Name: FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer FLIM-FRET metingen voor eiwit-eiwit interacties in levende Pseudomonas aeruginosa. Deze methode analyseert ongebalanceerde donor-acceptor verhoudingen en biedt inzicht in moleculaire stoichiometrie in native cellulaire omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Dr Ludovic Richert voor zijn waardevolle hulp bij het verwerven van FLIM data en voor het technisch onderhoud en de ontwikkeling van de FLIM setup. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM is het Institut Universitaire de France (IUF) dankbaar voor de ondersteuning en het verstrekken van extra tijd om te worden besteed aan onderzoek. IJS en JG erkennen het Instituut voor De Levering van de Drug van Straatsburg voor zijn financiële steun.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions%3A+Progress%2C+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions.</a> Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).</li>
<li>Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+protein+dynamics+of+the+siderophore+pyoverdine+pathway+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).</li>
<li>Ringel, M. T., Brüser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+pyoverdines%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of pyoverdines.</a> Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).</li>
<li>Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+siderophore+biosynthesis+among+fluorescent+Pseudomonads+and+new+insights+into+their+complex+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization.</a> Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+detecting+protein-protein+interactions+in+living+cells%3A+principles%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress.</a> Science China Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDay%2C+RN+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22">Springer Series in Chemical Physics</a>. 111, 249-276 (2015).</li>
<li>Bastiaens, P. I. H., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+Spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).</li>
<li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).</li>
<li>Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+CFP%2FYFP+and+GFP%2FmCherry+Pairs+to+Donor+Photobleaching+on+FRET+Determination+by+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Leray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+of+a+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscope+for+fret+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements.</a> Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).</li>
<li>Elson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+including+single-shot+acquisition+with+a+segmented+optical+image+intensifier%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier.</a> New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).</li>
<li>Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM-FRET+for+Cancer+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">FLIM-FRET for Cancer Applications.</a> Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 8, 393-399 (2011).</li>
<li>Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+sequence+of+the+pvdA+gene+encoding+the+pyoverdin+biosynthetic+enzyme+L-ornithine+N5-oxygenase+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).</li>
<li>Imperi, F., Visca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+pyoverdine+biogenesis+machinery+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+A+membrane-associated+%27siderosome%27%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'.</a> FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).</li>
<li>Gasser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+FRET-FLIM+and+single+molecule+tracking+reveal+the+supra-molecular+organization+of+the+pyoverdine+bio-synthetic+enzymes+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).</li>
<li>Rietsch, A., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+type+III+secretion+gene+expression+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).</li>
<li>Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).</li>
<li>Godet, J., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+protein-protein+interactions+with+large+differences+in+protein+expression+levels+using+FLIM-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007(2019).</li>
<li>El Meshri, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nucleocapsid+domain+in+HIV-1+gag+oligomerization+and+trafficking+to+the+plasma+membrane%3A+A+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bh+TCSPC+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">The bh TCSPC Handbook.</a> Scanning. , 1(2010).</li>
<li>Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+HIV-1+protein+oligomerization+by+FLIM+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy.</a> Springer Series in Chemical Physics. , 111(2015).</li>
<li>Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+based+analysis+of+FRET+images+recorded+using+spectrally+resolved+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).</li>
<li>Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescence+lifetime+estimation+with+modified+phasor+approach+and+Laguerre+deconvolution%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003(2017).</li>
<li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+protein-protein+interactions+using+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+High-Throughput+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+to+Detect+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions.</a> Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).</li>
<li>Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+biomarker+screening+by+FLIM-FRET+for+combination+therapy+in+ER%2B+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer.</a> Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+lifetime+imaging+techniques%3A+A+review+on+challenge+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+fitting+based+FRET-FLIM+analysis+approaches+applied+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Stringari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+microscopy+distinguishes+different+metabolic+states+of+germ+cells+in+a+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).</li>
<li>Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.</a> Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).</li>
<li>Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nuclear+wide+chromatin+compaction+by+phasor+analysis+of+histone+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+in+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data.</a> Data in Brief. 30, 105401(2020).</li>
<li>Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrimm%2C+JB+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. 113, Elsevier Inc. (2013).</li>
<li>Li, L., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+of+Small-Molecule+Fluorogenic+Probes+for+Bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging.</a> Biochemistry. 59, 216-217 (2020).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Net-FLICS%3A+fast+quantitative+wide-field+fluorescence+lifetime+imaging+with+compressed+sensing+-+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach.</a> Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).</li>
<li>Smith, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fit-free+analysis+of+fluorescence+lifetime+imaging+via+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+compressive+macroscopic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+-+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging.</a> Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

