Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β₂-Microglobuline

In deze studie gebruikten we Bat MHC Klasse I als model om de methodologie samen te vatten en om de haalbaarheid te evalueren van een hybride MHC klasse I gecomplexeerd met heterologe bèta-2 microglobuline. Eerdere studies hebben aangetoond dat de B2M-substitutie van zoogdieren de peptidepresentatie niet significant beïnvloedt. In feite kan de hybride MHC Klasse I een vergelijkbare structuur en functie activeren als het oorspronkelijke molecuul.

Deze technieken kunnen worden gebruikt om de functionele en gestructureerde studie van MHC I te vergemakkelijken voor weefselresponsevaluatie tijdens infectieziekte- en tumorimmunotherapie. Voeg voor de transformatie van de E.coli-cultuur 10 nanogram plasmide met vleermuis of menselijke MHC Klasse I bèta twee microglobuline waterstofketen toe aan 100 microliter geëgaliseerde suspensie en baad de suspensie gedurende 30 minuten in ijs. Aan het einde van de incubatie schokt u de bacteriën gedurende 90 seconden bij 42 graden Celsius en brengt u de cultuur gedurende twee minuten terug naar het ijsbad.

Voeg vervolgens 800 microliters lysogeny bouillon toe aan de cultuur en schud de suspensie 20 minuten op een schommelplatform bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut. Verspreid aan het einde van de incubatie 100 microliter van de bacteriën op een geschikt antibioticumresistent kweekblad. Kies de volgende ochtend een enkele onlangs getransformeerde bacteriële kloon en inent de kloon met drie milliliter LB met antibioticummedium.

Plaats de cultuur 12 tot 16 uur op het schommelplatform op 37 graden Celsius. Breng de volgende ochtend 500 microliters van de geactiveerde bacterievoorraad over in 50 milliliter LB met antibioticummedium en breng de bacteriën 's nachts terug naar de schommelende incubator. Splits de resterende geactiveerde bacteriële voorraad in 500 microliter aliquots en voeg elke aliquot toe aan 500 microlitervolumes van 40% glycerol, voor opslag van min 80 graden Celsius.

Om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren, breng de volgende ochtend de bacteriële suspensie over in twee liter LB met antibioticummedium in een verhouding van één tot 100 en breng de cultuur terug naar de schommelende incubator totdat een absorptie van 0,6 bij 600 nanometer is bereikt. Voeg vervolgens een millimol IPTG toe aan de cultuur om expressie van het transgen op te wekken. Breng na vier tot zes uur inductie de bacteriecultuur over naar flessen voor centrifugatie en hang de bacteriële celkorrels opnieuw op in 60 milliliter PBS per fles.

Bevrijd vervolgens het uitgedrukte recombinante eiwit 99 keer door ultrasone celverstoorderij, gedurende zes seconden en een interval van 12 seconden bij 300 Watt per sonicatie. Voor opname lichaamszuivering verzamelen de gesoniceerde bacteriën door centrifugeren en opnieuw opschorten van de pellets in een geschikt volume van wasbuffer voor twee extra centrifugaties. Na de tweede wasbeurt schort u de inclusielichamen opnieuw op en suspensiebuffer en zet u een aliquot van 20 microliter van het monster opzij voor de SDS-pagina om de zuiverheid van het inclusielichaam te testen.

Centrifugeer het resterende monster en weeg het insluitlichaam met pellet. Voeg ontbindingsbuffer toe aan de pellets tot een uiteindelijke concentratie van 30 milligram inclusielichaam per milliliter buffer. En gebruik een magnetische roerder om de oplossing langzaam te roeren bij vier graden Celsius, totdat de insluitlichamen zijn opgelost in de ontbindingsbuffer.

Bewaar de insluitlichamen na het weggooien van de neerslagen op min 20 of min 80 graden Celsius. Voeg voor MHC complex refolding een vijf millimolar reduced glutathion en 0,5 millimolar geoxideerd glutathion toe bij 250 tot 300 milliliter, een vier graden Celsius refolding buffer. En roer de oplossing langzaam op een magneetroerder bij vier graden Celsius gedurende 10 tot 20 minuten.

Voor MHC waterstofketen en bèta twee microglobuline verdunning, laad het inclusielichaam in een spuit van één milliliter en injecteer het volledige volume van één milliliter inclusielichaamsoplossing in één liter refoldingbuffer in de buurt van de roerstaaf, om een snelle en efficiënte verdunning te verkrijgen. Los vervolgens vijf milligram peptide per milliliter op in dimethylsulfoxide en injecteer snel 200 microliter peptide in de refolding-oplossing zoals zojuist is aangetoond. Na 10 tot 20 minuten langzaam roeren, injecteer drie milliliter H-kettinginsluitingslichamen in een nieuw volume van één liter hervouwbare buffer en laat het opnieuw vouwen acht tot tien uur bij vier graden Celsius doorgaan.

