Name: Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer een methode voor immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming. Dit protocol minimaliseert drift en maakt dynamische observatie van neurale processen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het Januschke laboratorium wordt ondersteund door Wellcome trust grants 100031/Z/12/A en 1000032/Z/12/A. De weefselbeeldvormingsfaciliteit wordt ondersteund door de subsidie WT101468 van Wellcome.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li>
<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html">http://bradbusse.net/sciencedownloads.html</a> (2011).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
<li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879(2012).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Live beeldvorming van hele mount D. melanogaster larvale hersenen biedt de mogelijkheid om asymmetrische neurale stamceldelingen te observeren in omstandigheden die dicht bij een fysiologische context liggen. Het eerste deel van ons protocol introduceert onze aanpak van de dissectie van larvale hersenen. Zoals reeds vermeld13, een kritiek aspect van de voorbereiding is om te voorkomen dat de hersenen beschadigen. Het meest uitdagende aspect hiervan is om de hersenen te scheiden van de naburige fantasieschijven zonder overmatig aan de hersenen te trekken. Onze benadering van "snijden zonder trekken" is om ofwel een slijpbeweging uit te voeren met de uiteinden van een paar tangen, of om een tangpunten langs twee andere tangpunten te schuiven die de verbinding tussen weefsels vasthouden (figuur 1A) terwijl Lerit et al. zaagachtige bewegingen beschrijven met een ontleedpen. We raden de experimenteerder aan om alle benaderingen uit te proberen en de meest geschikte voor zichzelf te gebruiken. We raden ook aan om BSA- of FCS-gecoate pipettips te gebruiken in plaats van dissectietools om geïsoleerde hersenen over te dragen. De coating voorkomt dat weefsels aan het plastic blijven plakken en maakt de veilige overdracht van weefsels mogelijk terwijl ze altijd volledig ondergedompeld blijven, zonder ze te onderwerpen aan een mogelijke voorbijgaande vervorming terwijl ze tijdens de overdracht aan het dissectiegereedschap blijven plakken. Gecoate tips hebben andere voordelen om de overdracht van meerdere hersenen tegelijk mogelijk te maken, wat vooral handig is wanneer het van cruciaal belang is om de verblijfstijd van de monsters binnen een bepaald medium te regelen; ze zijn geschikt voor de overdracht van andere weefsels, zelfs kwetsbare als bijvoorbeeld dikke lichamen; ze zijn geschikt voor een breed scala aan verschillende monstergroottes door grotere uiteinden te gebruiken of het uiteinde van de punt te snijden.
Vervolgens beschrijft dit protocol het gebruik van Fibrinogeenstolling om larvale hersenen op de coverslip van een kweekschaal te immobiliseren. Een hersenen is georiënteerd binnen een daling van cultuurmedium + Fibrinogeen, waarna de stolling wordt geïnduceerd door de toevoeging van Trombine. De vorming van fibrines is geleidelijk en biedt een tijdvenster waarin de oriëntatie van het monster kan worden verfijnd, indien nodig (figuur 2C). Als een lichte compressie van het monster vereist is - wat we afraden in het geval van larvale hersenen - kan het ook fijn worden aangepast door het stolsel min of meer dicht bij het monster te drukken tijdens stap 3.4.4 en 3.5.2. Het belangrijkste voordeel van deze Fibrinogeenstolling ten opzichte van het protocol beschreven in Lerit et al., waarin hersenen zijn gemonteerd tussen een gasdoorlatend membraan en een deklip, is het vermogen om het cultuurmedium te vervangen tijdens live beeldvorming. Een mogelijk voordeel van het gebruik van een gasdoorlatend membraan ten opzichte van ons protocol zou kunnen zijn dat het een optimale oxygenatie van de monsters biedt, wat met onze aanpak beperkter zou kunnen zijn omdat hersenen van de lucht worden gescheiden door het stolsel en een medium. Om deze reden, hoewel we het effect van de hoeveelheid kweekmedium binnen het kweekgerecht niet hebben beoordeeld, stellen we voor om de hoeveelheid kweekmedium bovenop de stolsels te beperken terwijl de stolsels volledig ondergedompeld blijven.
