden onderzocht. In dit protocol worden twee modellen van intracerebrale bloeding beschreven, intrastriatale (basal ganglia) injecties van autoloog bloed of collagenase.

Intrastriatal Injectie van autoloog bloed of Clostridium Collagenase als muismodellen van intracerebrale bloeding

Dit artikel beschrijft de methode voor het toedienen van een korte periode van intermitterende hypoxie tot postnatale dag 1-8 muis of rat pups. Deze aanpak effectief ontlokt een robuust weefsel niveau "priming effect" op gekweekte neurale stamcellen die binnen 30 minuten van de blootstelling hypoxie worden geoogst.

Levering van<em&gt; In Vivo</em&gt; Acute intermitterende hypoxie in Neonatale Knaagdieren Prime subventriculaire zone-afgeleide Neural Progenitor Cell Cultures

Om hersenreorganisatie onder pathologische omstandigheden te bestuderen, gebruikten we miniosmotische pompen voor directe eiwitbezorging in de hersenen, waarbij we de bloed-hersenbarrière omzeilden. Trajecttracers worden vervolgens geïnjecteerd om veranderingen in hersenconnectiviteit onder invloed van het eiwit te bestuderen.

Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie

Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.

Intranasale Levering van Therapeutische Stamcellen aan Glioblastoma in een Muis Model

Hier beschrijven we een methode voor het leveren van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel van de rat door het implanteren van een katheter in de lumbale intrathecale ruimte van de wervelkolom. We richten ons op de levering van antisense oligonucleotiden, hoewel deze methode ook geschikt is voor de levering van andere therapeutische modaliteiten.

Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

Stamcellen worden voortdurend onderzocht als mogelijke behandelingen voor personen met myocardiale schade, maar hun verminderde levensvatbaarheid en retentie in gewond weefsel kan hun werkzaamheid op lange termijn beïnvloeden. In dit manuscript beschrijven we een alternatieve methode voor stamcellevering in een murinemodel van ischemie reperfusieletsel.

Vertraagde intramyocardial levering van stamcellen na Ischemie Reperfusie Letsel in een Murine Model

Reparatie van de slagader in een muismodel na injectie zorgt ervoor dat het bloed weer naar de slagader stroomt zonder de verdeling van het geïnjecteerde materiaal negatief te beïnvloeden. Reparatie op de injectieplaats vergemakkelijkt volgende injecties via dezelfde slagader en voorkomt cerebrale ischemie bij muizenstammen die geen volledige Circle of Willis hebben.

Het vergemakkelijken van herhaalde intracarotisinjecties in muismodellen door een nieuwe techniek voor het herstellen van de injectieplaats

Leer een kathetergebaseerde methode voor intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de hersenen van muizen en ratten na ischemische beroerte. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar celtherapie voor herstel.

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Meer video's verkennen