Om de gevouwen eiwitconcentratie te bepalen, voegt u uitwisselingsbuffer toe aan een kamer onder druk met een multi-koper oxidasemembraan van 10 kilodalton en concentreert u de buffer op een volume van 30 tot 50 milliliter. Breng de refoldingoplossing over in een centrifugebuis en verwijder de neerslagen door middel van centrifugeren. Breng de supernate voorzichtig over in de kamer en concentreer de buffer verder tot een laatste volume van ongeveer een milliliter.

Verwijder eventuele laatste verontreinigingen door centrifugeren en breng de supernate over in een steriele buis. Gebruik een uitsluitingskolom van tien driehonderd GL-grootte om de eiwitten te zuiveren, de monsters op het hoogtepunt te verzamelen en ze te analyseren met behulp van de SDS-pagina. Verzamel de MHC-complexpiek en concentreer het eiwit tot een uiteindelijke concentratie van 15 milligram per milliliter.

Verdun vervolgens het complex tot 7,5 milligram per milliliterconcentratie. Om kristallisatie van het complexe MHC en peptide uit te voeren met behulp van de zitdruppeldampdiffusietechniek, voegt u 0,8 microliter van het monster toe aan een commerciële kristalplaat en sluit u het bord af. Breng de monsteroplossing in evenwicht tegen 100 microliter reservoiroplossing bij vier of 18 graden Celsius en gebruik een microscoop om de kristalgroei in de komende zes maanden regelmatig te observeren.

Voor cryogene bescherming, aan het einde van het experiment, breng de kristallen over naar een opslagoplossing die 20% glycerol bevat voordat de monsters snel worden afkoeld in een 100 graden Kelvin gasvormige stikstofstroom. Verzamel vervolgens röntgendiffractiegegevens volgens standaardprotocollen. Om de structuur van de kristalcomplexen te bepalen, opent u de structurele röntgendiffractiegegevens met hoge resolutie in het Denzo-programma binnen het HK L 2000-softwarepakket en selecteert u een eerste model in de eiwitdatabank.

Om de structuur van het eiwit te bepalen, opent u de gegevens in het Phaser MR-programma in CCP4 en gebruikt u het verfijnde röntgenmodel voor de initiële gezamenlijke verfijning. Gebruik vervolgens de Phoenix-verfijning alleen en de gezamenlijke modi voor de röntgen alleen verfijning, en het gezamenlijke neutron voor de röntgen verfijning. Controleer na elke verfijningsronde handmatig het model tegen de Fo-Fc en 2Fo-Fc positieve nucleaire dichtheidskaarten in Coot.

In deze representatieve experimenten werden de bindingscapaciteiten van het Hendra Virus afgeleid Hendra Virus One peptide om MHC Klasse I waterstofketens te slaan met homologe vleermuis bèta twee microglobuline en heterologe menselijke bèta twee microglobuline werden geëvalueerd. In beide analyses werden kristallen met een hoge resolutie gevormd door renaturatie met de bèta twee microglobuline lichtketen. Bij afwezigheid van bèta-twee microglobuline vormen deze complexen zich niet.

In de MHC Klasse I waterstofketen Hendra Virus één, menselijke bèta twee microglobulinestructuur, geconserveerde residuen H31, D53, W60 en Y63 van menselijke bèta twee microglobuline, die overeenkomen met vleermuis bèta twee microglobuline, maken contact met de bodem van de peptidebindende groef en geconserveerde Q8, Y10, R12 en 24 residuen, die overeenkomen met de bèta twee microglobulinen gebonden aan het alfa drie domein. In de totale vleermuis- en menselijke structuren is de gemiddelde wortelgemiddelde vierkants afleiding van residuen één tot 184 van de waterstofketens 0,248 onder alle superposities van het koolstof alfaatoom, wat erop wijst dat er geen verschillen zijn tussen deze twee complexen. De structuur van de peptide uitlijning toont aan dat de bevestigingen van Hendra Virus een peptiden in deze twee complexen zijn vrij vergelijkbaar.

Sequentie-uitlijning toont ook aan dat de aminozuren van beta twee microglobuline van verschillende soorten sterk bewaard zijn gebleven. Het is belangrijk om de tegenstanderscomplexen een hoge rapportage-efficiëntie te bieden. Daarom is het cruciaal om geschikte bèta twee microglobuline te selecteren en sterk gezuiverde inclusielichamen te gebruiken.

Dit protocol kan worden gebruikt om stabiel MTC I-complex te verkrijgen door middel van potentiële bèta twee microglobuline-substituties bij andere soorten, en om te bestaan zijn ze MTC I-structuur en -functie. De gegevens verkregen uit deze studies kunnen worden gebruikt om T-celreacties tijdens infectieziekten en tumorimmunotherapieën te beoordelen.