Omdat de manipulatie van de stolsels experimenteel moeilijk en tijdrovend kan zijn, raden we de experimenteerder aan om eerst stolsels zonder monsters te manipuleren. Het moduleren van het volume van de druppel kweekmedium + Fibrinogeen op de deklip, de concentratie van Fibrinogeen of het volume en de concentratie trombine kan helpen de voorbereiding gemakkelijker te maken en kan belangrijk zijn bij het aanpassen van het protocol aan andere soorten weefsels. Met voldoende ervaring met het manipuleren van de stolsels, kunnen verschillende hersenen indien nodig in één stolsel worden geïmmobiliseerd, hoewel het de fijnafstelling van de oriëntatie bemoeilijkt. Op de coverslip kunnen verschillende stolsels worden gevormd, waardoor bijvoorbeeld monsters van verschillende genotypen kunnen worden gebeeldomd. Het is ook mogelijk om verschillende stolsels op dezelfde coverslip bloot te stellen aan verschillende cultuurmedia, hoewel er nooit voor moet worden gezorgd dat de druppels kweekmedium de verschillende stolsels bedekken. Zodra larvale hersenen zijn geïmmobiliseerd en klaar zijn voor live beeldvorming, raden we aan om de aanbevelingen van Lerit et al.13 op te volgen om overmatige fotodamage te voorkomen. We voegen alleen aan deze aanbevelingen toe om niet alleen de hersenen op 25 °C te houden tijdens live beeldvorming met een stadium-incubator, maar ook om deze fase minstens 30 minuten voor te verwarmen voor het begin van de beeldvorming. In onze handen resulteert het niet systematisch doen in een sterke focusdrift.
Het kan in sommige contexten voordelig zijn om gecorreleerde microscopie uit te voeren en een monster te repareren en te immunostaineren na live beeldvorming. Een beperking van het gebruik van Fibrin-stolsels is echter dat het bijna onmogelijk is om een brein mechanisch te isoleren van een stolsel zonder het te beschadigen. Een mogelijke manier om deze beperking te overwinnen zou kunnen zijn om methoden te ontwikkelen om Fibrine-stolsels met Plasmin af te afbraak of om stolseldemontage te induceren door toevoeging van een peptide dat de knoppen nabootst waardoor Fibrin-polymerisatie28mogelijk is. We gebruiken meestal Fibrine-stolsels op monsters variërend van enkele cellen tot 200 μM lange weefsels, maar we kunnen ook met succes immobiliseren in stolsels en beeldhersenen van volwassen hommels van meer dan 3 mm breed. De bovengrens van de steekproefgrootte die in stolsels kan worden geïmmobiliseerd, moet nog worden bepaald. Evenzo, hoewel we meestal geïmmobiliseerde monsters gedurende 4 tot 5 uur in beeld brengen, hebben we neuroblasten in primaire cultuur met succes gedurende maximaal 3 dagen in beeld brengen, wat aangeeft dat het stolsel op zijn minst de levensvatbaarheid op langere termijn niet verstoort. Integendeel, stolsels kunnen de regelmatige vervanging van het medium vergemakkelijken, een vereiste voor beeldvorming op langere termijn, zonder dat hiervoor apparaten zoals peristaltische pompen nodig zijn. Hoewel we de permeabiliteitsparameters van fibrinestolsels niet hebben gemeten, lijkt de vezelige gelachtige aard van de stolsels doordringbaar te zijn door celdoorlatende moleculen. We ontdekten dat Latrunculine A, Colcemid of 1-NAPP1, HALO-tag liganden en andere standaardkleurstoffen die in de celbiologie worden gebruikt, zonder problemen de cellen in het fibrinestolsel bereiken en tot nu toe geen moleculen zijn tegengekomen die door het stolsel zouden worden vastgehouden, wat echter een mogelijkheid is die empirisch moet worden getest.
