Name: In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer hoe functionele fluorescerende siliciumnanodeeltjes menselijke kankercellen in vivo kunnen targeten met behulp van zebrafishembryo's. Deze methode helpt onderzoekers optimale nanodeeltjes te selecteren voor verdere klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Mevrouw Kaylee Smith, Mevrouw Lauren Kwok, en de heer Alexander Floru voor het proeflezen van het manuscript. H.F. erkent steun van de NIH (CA134743 en CA215059), de American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) en de St. Baldrick's Foundation. F.J.F.L. erkent een beurs van Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S erkent NSF-steun (subsidie CBET 1605405) en NIH R41AI142890.

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Boston University School of Medicine onder het protocol #: PROTO201800543.
1. Generatie van Casper zebravis embryo's
<ol><li>Kies volwassen Casper vissen die ten minste 3 maanden oud zijn voor natuurlijke fokkerij om transparante Casper zebravis embryo's te genereren.</li>
	<li>Vul twee-kamer paring tanks met viswater in de avond, scheiden de bovenste tanks met behulp van verdelers, plaats een mannelijke vis in de ene kant van de kamer en een of twee vrouwelijke vissen in de andere kant van de kamer, en laat de vis gescheiden 's nachts door verdelers.</li>
	<li>Trek de verdelers de volgende ochtend om 8:00 uur als de lichten aan zijn. Voeg kunstmatige verrijkingsinstallaties toe en kantel de bovenste kamer iets om een ondiep gebied van water te creëren. Laat de vis 3-4 uur broeden.</li>
	<li>Til de bovenste kamers van de paringstanks die de vis bevatten en breng ze terug naar hun originele tanks.</li>
	<li>Verzamel eieren in de onderste kamers door het water door een gaasnet te gieten. Breng eieren naar een steriel petrischaaltje met een dichtheid van niet meer dan 200 eieren per schaal. Verwijder dode of onbevruchte eieren en vul de schotel 2/3 vol met vers viswater. OPMERKING: Bevruchte en gezonde eieren moeten doorschijnend en rond zijn. Eieren die troebel, wit of verminkt zijn, moeten worden verwijderd. Viswater wordt verkregen uit aquariums in de visfaciliteit.</li>
	<li>Incubeer embryo's in de couveuse bij 28,5 °C 's nachts.</li>
	<li>Bleek de embryo's de volgende ochtend met behulp van het standaardprotocol zoals beschreven in The Zebrafish Book16, en zet de embryo's terug naar de couveuse (optionele stap).</li>
	<li>Haal 's middags de 24 pk sterke embryo's uit de couveuse en decuur de embryo's met pronaza.<ol>
<li>Haal zoveel mogelijk viswater uit de embryo's in de petrischaal en voeg een paar druppels van de pronazaoplossing (1 mg/mL in viswater) toe aan de schotel. Draai voorzichtig de petrischaal. Zodra de chorions tekenen van desintegratie vertonen, pipette de embryo's op en neer een paar keer af te breken de chorions om de embryo's vrij te geven.</li>
		<li>Voeg vers viswater onmiddellijk toe aan de petrischaal om het proces te beëindigen zodra een meerderheid van de embryo's uit de chorions is. Spoel de embryo's 3x meer af met viswater om de drijvende chorionen te verwijderen. Breng de embryo's terug naar de couveuse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereiding van menselijke kankercellen voor transplantatie
<ol><li>Stel de couveusetemperatuur in op precies 35,5 °C. Controleer de couveuse om een consistente en stabiele temperatuur te garanderen met behulp van een thermometer in de couveuse.</li>
	<li>Autoclave 1 L viswater in een glazen fles. Maak een 3% agarose oplossing door het toevoegen van 3 g elektroforese-grade agarose tot 100 mL van autoclaved viswater en microwaving totdat de agarose volledig is opgelost.<ol>
<li>Giet hete agarose oplossing in een petrischaaltje tot het 3/4 vol is. Plaats de microinjectie mal op de agarose. Zorg ervoor dat de mal niet in contact is met de bodem van de petrischaal en er geen bubbels onder vormen.</li>
