De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Dit is een kristallisatieprotocol dat is ontworpen om de groei van een eiwitkristal te optimaliseren en tegelijkertijd het eiwit te derivaten met een faseringsmolecuul om de structuur van een eiwit te bepalen door röntgenkristallografie. Om de röntgenkristalstructuur van een volledig nieuw eiwit te bepalen, worden kristallisatieomstandigheden geoptimaliseerd om kwaliteitskristallen te produceren. In het geval van een volledig nieuw eiwit moeten zware atomen in het kristal worden geïntroduceerd om een afgeleid kristal te produceren.

Röntgendiffractiegegevens worden verzameld uit het afgeleide kristal en moeten computationeel worden opgelost om een röntgenkristalstructuur te produceren. Kristallisatie en derivitization zijn beide moeizame processen. Om deze knelpunten aan te pakken, hebben we een geoptimaliseerde screeningsprocedure ontwikkeld die beide doelstellingen tegelijkertijd bereikt.

Dit protocol maakt gebruik van een eerder ontwikkelde techniek bekend als willekeurige microseed matrix screening. Kristallen of kristallijn neerslag wordt verpletterd tot microzaden die kunnen worden gebruikt om kristalgroei te starten in volledig onafhankelijke omstandigheden. Tegelijkertijd introduceren we een faseringsmolecuul genaamd I3C in de kristallisatietoestand.

Dit molecuul zorgt voor een groot afwijkend signaal waarmee de structuur kan worden opgelost door een enkele golflengte afwijkende discussiefasering. Voor gebruikers die niet bekend zijn met experimentele grootte van kristalstructuren presenteren we een gebruiksvriendelijke softwarepijplijn om de structuuroplossing gedeeltelijk te automatiseren die het aan maat maakt om het afwijkende signaal van I3C te gebruiken. De eerste stap is het creëren van een I3C voorraad.

Meet 120 milligram I3C in een microcentrifugebuis. Voeg 200 microliters van twee molaire lithiumhydroxide toe aan de microcentrifugebuis. Verwarming van de buis op 40 tot 60 graden en vortexen kan worden gebruikt om ontbinding aangemoedigd.

De ene molaire voorraad lithium I3C-oplossing moet bruin zijn. Twee methoden kunnen worden gebruikt om I3C in de eiwitvoorraad te introduceren. Lithium I3C kan direct aan de eiwitvoorraad worden toegevoegd.

3,75 microliter tot 30 microliter I3C kunnen worden toegevoegd aan 150 microliter eiwit om een concentratie tussen de vijf en 14 millimolar te geven. Sommige eiwitten kunnen neerslaan bij contact met hoge concentraties I3C. In deze gevallen kan lithium I3C worden toegevoegd aan een eiwitverdunningsbuffer die buffer is die overeenkomt met het monstereiwit met een uiteindelijke concentratie tussen 10 en 80 millimolar.

Voeg 150 microliter van de eiwitverdunningsbuffer toe aan 150 microliter eiwitmonster. Een glazen sonde om kristallen te verpletteren is gemaakt van een glazen Pasteur pipet. Met een Bunsen brander op de blauwe vlam, verwarm de Pasteur pipet naar het midden.

Met behulp van een pincet, trek de uiteinden van de Pasteur pipet uit in een dunne diameter van minder dan 0,3 millimeter. Houd dat segment in de vlam om de pipet te scheiden op dit punt en rond het einde van de pipet om de glassonde af te maken. Dit is een voorbeeld van hoe de glazen pipet eruit moet zien.

Kristalverpletters kunnen ook worden besteld bij externe leveranciers als alternatief voor het maken van uw eigen A-microzaadvoorraad wordt gegenereerd door het verpletteren van eiwitkristallen of kristallijn neerslag. Plaats vijf microcentrifugebuizen van 1,5 mL op ijs. Selecteer onder een lichtmicroscoop de beste morfologiekristallen of kristallijn neerslag die kunnen worden opgeofferd.

Voor 96 goed kristallisatie trays open de put door het snijden van de plastic afdichting tape. Voor hangende drop trays kan de afdekslip met een pincet worden verwijderd en op een vlakke ondergrond worden omgekeerd. Breng 70 microliter reservoiroplossing over naar een van de microcentrifugebuizen en ontspan op ijs.