Kortom, het gebruik van Fibrin-stolsels biedt een betrouwbare en relatief eenvoudig te implementeren manier om levende weefsels te immobiliseren voor live beeldvorming. Afgezien van het nut ervan bij het beperken van laterale drifting, is het vermogen om het cultuurmedium te veranderen tijdens live beeldvorming van onschatbare waarde gebleken voor onze chemische geneticabenadering voor het bestuderen van de asymmetrische celdeling van D. melanogaster neuroblasten21. We verwachten dat deze techniek gunstig zal zijn voor studies in een breed scala van verschillende weefsels, met name als het gaat om chemische genetica of bijvoorbeeld eiwitzelfetikettering29.
Onze MultiHyperStackReg macro is afhankelijk van de TurboReg ImageJ plugin, die opeenvolgende frames of segmenten van een stack uitlijnt, en de MultiStackReg ImageJ plugin, waarmee de transformaties op andere stacks kunnen worden toegepast. MultiHyperStackReg maakt het eenvoudig mogelijk om deze transformaties toe te passen op hyperstacks (stacks met ten minste vier dimensies). Omdat het gebruik van MultiHyperStackReg, zoals we het beschrijven, veel acties vereist en behoorlijk tijdrovend kan worden, hebben we ook de AutoHyperStackReg-macro geschreven, die automatisch alle stappen uitvoert die worden beschreven in stap 6.2 en 6.3. In tegenstelling tot MultiHyperStackReg mist AutoHyperStackReg momenteel echter de mogelijkheid om de uitlijning van een stack te berekenen op basis van een subregio van deze stack, een optie die we soms cruciaal vonden voor een bevredigende uitlijning. Een andere beperking van AutoHyperStackReg is dat het gebruik ervan beperkt is tot vertalingen en niet tot de andere transformaties die worden voorgesteld door TurboReg en MultiStackReg, terwijl MultiHyperStackReg op een hyperstack elk transformatietype kan toepassen als de gebruiker het nodig heeft. Toekomstige releases implementeren deze functies en zijn beschikbaar op GitHub30. Ten slotte biedt onze roterende linescan macro een eenvoudige manier om snel corticale signalen te meten in timelapses, zelfs als de cortex in de loop van de tijd van positie of oriëntatie verandert. Of de trackingmodus of de niet-trackingmodus het meest geschikt is voor analyse, hangt af van de kwaliteit en consistentie van het corticale signaal. De trackingmodus is gemakkelijker te gebruiken omdat de gebruiker niet hoeft te overwegen waar de cortex zal zijn voor elk tijdspunt en in de loop van de tijd grote veranderingen in positie en oriëntatie kan opvangen. Het is echter alleen geschikt als het corticale signaal sterk genoeg blijft voor detectie tijdens de hele film: een falen om iets anders dan de cortex te detecteren (bijv. een helder cytoplasmatisch compartiment dicht bij de cortex) kan de detectie voor elk volgend tijdspunt in gevaar brengen (bijv. het cytoplasmatische compartiment beweegt weg van de cortex en de corticale linescan volgt het voor de rest van de time-lapse). De niet-trackingmodus heeft deze valkuil niet, omdat de detectie beperkt is tot de lijn die oorspronkelijk door de gebruiker werd getrokken (een helder cytoplasmatisch compartiment kan er bijvoorbeeld voor zorgen dat de detectie een paar keer mislukt, maar naarmate het cytoplasmatische compartiment zich van de detectiezone verplaatst, wordt de juiste detectie van de cortex hervat), maar gedraagt zich niet goed als de cortexpositie of oriëntatie in de loop van de tijd veel verandert. De volgende functie (die beschikbaar zal zijn op GitHub30) die moet worden ontwikkeld voor de trackingmodus, is de optie om alleen opgegeven tijdspunten te analyseren en een referentietijdpunt te definiëren (in plaats van het eerste tijdspunt) waarvoor en waarna de detectie zal worden uitgevoerd, waardoor de gebruiker op zijn minst problematische tijdspunten kan voorkomen.