		<li>Laat de oplossing stollen en verwijder de mal voorzichtig van de plaat. Vul de plaat met autoclaved viswater en bewaar de plaat op 4 °C. Verwarm de agaroseplaat en het viswater in de 35,5 °C incubator voor het oogsten van HeLa cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trek 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borosilicaat glazen haarvaten aan een pipettrekker met behulp van de volgende instellingen: druk op 500, warmte bij 560, trek bij 100, snelheid bij 100 en tijd/vertraging bij 200. Bewaar naalden op stopverf in een grote petrischaal die is afgeveegd met een ethanol handdoek. LET OP: Getrokken naalden zijn zeer scherp en kwetsbaar. Wees voorzichtig bij het hanteren.</li>
	<li>Bereid een voorraadoplossing van tricaine methanesulfonaat (MS222, 4 mg/mL) voor door MS222 op te lossen in autoclaved viswater. Vortex ruim voor gebruik. Verdun ms222-voorraadoplossing 1:100 in viswater (d.w.z. voeg 200 μL MS222-voorraadoplossing toe aan 20 mL viswater tot een uiteindelijke concentratie van 40 μg/mL) om embryo's te verdoven voor de volgende procedures.</li>
	<li>Cultuur hLabel HeLa cellen door ze te transduceren met PLenti6.2_miRFP670 lentivirus met behulp van het protocol beschreven17. Oogst RFP+ HeLa cellen 30 min-1 uur voor de transplantatie. OPMERKING: Menselijke HeLa cellen zijn gekweekt in een weefselkweek incubator tot 70% samenvloeiing in volledige groei medium (DMEM medium met 10% FBS) bij 37 °C aangevuld met 5% CO2.<ol>
<li>Verwijder het HeLa celmedium door aspiratie in een weefselkweekkap. Spoel de cellaag kort af met steriele PBS om alle sporen van het serum te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 3,0 mL steriele Trypsin-EDTA-oplossing toe aan een T-75-kolf en plaats de cellen 37 °C weefselkweek incubator gedurende 3-5 min om enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken. Let op de kolf onder de microscoop tot ~ 80% van de cellen worden opgehangen.</li>
		<li>Voeg 6-8 mL volledig groeimedium toe aan de kolf. Verzamel de cellen in een 15 mL steriele buis door zachtjes pipetten. Centrifuge op 135 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Aspirate de supernatant en resuspend HeLa cellen in 3 mL van volledige groei medium. Herhaal de bovenstaande wasstap 2x. Resuspend de cellen in 1 mL van volledig groeimedium en tel de cellen onder de microscoop met behulp van een hemocytometer.</li>
		<li>Draai de cellen weer naar beneden, verwijder de supernatant en zet de cellen opnieuw op in een microcentrifugebuis van 1,5 mL bij een concentratie van 5 x 107 cellen/mL. Houd de cellen warm door de buis in één hand te houden bij het transport naar de visfaciliteit. LET OP: Houd de cellen altijd warm door de cellen voor of tijdens het injecteren van de embryo's in de couveuse van 35,5 °C op te slaan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transplantatie van menselijke kankercellen
<ol><li>Ruim het werkgebied op met ethanolhanddoeken voor transplantatie (bijvoorbeeld scharen, pincet, plastic pipetten, scheermesjes).</li>
	<li>Lijn embryo's uit in de groeven van de agaroseplaat met behulp van een plastic pipet. Leg embryo's aan de zijkant met het voorste naar voren gericht. LET OP: Zorg ervoor dat het viswater de embryo's bedekt. Zet een aantal embryo's opzij om kankercellen niet te injecteren en te gebruiken als controles.</li>
	<li>Zet de luchtbron en microinjector aan. Neem HeLa cellen uit de incubator en pipette de cellen op en neer 20-30x met behulp van een P200 tip. Laad 3 μL celmengsel onmiddellijk in een naald met behulp van een gel laadpunt met een gesneden uiteinde. Steek de punt voorzichtig naar de scherpe onderkant van de naald. Schud indien nodig de naald om ervoor te zorgen dat het celmengsel door de naald beweegt om het scherpe uiteinde te vullen.<ol>
<li>Steek de naald in de naaldhouder. Gebruik een pincet om de punt van de naald voorzichtig open te breken. Pas de druk en de duur van de tijd op de microinjector aan om alle luchtbellen in de naaldpunt eruit te duwen. Verlaag de druk- en injectieduurtijd tot de grootte van de injectiedruppels ~1 nL is.</li>
		<li>Plaats de injectieplaat onder de microscoop in een geschikte positie om de dooierkant van embryo's naar de naald te hebben. Verdoven de embryo's door vijf druppels van de verdunde MS222-oplossing (40 μg/mL) toe te voegen.</li>