Breng er 90 microliter reservoiroplossing naar de overige buizen en keer terug naar ijs om te koelen. Als er onvoldoende reservoir volume aanwezig is kristallisatie reservoir kan worden gemaakt door het mengen van de juiste reagentia en kan in plaats daarvan worden gebruikt. Roer de kristallen in de kristallisatie druppel met behulp van de glassonde grondig verpletteren.

De voortgang kan onder de microscoop worden gevolgd totdat er geen kristallen of kristallijn materiaal zichtbaar is. Breng alle vloeistof van de druppel naar de microcentrifugebuis met 70 microliter reservoiroplossing. Meng door pipetting op en neer.

Breng twee tot drie microliter mengsel terug naar de put en spoel de put door pipet op en neer. Breng het mengsel terug naar de microcentrifuge buis. Deze spoelstap moet opnieuw worden herhaald.

De microcentrifugebuis moet vanaf dit punt koud worden gehouden om te voorkomen dat de microzaden smelten. Vortex de buis op maximale snelheid op vier graden gedurende ongeveer drie minuten koelen van de buis op ijs regelmatig om oververhitting te voorkomen. maak één op de 10 seriële verdunningen van de zaadvoorraad door achtereenvolgens 10 microliter tussen de gekoelde reservoiroplossingen over te brengen.

Tussen zaadbouillonverdunningen moet de buis worden vortexed. Zaadvoorraden die niet onmiddellijk worden gebruikt, moeten worden opgeslagen in een min 80 graden ultra koude vriezer. Een 96 goed willekeurige microseed matrix scherm kan worden ingesteld met behulp van een vloeibare doseerrobot.

Plaats de zaadbouillon, eiwitvoorraadoplossing aangevuld met I3C en kristallisatiescherm in de robot. Met behulp van de robot overdracht 75 microliters van de kristallisatie scherm naar de 96 goed lade. Voeg een microliter toe aan de kristallisatieval en 74 microliter aan het reservoir.

Breng één microliter eiwit dat met I3C aan de kristallisatiedaling wordt aangevuld. Breng 0,1 microliter zaadbouillon over naar de kristallisatiedaling. Sluit de plaat af met afdichtingstape.

Opknoping drop screens kunnen worden ingesteld in 24 goed opknoping druppel kristallisatie trays. Vet de randen van de hangende dropputten in. Breng 500 microliter kristallisatieoplossing over naar het reservoir.

In de buurt van het centrum van een glazen deksel dia plaats een een microliter druppel kristallisatie oplossing. Voeg aan deze druppel een microliter eiwit toe, aangevuld met lithium I3C en 0,1 microliter zaadbouillon. Keer de afdekplaat om en sluit de kristallisatie goed af door de afdekkingschuif in het vet te duwen.

Hangende druppel- en afdichtingsdruppelbakken worden bij een constante temperatuur geïncubeerd om kristallen te laten ontstaan. Ze moeten regelmatig worden geïnspecteerd onder een microscoop voor kristalgroei. Nadat diffractiegegevens zijn verkregen, geïntegreerd en geschaald zoals uitgelegd in het meegeleverde geschreven protocol, kan de automatische kristalstructuurbepalingspijpleiding automatisch kristalstructuur worden gebruikt om het faseprobleem op te lossen en het eiwit te modelleren.

Klik op de bestemmingspagina Auto-Riksja op de knop Doorgaan. Voer uw institutionele e-mail in het auto-riksja-webformulier in en klik op Doorgaan met het uitvoeren van Auto-Riksja. Voor eiwitten zonder een homologie moto template draaien de SAD protocol van Auto-Riksja in geavanceerde modus.

Voer de vereiste parameters in. Selecteer eiwit als molecuultype. Voer de golflengte van het verzamelen van gegevens in angstroms in.

Dus zoals ik als substructuur element om aan te geven jodium atomen werden gebruikt. Selecteer I3C substructuur type om aan te geven I3C was de fasering molecuul. Selecteer sub_direct als de methode voor de bepaling van de onderstructuur.

Selecteer er drie als het aantal verwachte substructuren per monomeer. Voer er een in als de reservering cutoff van substructure zoeken. Hierdoor kan Auto-Riksja automatisch een geschikte resolutie cutoff bepalen.