Drosophila blijft een belangrijk modelsysteem om een breed scala aan biologische vragen te bestuderen en blinkt al tientallen jaren uit in het bevorderen van kennis in vele disciplines. Een functie die het bijzonder opvalt, is dat het bijzonder geschikt is voor live beeldvorming. Het vermogen om subcellulaire processen of het gedrag van cellen en weefsels in realtime te volgen, blijft bijdragen aan het genereren van sleutelbegrippen die relevant zijn voor cel- en ontwikkelingsbiologie. Veel succesvolle protocollen zijn ontwikkeld door verschillende groepen om dergelijke Drosophila-monsters levend en gezond te houden om het gedrag van het monster en fluorescerende moleculen te bestuderen. Organen en weefsels van de vlieg, zoals fantasieschijven1,2,de larvale hersenen3,4,5, 6of eierkamers van volwassen vrouwtjes7,8,9,of de volwassen darm10 kunnen bijvoorbeeld worden geëxtraheerd en in cultuur worden gehouden voor beeldvorming met time-lapse microscopie. Een belangrijke uitdaging voor live beeldvorming is ervoor te zorgen dat het monster dicht bij het beeldoppervlak wordt gehouden voor een optimale resolutie en onbeweeglijk zonder afbreuk te doen aan de integriteit van het monster dat gevoelig kan zijn voor mechanische schokken. Om neurale stamcellen te bestuderen, neuroblasten of neuronen genoemd in de drosophila larvale hersenen, bijvoorbeeld, kan het houden van monsters dicht bij het beeldvormingsoppervlak worden bereikt door ze te bedekken met kweekmedia in verzegelde beeldvormingskamers11,12,13. Deze aanpak maakt media-uitwisseling echter niet gemakkelijk mogelijk, waardoor de experimentele manoeuvreerruimte wordt beperkt. Als alternatief kunnen monsters worden bereid en op afdeklips worden geplaatst die worden behandeld om de hechting van cellen te verhogen en multi-point bezoekende microscopie en uitgebreide live-cell imaging in open kweekgerechten mogelijk te maken, die media-uitwisseling mogelijk maken, maar geen gemakkelijke middelen bieden om monsterdrift of verlies tijdens media-uitwisseling te voorkomen14,15.
De Fibrin-stolselmethode die oorspronkelijk is ontwikkeld om meiose in levende kraanvlieg spermatocyten16 te bestuderen, is specifiek geschikt om deze problemen te overwinnen. Fibrinogeen wordt opgelost in een relevant kweekmedium, de monsters worden in een druppel van deze oplossing op een geschikte beeldkamer voor het glasoppervlak geplaatst en georiënteerd voordat trombine wordt toegevoegd, wat resulteert in de snelle vorming van een onoplosbaar Fibrine-stolsel, een kleverig vezelig gaas dat zich hecht aan het glasoppervlak en de monsters en tegelijkertijd de toegang van het monster tot het kweekmedium garandeert. Het medium kan vervolgens worden verwisseld zonder de stolsel- of monsterpositie te storen. Uitwisseling van kweekmedia tijdens beeldvorming is bijvoorbeeld wenselijk wanneer remmers moeten worden toegevoegd zoals in de oorspronkelijke methode of voor uitwas- of pulsachtervolgingsexperimenten of wanneer fluorescerende kleurstoffen moeten worden toegevoegd tijdens live cell imaging terwijl cellen en weefsels op hun plaats blijven. Fibrinestolsels zijn geschikt voor beeldvorming van Drosophila-weefsels en individuele cellen13,17. Fibrinestolsels kunnen verder worden gebruikt om monsters te helpen oriënteren, die vanwege hun vorm of andere eigenschappen normaal gesproken niet op de gewenste manier zouden worden georiënteerd door de monsterpositie binnen het Fibrin-stolsel en de vorm van het stolsel zelf te moduleren.