		<li>Plaats de injector en laat de naald de perivitellineholte van elk embryo raken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteer het celmengsel in de embryo's op het gevasculariseerde gebied onder de perivitellineholte door op het voetpedaal te drukken.</li>
	<li>Gebruik de niet-dominante hand om de injectieplaat naar het volgende embryo te verplaatsen. Gebruik de dominante hand om de injector uit te breiden en in te trekken terwijl u tegelijkertijd op het voetpedaal drukt om de injectie voort te zetten. Pipette een paar druppels steriel viswater op embryo's die zijn geïnjecteerd. Zodra de injectie van alle embryo's op de plaat is voltooid, was de embryo's af met steriel viswater, leg ze op een steriele petrischaal en verplaats ze onmiddellijk naar de 35,5 °C incubator.</li>
	<li>Na 3 uur, onderzoek de geïnjecteerde embryo's en verwijder de dode.</li>
	<li>Breng de levende embryo's terug naar de 35,5 °C incubator en broed ze 20-24 uur uit om de HeLa cellen zich van de injectieplaats naar andere delen van het lichaam te laten verspreiden. OPMERKING: Embryo's worden bewaard in 35,5 °C incubator om de overleving en migratie van menselijke kankercellen mogelijk te maken omdat de cellen het bij 28,5 °C niet goed doen, de temperatuurvisembryo's worden normaal gesproken geïncubeerd.</li>
</ol>4. Injectie van nanodeeltjes of voertuigen
<ol><li>Verdoven de getransplanteerde embryo's de volgende ochtend met vijf druppels verdunde MS222-oplossing. Niet te veel MS222 toevoegen, want dit zal de embryo's doden. Pak onder een fluorescerende microscoop zorgvuldig embryo's op met staartmetastase van RFP+ HeLa-cellen en plaats ze in een nieuwe petrischaal met steriel viswater.</li>
	<li>Maak de injectienaalden zoals eerder beschreven in sectie 2 met behulp van de volgende instellingen: druk op 500, warmte bij 645, trek aan 60, snelheid bij 50 en tijd/vertraging bij 100.</li>
	<li>Volg de procedures in de stappen 3.1-3.3 om embryo's en laadvoertuig (bijvoorbeeld H2O) of de nanodeeltjesoplossing in de naald uit te lijnen.</li>
	<li>Injecteer 0,5 nL van 1 mg/mL nanodeeltjesoplossing achter het oog en zet de injectie voort zoals beschreven in stap 3.5-3.6 (figuur 1B). Deze locatie achter de ogen is verrijkt met haarvaten, waardoor de nanodeeltjes in de circulatie kunnen komen.</li>
	<li>Injecteer na een soortgelijke procedure het voertuig (bijvoorbeeld H2O) dat werd gebruikt om de nanodeeltjes op te schorten in embryo's met Getransplanteerde HeLa-cellen en die zonder (d.w.z. controles) (figuur 1A, C).</li>
	<li>Incubeer alle geïnjecteerde embryo's bij 35,5 °C.</li>
</ol>5. Beeldvorming en tracking van nanodeeltjes en kankercellen
<ol><li>Onderzoek geïnjecteerde embryo's onder een fluorescerende microscoop op 0, 30, 60, 90, 120, 180 en 210 min postinjectie van nanodeeltjes om hun distributie in het verkeer en de mate van kankerceltargeting te controleren. De targeting van kankercellen door nanodeeltjes kan worden waargenomen al 30 min postinjectie, afhankelijk van het type nanodeeltjes getest.</li>
	<li>Pipette 2-3 embryo's in een petrischaaltje en immobiliseer ze door vijf druppels verdunde MS222-oplossing (40 μg/mL) toe te voegen. Zodra de embryo's stoppen met zwemmen, verwijder het grootste deel van het water om de embryo's te laten liggen op hun zijkanten.</li>
	<li>Gebruik een pipet met een dunne, zachte borstel aan het uiteinde om de embryo's uit te lijnen, zodat ze op hun zijkanten liggen met het voorste naar voren gericht en slechts één zichtbaar oog.</li>
	<li>Beeld de embryo's in rode, blauwe en brightfield kanalen bij lage vergroting (2x) om het hele embryo te vangen en te herhalen bij een hogere vergroting (6.4x) om het staartgebied te vangen. Focus het embryo onder het rode kanaal om het bloeden van nanodeeltjes te voorkomen. LET OP: De embryo's mogen niet bewegen tijdens de beeldvorming. Elke beweging zal leiden tot wazige beelden en het onvermogen om beelden van verschillende kanalen te overlappen.</li>
	<li>Voeg direct na beeldvorming vers viswater toe aan de embryo's en breng ze terug naar de couveuse. Herhaal stap 5.2-5.4 om de embryo's op verschillende tijdstippen in beeld te brengen.</li>
</ol>