FLIM-FRET biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van op intensiteit gebaseerde FRET-beeldvorming. Fluorescentie leven is een intrinsieke parameter van de fluorofoër. Als gevolg hiervan is het niet afhankelijk van lokale concentraties fluoroforen, noch van de intensiteit van de lichte excitatie. De fluorescentieleven wordt bovendien ook slecht beïnvloed door foto-bleken. Het is vooral interessant om ppr's te bewijzen in cellen waar de concentraties van lokale eiwitten zeer heterogeen kunnen zijn in de subcell...

Eiwit-eiwit interacties (PPR's) controleren verschillende belangrijke processen in cellen1. De rollen van PPR's verschillen op basis van eiwitsamenstelling, affiniteiten functies en locaties in cellen2. PPR's kunnen worden onderzocht via verschillende technieken3. Co-immunoprecipitatie is bijvoorbeeld een relatief eenvoudige, robuuste en goedkope techniek die vaak wordt gebruikt om PPR's te identificeren of te bevestigen. Het bestuderen van PPR's kan echter een uitdaging zijn wanneer de interactieve eiwitten lage expressieniveaus hebben of wanneer de interacties van voorbijgaande aard zijn of alleen relevant zijn in specifieke omgevingen. Het bestuderen van PPR's tussen de verschillende enzymen van het pyoverdinepad in P. aeruginosa vereist dat de onderdrukking van de algemene ijzer-co-factored repressor Fur wordt verlicht om de expressie van alle eiwitten van het pyoverdinepad in cel4,5,6te laten uitdrukken . Deze gemeenschappelijke regulatie voor alle eiwitten van het traject resulteert in tijdige expressies in de cel naar verwachting hun interacties te bevorderen. De diversiteit in termen van grootte, aard, expressieniveaus en het aantal eiwitten van deze metabole route maken het moeilijk om te bestuderen in gereconstitueerde systemen6. Het verkennen van PPR's in hun cellulaire omgeving is daarom van cruciaal belang om de biologische functies van eiwitten in hun eigen context verder te begrijpen.
Slechts enkele methoden, waaronder fluorescentie, maken het verkennen van PPR's in levende cellen7mogelijk. Onder de verschillende fluorescentie parameters die kunnen worden gemeten, de fluorescentie levensduur (dat wil zeggen, de gemiddelde tijd een fluoroforie blijft in zijn opgewonden toestand voor het uitzenden van een foton) is waarschijnlijk een van de meest interessante parameters te verkennen in levende cellen. De fluorescentieleven van een fluorofoër is zeer gevoelig voor zijn omgeving en FLIM kan daarom chemische of fysische informatie verstrekken over de fluorofoëromgeving8. Dit omvat de aanwezigheid van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) die kan optreden in aanwezigheid van een "acceptor" van fluorescentie op korte afstand van een fluorescentie "donor". Energieoverdracht resulteert in een aanzienlijke verkorting van de donorfluorescentieleven(figuur 1A),waardoor Fluorescentie Lifetime Imaging Microscopie (FLIM) een krachtige benadering is om eiwit-eiwitinteracties rechtstreeks in levende cellen te verkennen. FLIM kan bovendien ruimtelijke informatie verstrekken over waar de interacties plaatsvinden in de cellen7,8. Deze aanpak is zeer krachtig voor het onderzoeken van PPR's in situaties waarin het labelen met fluoroforen van de twee interactiepartners mogelijk is.
Om fret te laten optreden - kritieke omstandigheden op de afstand tussen twee fluoroforen zijn vereist8,9. De twee fluoroforen mogen niet meer dan 10 nm van elkaar verwijderd zijn. Daarom moet worden gewaarschuwd bij het ontwerpen van FLIM-FRET-experimenten om ervoor te zorgen dat de donor en de acceptor van fluorescentie een kans hebben om zich dicht bij elkaar te bevinden in het interagerende complex. Hoewel dit lijkt misschien beperkend, het is in feite een echt voordeel als de afstand-afhankelijkheid van FRET zorgt ervoor dat twee geëtiketteerde eiwitten ondergaan FRET moeten fysiek interageren (Figuur 1A). De moeilijkheden bij het verkrijgen van duidelijke antwoorden over PPI in colocalisatie-experimenten (twee gekoloniseerde eiwitten kunnen niet noodzakelijkerwijs op elkaar inwerken) zijn daarom geen probleem met FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Figuur 1: FLIM-FRET-analyseprincipe. Elke pixel van de FLIM-FRET multidimensionale afbeelding bevat informatie over het fluorescentieverval dat op deze specifieke locatie is geregistreerd (#counts = aantal gedetecteerde fotonen in het kanaal t). (A) De klassieke weergave van de FLIM afbeelding is meestal een false-color levensduur gecodeerde 2D-afbeelding (links). Een afname van de gemiddelde fluorescentieleven van de donor - zoals blijkt uit een verandering in de kleurschaal - kan worden waargenomen in aanwezigheid van FRET en is informatief over de aanwezigheid van PPR's in