Voer het aantal residuen in één monomeer, de ruimtegroep van de gegevensset en het aantal moleculen in de asymmetrische eenheid op basis van de Matthews-coëfficiënt in. Selecteer het juiste verspreidingsniveau van röntgengegevens dat bij uw behoeften past. Voer de afwijkende gegevens in als een leeg ingesteld bestand.

Voer uw eiwitsequentie in als een SEQ-, PIR- of TXT-bestand. Voer uw institutionele e-mailadres in. De resultaten worden aan u geleverd via een weblink die naar het opgegeven e-mailadres wordt verzonden.

Als Auto-Riksja er niet in slaagt om de structuur op te lossen met behulp van de bepaalde substructuur valideren van de substructuur kan helpen bij het oplossen van problemen structuur oplossing. Download de lijst met sites met zware atomen van de pagina Auto-Riksja-resultaten. Het is een hyperlink genaamd zware atoomsites.

Dit zal een tekstbestand met de zware atoomplaatsen downloaden. Wijzig de bestandsextensie van het bestand van txt naar pdb. Open het pdb-bestand in Coot.

Zet symmetrie in om alle zware atomen van naburige asymmetrische eenheden te zien. Meet de afstanden tussen de zware atomen, ook over asymmetrische eenheden. I3C zal verschijnen als een gelijkzijdige driehoek met een zijlengte van zes angstroms.

De aanwezigheid van een driehoek met deze afmetingen geeft aan dat de plaatsingen van die zware atomen correct zijn. Als de auto-riksja run substructuur onjuist is, kunnen andere Auto-Riksja instellingen worden getest zoals besproken in het geschreven protocol. De I3C RMMS methode werd getest op twee eiwitten, kip eiwit lysozyme met behulp van de in HT scherm van Hampton Research en het domein van de Orf11 lysin eiwit uit bacteriofaag P68.

Volledige schermen werden ingesteld voor elk eiwit dat overeenkomt met het controlescherm zonder I3C of microzaad, scherm met microzaad toegevoegd, scherm met I3C, en ten slotte het scherm met I3C en microzaad. Het toevoegen van I3C aan een kristalscherm lijkt het aantal kristallisatiehits niet te verhogen. Bij kippeneiwit lysozyme daalde het aantal voorwaarden van 31 naar 26.

Bij het Orf11-domein werd één hitvoorwaarde gevonden in het controlescherm. Het toevoegen van I3C aan het scherm gaf ook een enkele hit in dezelfde omstandigheden. Het toevoegen van microzaad aan de put resulteerde in een aanzienlijke toename van het aantal hitomstandigheden, wat resulteerde in een toename van respectievelijk 2,1 en zesvoudige toename voor kippeneiwit lysozyme en het Orf11-domein.

Dit resultaat komt overeen met andere studies testen RMMS. Belangrijker nog, het toevoegen van I3C en microzaad aan een scherm verhoogde ook het aantal hit voorwaarden ten opzichte van de controle scherm waaruit blijkt een 2,3 en zeven keer te verhogen voor kip eiwit lysozyme en de Orf11 domein respectievelijk. Dit toont aan dat de I3C RMMS-methode efficiënt nieuwe omstandigheden voor afgeleide kristallen kan produceren.

Kristallen uit deze omstandigheden kunnen worden geoogst en gebruikt om de kristalstructuur op te lossen. Zowel de structuur van hen eiwit lysozyme Orf11 domein kan worden opgelost met SAD fasering op de Auto-Riksja pijpleiding, met behulp van de afwijkende signaal van I3C waaruit blijkt succesvolle derivitization door de I3C RMMS scherm. We hebben een eenvoudig en efficiënt protocol gepresenteerd om hoogwaardige kristallen te produceren die zijn afgeleid met het faseringsmolecuul I3C.

Het minimaliseert het aantal schermen en kristallijne behandeling stappen, en dus is van bijzonder belang voor structurele biologen bestuderen van nieuwe eiwitten. Wij raden ten zeerste aan de kristalgrootte te optimaliseren door verschillende zaadverdunningen te testen die zijn gemaakt tijdens de bereiding van de zaadvoorraad. En deze stap is voltooid nadat de eerste schermen zijn gedaan.

I3C is op grote schaal beschikbaar en het is goedkoop om te kopen en dus geloven we dat deze methode binnen het bereik van de meeste structurele biologie laboratoria.