<ol><li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li>
<li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li>
<li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Target+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers%2C+Cells%2C+and+Tissues+by+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemal+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li>
<li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li>
<li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models%3A+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li>
<li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677(2014).</li>
<li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li>
<li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li>
<li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li>
<li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+%28Kidlington%29%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li>
<li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li>
<li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hela+Cells%3A+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li>
</ol>

I.S. verklaart interesse in NanoScience Solutions, LLC (ontvanger van STTR NIH R41AI142890 subsidie). Alle andere auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Het hier beschreven protocol maakt gebruik van de zebravis als een in vivo systeem om het vermogen van nanodeeltjes te testen om uitgezaaide menselijke kankercellen te herkennen en te targeten. Verschillende factoren kunnen van invloed zijn op de succesvolle uitvoering van de experimenten. Ten eerste moeten embryo's volledig ontwikkeld worden met 48 pk. De juiste ontwikkelingsfase van de embryo's stelt hen in staat om de transplantatie van menselijke kankercellen te verdragen en te overleven. Embryo's jonger dan 48 pk he...

De ontwikkeling van nanodeeltjes die in staat zijn om kankercellen te detecteren, te richten en te vernietigen is van groot belang voor zowel natuurkundigen als biomedische onderzoekers. De opkomst van nanogeneeskunde leidde tot de ontwikkeling van verschillende nanodeeltjes, zoals die vervoegd met gerichte liganden en/of chemotherapeutische geneesmiddelen1,2,3. De toegevoegde eigenschappen van nanodeeltjes maken hun interactie met het biologische systeem, het waarmaken en monitoren van biologische gebeurtenissen met een hoge efficiëntie en nauwkeurigheid, samen met therapeutische toepassingen mogelijk. Goud en ijzeroxide nanodeeltjes worden voornamelijk gebruikt in computertomografie en magnetische resonantie imaging toepassingen, respectievelijk. Terwijl de enzymatische activiteiten van goud en ijzeroxide nanodeeltjes het mogelijk maken de detectie van kankercellen door middel van colorimetrische tests, fluorescerende nanodeeltjes zijn zeer geschikt voor in vivo imaging toepassingen4. Onder hen, ultrabright fluorescerende nanodeeltjes zijn bijzonder gunstig, vanwege hun vermogen om kankers vroeg op te sporen met minder deeltjes en verminderde toxiciteiten5.
Ondanks deze voordelen vereisen nanodeeltjes experimenten met in vivo diermodellen voor de selectie van geschikte nanomaterialen en optimalisatie van het syntheseproces. Bovendien, net als geneesmiddelen, nanodeeltjes vertrouwen op dierlijke modellen voor preklinische testen om hun werkzaamheid en toxiciteit te bepalen. Het meest gebruikte preklinische model is de muis, een zoogdier waarvan het onderhoud relatief hoge kosten met zich meebrengt. Voor kankerstudies worden genetisch gemanipuleerde muizen of xenografted muizen meestal gebruikt6,7. De lengte van deze experimenten strekt zich vaak uit van weken tot maanden. In het bijzonder worden kankercellen voor kankermetastasestudies rechtstreeks geïnjecteerd in de bloedsomloop van de muizen op locaties zoals staartaderen en milt8,9,10. Deze modellen vertegenwoordigen alleen de eindstadia van metastase wanneer tumorcellen buitenaardsen en koloniseren verre organen. Bovendien, als gevolg van zichtbaarheid problemen, is het bijzonder uitdagend om tumorcel migratie en nanodeeltjes targeting van tumorcellen in muizen te controleren.
De zebravis (Danio rerio) is uitgegroeid tot een krachtig gewerveld systeem voor kankeronderzoek als gevolg van zijn hoge haalbaarheid, lage kosten, snelle ontwikkeling, optische transparantie, en genetische instandhoudingen11,12. Een ander voordeel van de zebravis ten opzichte van het muismodel is de bevruchting van de viseieren ex utero, waardoor de embryo's gedurende hun ontwikkeling kunnen worden gecontroleerd. Embryonale ontwikkeling is snel in zebravissen, en binnen 24 uur na de bemesting (hpf), de gewervelde lichaam vliegtuig heeft al gevormd13. Met 72 pk komen eieren uit het chorion en gaan ze van het embryonale naar het bakstadium. De transparantie van de zebravis, de Casper-stam in het bijzonder14, biedt een unieke kans om de migratie van kankercellen en hun erkenning en targeting door nanodeeltjes in een levend dier te visualiseren. Ten slotte ontwikkelen zebravissen hun aangeboren immuunsysteem met 48 pkf, waarbij het adaptieve immuunsysteem achterblijft en pas functioneel wordt na 28 dagen na de bemesting15. Deze tijdskloof is ideaal voor de transplantatie van verschillende soorten menselijke kankercellen in zebravisembryo's zonder immuunafstotingen te ervaren.