dit ruimtelijk gebied. (B) Overlap tussen het donoremissiespectrum en het acceptorabsorptiespectrum is noodzakelijk om FRET te kunnen voorkomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Een tweede vereiste voor FRET is dat het emissiespectrum van de donor en de absorptiespectra van de acceptor elkaar overlappen8 (figuur 1B). De fluorescentie excitatie van de donor moet op golflengten die zeer weinig bijdragen aan de directe fluorescentie excitatie van de acceptor. Niet alle combinaties van fluoroforen zijn mogelijk en we raden bovendien aan om bij voorkeur donoren met monoexponentiele fluorescentieverval te gebruiken om FLIM-FRET interpretaties te vergemakkelijken10. Verschillende paren van fluorescentie eiwitten voldoen aan deze eisen, waaronder de populaire eGFP-mCherry paar11 (voor een overzicht van het palet van beschikbare fluorescerende eiwit FRET paren zie12,13).
FLIM-FRET maakt het meten van de fluorescentie levensduur verval van een FRET donor op elke pixel van een FLIM beeld(Figuur 1A). Er zijn twee belangrijke technieken om fluorescentieleven te bepalen die verschillen in acquisitie en analyse: frequency-domain (FD)14 en time-domain (TD). TD FLIM is meer verspreid en wordt uitgevoerd met behulp van een gepulseerde verlichting in combinatie met verschillende mogelijke detectie configuraties, waaronder gating methoden15, streak camera16 of time-gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) technieken8. Voor zowel FD- als TD-technieken wordt de fluorescentieleven niet direct gemeten, maar vereist een analyse van de gemeten gegevens om de levensduur(en) of de aanwezigheid van interacties te schatten. Voor TCSPC-technieken is de meest gebruikte analyse gebaseerd op het aanbrengen van het verval met enkele of meerdere exponentiële functies met behulp van de minst vierkante iteratieve re-convolutions die de gewogen som van de resten minimaliseren.
Ten slotte kan FLIM-FRET zowel met behulp van enkele foton of multiphoton excitaties worden uitgevoerd. De nieuwste hebben verschillende voordelen, zoals het verminderen van autofluorescentie en fotodamage uit het brandpuntsvlak. Multiphoton excitaties maken ook een langere excitatie diepte mogelijk als het werken in dikke 3D-monsters8. Integendeel, enkele foton excitatie is meestal efficiënter als de twee-foton absorptie dwarsdoorsnedes van fluorescerende eiwitten zijn beperkt17.
Hier stellen we een protocol voor voor FLIM-FRET-metingen van PPR's in levende P. aeruginosa in het specifieke geval van twee interagerende eiwitten (PvdA en PvdL) uitgedrukt met zeer verschillende aantallen kopieën om de kwaliteit en robuustheid van de techniek aan te tonen bij het onthullen van kritische kenmerken van PPR's. PvdA en PvdL zijn betrokken bij de biosynthese van Pyoverdine. PvdA is een L-ornithine N5-oxygenase en synthetiseert de L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine van L-ornithine door hydroxylation (PvdA) en vervorming (PvdF)18. PvdL is een niet-ribosomale peptide synthese (NRPS) enzym bestaande uit vier modules. De eerste module katalyseert de acyleratie van myristisch zuur. De tweede module katalyseert de activering van L-Glu en de condensatie ervan aan de myristische coA. Vervolgens condenseert de derde module een L-Tyr aminozuur dat vervolgens wordt geïsomeriseerd in D-Tyr. Ten slotte bindt de vierde module een L-Dab (Diaminobutyric acid) aminozuur om het geacyleerde tripeptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6te vormen. PvdL is dus verantwoordelijk voor de synthese van de drie eerste aminozuren van de voorloper van pyoverdine. De interactie van PvdA met PvdL is verrassend omdat PvdL, in tegenstelling tot PvdI en PvdJ, geen module specifiek voor de L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine draagt. Deze interactie suggereert dat alle enzymen die verantwoordelijk zijn voor de pyoverdine precursor biosynthese zijn gerangschikt in grote voorbijgaande en dynamische multi-enzymatische complexen19,20.
In dit rapport leggen we in detail uit hoe we de bacteriestammen kunnen construeren die de twee interactie met eGFP en mCherry-geëtiketteerde eiwitten uitdrukken. We beschrijven ook de voorbereiding van monsters en de omstandigheden voor efficiënte FLIM-FRET-celbeeldvorming. Tot slot stellen we een stapsgewijze zelfstudie voor voor beeldanalyse voor, inclusief een recent ontwikkelde tool die geavanceerde visualisatiemogelijkheden biedt voor eenvoudige interpretatie van complexe FLIM-FRET-gegevens. Met dit rapport willen we niet alleen avontuurlijk, maar de meeste biologen ervan overtuigen dat FRET-FLIM een toegankelijke en krachtige techniek is die in staat is om hun vragen over PPR's rechtstreeks in de inheemse cellulaire omgeving aan te pakken.