Hier beschreven is een methode die gebruik maakt van de transparantie en snelle ontwikkeling van zebravissen om de erkenning en targeting van menselijke kankercellen door fluorescerende nanodeeltjes in vivo aan te tonen. In deze test werden menselijke baarmoederhalskankercellen (HeLa-cellen) genetisch gemanipuleerd om een rood fluorescerend eiwit uit te drukken geïnjecteerd in het gevasculariseerde gebied in de perivitellineholte van 48 hpf embryo's. Na 20-24 uur hadden de HeLa cellen zich al verspreid over de embryo's door de bloedsomloop van vissen. Embryo's met schijnbare metastase werden microinjected met ~0.5 nL van een nanodeeltjesoplossing direct achter het oog, waar het rijke capillaire bed zich bevindt. Met behulp van deze techniek, de ultrabright fluorescerende silica nanodeeltjes kunnen richten HeLa cellen zo snel als 20-30 min postinjectie. Door zijn eenvoud en effectiviteit vertegenwoordigt de zebravis een robuust in vivo model om een verscheidenheid aan nanodeeltjes te testen op hun vermogen om specifieke kankercellen te targeten.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>KSE scientific</td><td>BMK-A1705</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td><td></td></tr><tr><td>Computer en monitor</td><td>ThinkCentre</td><td>X000335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Vis-incubator</td><td>VWR</td><td>35960-056</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fishersci merk</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Magneetstandaard</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tip</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td>verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MMPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Naaldtrekker</td><td>Sutter instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX-10 fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>MVX-10</td><td></td></tr><tr><td>P200 tip</td><td>Fishersci merk</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Corning</td><td>SB93102</td><td>verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Kunststofpipet</td><td>Fishersci merk</td><td>50-998-100</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td><td>Addgene</td><td>13726</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische picopomp</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYSPV820</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche-Sigma-Fisher</td><td>50-100-3275</td><td>Roche product gemaakt door Sigma- verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Veiligheidsmesje</td><td>Fishersci merk</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>SZ51 dissectiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methaansulfonaat</td><td>Western Chemicals</td><td>NC0872873</td><td>verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td>verkocht door Fisher</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fishersci merk</td><td>12-000-122</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Het ontwikkelen van nanodeeltjes die kankercellen kunnen detecteren, richten en vernietigen is van groot belang op het gebied van nanogeneeskunde. In vivo diermodellen zijn nodig voor het overbruggen van de nanotechnologie tot de biomedische toepassing ervan. De muis vertegenwoordigt het traditionele diermodel voor preklinische tests; muizen zijn echter relatief duur om te houden en hebben lange experimentele cycli vanwege het beperkte nageslacht van elke moeder. De zebravis is ontstaan als een krachtig modelsysteem voor ontwikkelings- en biomedisch onderzoek, waaronder kankeronderzoek. Met name vanwege de optische transparantie en snelle ontwikkeling zijn zebravisembryo's zeer geschikt voor real-time in vivo monitoring van het gedrag van kankercellen en hun interacties met hun micro-omgeving. Deze methode is ontwikkeld om achtereenvolgens menselijke kankercellen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes in transparante Casper zebrafish embryo's te introduceren en in vivo herkenning en targeting van de kankercellen door nanodeeltjes in real time te monitoren. Dit geoptimaliseerde protocol toont aan dat fluorescerend gelabelde nanodeeltjes, die zijn gefunctionaliseerd met foliumzuurgroepen, specifiek gemetastaseerde menselijke cervicale epitheelkankercellen kunnen herkennen en targeten die zijn voorzien van een ander fluorchroom. De erkenning en targeting proces kan plaatsvinden al 30 min postinjectie van de nanodeeltjes getest. Het hele experiment vereist alleen het fokken van een paar paar volwassen vissen en duurt minder dan 4 dagen om te voltooien. Bovendien missen zebravisembryo's een functioneel adaptief immuunsysteem, waardoor een breed scala aan menselijke kankercellen kan worden geëntreerd. Vandaar dat het nut van het hier beschreven protocol het testen van nanodeeltjes op verschillende soorten menselijke kankercellen mogelijk maakt, waardoor de selectie van optimale nanodeeltjes in elke specifieke kankercontext voor toekomstige tests bij zoogdieren en de kliniek wordt vergemakkelijkt.