<table><tbody><tr><td>525/50 nm band-pass filter</td><td>F37-516, AHF, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm short pass filter</td><td>F75-680, AHF, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polymerase 5U/&micro;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-coupled avalanche photo-diode</td><td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&times;20mm</td><td>Knitel glass</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&micro;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny broth (LB)</td><td>Millipore</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides (25&times;75mm)</td><td>Knitel glass</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Succinate (Disodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCImage, SPCM software</td><td>Becker &amp; Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile inoculating loop</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase 1U/&micro;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>TCSPC module</td><td>SPC830, Becker &amp; Hickl, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire laser</td><td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

flim-fret metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Eiwit-eiwit interacties (PPR's) controleren verschillende belangrijke processen in cellen. Fluorescentie levensduur beeldvorming microscopie (FLIM) in combinatie met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) bieden nauwkeurige informatie over PPR's in levende cellen. FLIM-FRET vertrouwt op het meten van het fluorescentielevensverval van een FRET-donor op elke pixel van het FLIM-beeld, met kwantitatieve en nauwkeurige informatie over PPR's en hun ruimtelijke cellulaire organisaties. We stellen hier een gedetailleerd protocol voor voor FLIM-FRET-metingen dat we hebben toegepast om PPR's in levende Pseudomonas aeruginosa te monitoren in het specifieke geval van twee interagerende eiwitten uitgedrukt met zeer verschillende kopienummers om de kwaliteit en robuustheid van de techniek aan te tonen bij het onthullen van kritische kenmerken van PPR's. Dit protocol beschrijft in detail alle noodzakelijke stappen voor PPI-karakterisering - van bacteriële mutantconstructies tot de eindanalyse met behulp van recent ontwikkelde tools die geavanceerde visualisatiemogelijkheden bieden voor een eenvoudige interpretatie van complexe FLIM-FRET-gegevens.

Empirische cumulatieve verdelingsfuncties (ecdf) van de fluorescentielevensduur gemeten voor de verschillende bacteriestammen worden weergegeven in figuur 8. Als FRET optreedt, worden de ecdfs verschoven naar de kortere levensduur(figuur 8A,8B). Merk op dat wanneer de interactie van de twee eiwitten resulteert in een lange afstand tussen de twee fluoroforen, geen FRET kan optreden(figuur 8C). Deze situatie kan niet ...

We beschrijven hier een protocol om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren tussen twee zeer verschillend uitgedrukte eiwitten in levende Pseudomonas aeruginosa met behulp van FLIM-FRET metingen. Het protocol omvat bacteriën stam constructies, bacteriën immobilisatie, beeldvorming en post-imaging data-analyse routines.

FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET is een krachtige techniek die het mogelijk maakt om verdachte of voorspelde eiwit-eiwit interacties te bevestigen. In dit protocol presenteren we een manier om gegevens te analyseren in bepaalde gevallen van onevenwichtige donor- en acceptorhoeveelheden. FILM-FRET is in staat om informatie te verstrekken over de eiwit-eiwit interacties direct in levende cellen.Het is belangrijk om persoonlijke eiwitinteracties in inheemse cellulaire omgeving te onderzoeken, in het bijzonder wanneer fluorescerend eiwit in het endogene niveau wordt uitgedrukt. Begin met het kweken van P.aeruginosa, E.coli TOP10, en E.coli helper bacteriën elk in vijf milliliter LB zonder antibioticum op 30 graden Celsius tijdens het schudden 's nachts. Meet de volgende dag de optische dichtheid van de culturen en meng een gelijke hoeveelheid P.aeruginosa, E.coli TOP10 en E.coli helper in een 1,5 milliliter microbuis.Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 9, 300 keer G om de bacteriën te pelleteren, gooi vervolgens de supernatant weg en zet de pellet opnieuw op in 50 microliters van LB. Plaat een plek van het mengsel op voorverwarmde LB agar en uitbroed het gedurende vijf uur op 37 graden Celsius. Schraap na de incubatie de plek met een steriele inentingslus en verbouw deze opnieuw in één milliliter LB. Plaat 100 microliter van deze bacteriële suspensie op LB agar met 10 microgram per milliliter chloramphenicol en 30 microgram per milliliter gentamycine en incubaat twee dagen bij 37 graden Celsius om E.coli TOP10 en E.coli helper bacteriën te elimineren. Resuspend een kolonie in een milliliter LB en uitbroeden op 37 graden Celsius met orbitale schudden voor vier uur, dan centrifuge de buis gedurende drie minuten op 9, 300 keer G en gooi 950 microliters van supernatant.Resuspend de pellet in 50 microliter lb en isoleer het mengsel op LB agar met sacharose en geen natriumchloride. Incubeer de plaat 's nachts op 30 graden Celsius. Spot geïsoleerde kolonies op LB agar en LB agar met 15 milligram per milliliter gentamycine om te controleren op gentamycine gevoeligheid.Plaats een microscoop glazen dia op een vlakke horizontale oppervlak en schik twee glazen dia's bedekt met twee lagen plakband eromheen. Pipette een 70 microliter druppel van 1%gesmolten agarose op de glazen glijbaan en plaats een vierde dia op de top om de agarose druppel plat. Druk zachtjes zachtjes voor ongeveer een minuut.Neem de bovenste dia en drop ongeveer drie microliters van bacteriën in drie tot vier plekken op verschillende locaties op de agarose pad. Bedek de agarose pad met een microscopie glazen coverslip en bevestig het met gesmolten paraffine te verzegelen op de glazen glijbaan te beginnen met de vier hoeken. Plaats de microscopie schuif op het podium met de coverslip naar het doel.Draai de filterkubustoren om de eGFP-kubus te selecteren en open de fluit van de fluorescentielamp en stuur het fluorescentielicht naar het oculair van de microscoop. Richt het doel op de bacteriën met behulp van de microscoop knop. Selecteer een gebied dat van belang is in het monster met behulp van de joystick die de gemotoriseerde fase regelt.Stuur het fluorescentieemissiepad terug naar de detector en draai vervolgens de filterkubustoren terug om de dichroic-kubus voor de 930 nanometerlaser te selecteren en zet de laserkracht op 20 milliwatt. Stel de grootte van het gebied van belang in op 30 micrometer, wat de spanning die de galvospiegels werkingt, aanpast en het bereik van hun bewegingen definieert. Schakel de detector in en begin met het scannen van het monster.Kies het gezichtsveld voor beeldvorming door het podium fijn te verplaatsen vanuit de computerinterface. Dit kan worden gedaan op de setup door het verplaatsen van het kruis op het beeld in de microscoop controle software die het nieuwe centrum van het beeld zal definiëren en te drukken verplaatsen fase. Een goed gezichtsveld voor acquisitie moet 10 tot 30 immobiele bacteriën bevatten die allemaal