Het protocolschema in figuur 1 illustreert de algemene procedures voor deze studie. Transparante Casper mannelijke en vrouwelijke volwassen vissen werden gefokt om embryo's te genereren (sectie 1). RFP+ HeLa cellen werden geïnjecteerd in het gevasculariseerde gebied onder de perivitelline holte van de zebravis embryo's op 48 hpf, met niet-geïnjecteerde embryo's als controles (sectie 3). Voor personen die ervaring hebben met microinjectie is de overle...

Hier beschreven is een methode voor het gebruik van zebravis embryo's om het vermogen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes te bestuderen om menselijke kankercellen in vivo richten. Deze methode maakt de evaluatie en selectie van optimale nanodeeltjes mogelijk voor toekomstige tests bij grote dieren en in klinische proeven.

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Deze procedure stelt onderzoekers in staat om optimale nanodeeltjes te evalueren en te selecteren voor studies bij grote dieren en klinische proeven. Deze eenvoudige methode helpt bepalen of de nanodeeltjes kan richten op de menselijke kankercellen in vivo en zo ja, hoe efficiënt de targeting is. Het aantonen van de procedures zal Dr.Xiodan Qin, een postdoc, en de heer Andrew Lam, een onderzoekstechnicus van ons lab.Vul 's avonds twee kamerparingtanks met viswater en scheid de bovenste tanks met verdelers. Plaats een mannelijke zebravis in de ene kant van de kamer en een of twee vrouwtjes zebravis in een andere kant van de kamer. Verwijder de verdelers om 8:00 uur de volgende ochtend.Voeg kunstmatige verrijkingsinstallaties toe en kantel de bovenste kamer iets om een ondiep gebied van water te creëren. Laat de zebravis drie tot vier uur broeden en verzamel de eieren uit de onderste kamer door het water door een gaasnet te gieten. Breng de eieren naar een petrischaaltje met niet meer dan 200 eieren per gerecht.Verwijder dode of onbevruchte eieren. Vul de schotel twee derde vol met vers viswater en plaats het in de couveuse. Haal na 24 uur de schaal uit de couveuse en haal zoveel mog

in-vivo-targeting-xenografted-human-cancer-cells-with-functionalized

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video beschrijft een micro-injection methode voor de levering van borstkankercellen in de perivitelline ruimte van transgene zebravis embryo's. Na incubatie visualiseren we het embryo onder een fluorescerende microscoop om kankercelinvasie, verspreiding en metastase te observeren.

zPDX-analyse van invasiviteit: onderzoek naar invasief gedrag van gemetastaseerde kankercellen in zebravisembryo xenografts

This video describes the zebrafish xenograft assay to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents.

Zebrafish Xenograft Assay: A Method to Assess the Anti-cancer Efficacy of Therapeutics on Tumorigenicity in Zebrafish In Vivo

This video describes the method for transplantation of tumor cells from the melanoma-bearing donor zebrafish model to an immunocompromised recipient Casper zebrafish. It helps to visualize tumor engraftment and proliferation in the recipient fish.

Subcutaneous Transplantation Assay: A Method to Transplant Melanoma Cells from a Donor to a Recipient Zebrafish Model

Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo's efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo's. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.

Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

Leer hoe functionele fluorescerende siliciumnanodeeltjes menselijke kankercellen in vivo kunnen targeten met behulp van zebrafishembryo's. Deze methode helpt onderzoekers optimale nanodeeltjes te selecteren voor verdere klinische toepassingen.

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Meer video's verkennen