scherp staan.Als u geïnteresseerd bent in het extraheren van film-FRET-gegevens met één cellen, zorg er dan voor dat de bacteriën goed geïndividualiseerd zijn. Open de beeldsoftware en controleer of de aantal foton niet te hoog is om een pileup-effect te voorkomen dat levensmetingen kan beïnvloeden. Verlaag indien nodig de laserintensiteit om de aantal foton laag te houden.Aanpassing acquisitieparameters inclusief de incassotijd van acquisitie. Druk op de startknop en wacht tot de overname is voltooid. Als u de gegevens wilt analyseren, opent u RStudio en maakt u een nieuw project.Maak een nieuwe map in de hoofdmap van het project en geef deze gegevens een naam en verplaats vervolgens alle analyse-vragenbestanden naar deze map. Open een nieuw scriptbestand of het aanvullende script flim_analysis.r. Installeer het speciale FlimDiagRam-pakket voor filmgegevensanalyse en bel het pakket in de werkruimte.Empirische cumulatieve verdelingsfuncties van de fluorescentielevensduur gemeten voor de verschillende bacteriestammen worden hier weergegeven. Als FRET optreedt, worden de functies verschoven naar de kortere levensduur. Het is belangrijk op te merken dat FRET niet kan optreden wanneer de interactie van de twee eiwitten resulteert in een lange afstand tussen de twee flurophores, die niet kunnen worden onderscheiden van de afwezigheid van interactie.Daarom kan het nodig zijn om de eiwitten op verschillende posities te etiketteren om de kans op het onderzoeken van de interactie te maximaliseren. Door het grote verschil in eiwitexpressies tussen PvdA en PvdL leidt hetzelfde complex niet tot vergelijkbare FILM-FRET-gegevens. Onevenwichtige stoichiometrie leiden tot verschillen in de bijdrage van de vrije in vergelijking met de gebonden donorgelabelde eiwitten in de geregistreerde fluorescentielevensverdeling.De diagramplot kan worden gebruikt om kritieke informatie over de stoichiometrie te verstrekken. In de PvdA-eGFP mCherry-PvdL mutant is de hoeveelheid donorgelabelde PvdA veel hoger dan de hoeveelheid mCherry-PvdL. Van alle donoren die in de steekproef aanwezig zijn, hebben slechts enkele van hen interactie met PvdL.De enige tau een waarde gecentreerd op ongeveer 2,3 nanoseconden suggereert dat elke PvdA-eGFP donor kan alleen overdracht met een mCherry-PvdL acceptor. Wanneer de etikettering wordt omgekeerd, wordt verwacht dat de meeste eGFP-PvdL eiwitten interageren met PvdA-mCherry, wat wordt bevestigd door de hogere alfa-waarden. De tau one-waarden werden meer verdeeld, wat suggereert dat meerdere PvdA-eiwitten zich aan één PvdL-eiwit kunnen binden.De FLIM setup wordt steeds beschikbaar in een toenemend aantal imaging faciliteiten. Imaging samples in een FILM-FRET is niet ingewikkelder dan beeldvorming in videomicroscopie.

flim-fret-measurements-protein-protein-interactions-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

The video describes the FLIM-FRET imaging technique to determine the protein-protein interaction in live bacteria expressing cytoplasmic proteins labeled with fluorescent proteins, a donor eGFP, and acceptor mCherry. The combined technique also allows the quantification of the interacting proteins.

FLIM-FRET Imaging for Characterization of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Er is onlangs een aantal FRET-gebaseerde krachtbiosensoren ontwikkeld, waardoor de proteïne-specifieke resolutie van intracellulaire kracht mogelijk is. In dit protocol laten we zien hoe een van deze sensoren, ontworpen voor de linker van het nucleoskelet-cytoskelet (LINC) complex-eiwit Nesprin-2G kan worden gebruikt om actomyosinekrachten op het nucleaire LINC-complex te meten.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Leer FLIM-FRET metingen voor eiwit-eiwit interacties in levende Pseudomonas aeruginosa. Deze methode analyseert ongebalanceerde donor-acceptor verhoudingen en biedt inzicht in moleculaire stoichiometrie in native cellulaire omgevingen.

FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.

Meer video's verkennen