Hier geven we een update over onze huidige Fibrin-stolselgebaseerde beeldvormingsmethoden en bieden we tools voor segmentatiegebaseerde beeldanalyse en richten we ons op het gebruik van deze methode om neuroblastafdelingen in het zich ontwikkelende vliegbrein te bestuderen. We gebruiken routinematig de Fibrin-stolselmethode om meerdere monsters in verschillende stolsels in hetzelfde kweekgerecht te volgen. Dit maakt i) beeldvorming van subcellulaire gebeurtenissen zoals centrosoomgedrag of mRNA-lokalisatie live18,19, ii) het monitoren van het gedrag van monsters bij farmacologische behandeling van verschillende genotypen onder dezelfde beeldvormingsinstellingen met behulp van meerpuntsbezoekmicroscopie20, iii) het bestuderen van de effecten van acute remming van enzymen21 en iv) het minimaliseren van driften om veranderingen in de oriëntatie van celdeling van cellen binnen hun fysiologische omgeving te bestuderen bij gerichte laserablatie2. Hoewel ongewenste effecten van Trombine en Fibrinogeen en het Fibrine-stolsel empirisch moeten worden getest voor elk monster, is deze methode in principe geschikt om elk type monster te immobiliseren dat moet worden geanalyseerd door live cell imaging en in Drosophila is met succes gebruikt om meerdere aspecten van neuroblastenbiologie5,19,20te bestuderen , maar ook de dynamiek van cytosensorprojecties van vrouwelijke kiemlijnstamcellen23 en veranderingen in polariteit bij acuteaP.
Time-lapse fluorescerende beeldvorming resulteert in het genereren van complexe tijd-opgeloste 3D-gegevens sets die methoden vereisen om deze kwantitatieve informatie te extraheren. Hier beschrijven we onze verdere ontwikkeling van imagej-gebaseerde24 macro's die kunnen worden gebruikt om te corrigeren voor drifting in hyperstacks en op maat gemaakte ImageJ-macro's die semi-geautomatiseerde kwantificering van multi-channel fluorescentie in de celschors mogelijk maken, ontwikkeld om corticale eiwitten te kwantificeren in neuroblasten van Drosophila larvale hersenen of van individuele neuroblasten in primaire celcultuur.

<table><tbody><tr><td>Albumine bovien serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum, geschikt voor celkweek</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeen uit menselijk plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Celkweekschaal - 35mm, 23 mm putje</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spotplaat met negen depressies</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Trombine uit bovien plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

toepassingen van immobilisatie van drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is een belangrijk modelsysteem om een breed scala aan biologische vragen te bestuderen. Verschillende organen en weefsels uit verschillende ontwikkelingsstadia van de vlieg, zoals imaginaire schijven, de larvale hersenen of eikamers van volwassen vrouwtjes of de volwassen darm, kunnen worden geëxtraheerd en in cultuur worden gehouden voor beeldvorming met time-lapse microscopie, wat waardevolle inzichten biedt in cel- en ontwikkelingsbiologie. Hier beschrijven we in detail ons huidige protocol voor de dissectie van Drosophila larvale hersenen, en presenteren we vervolgens onze huidige aanpak voor het immobiliseren en oriënteren van larvale hersenen en andere weefsels op een glazen hoeslip met behulp van Fibrine-stolsels. Deze immobilisatiemethode vereist alleen de toevoeging van Fibrinogeen en Trombine aan het cultuurmedium. Het is geschikt voor timelapse-beeldvorming met hoge resolutie op omgekeerde microscopen van meerdere monsters in dezelfde kweekschaal, minimaliseert het laterale driften dat vaak wordt veroorzaakt door bewegingen van het microscoopstadium in meerpuntsbezoekmicroscopie en maakt het mogelijk om reagentia toe te passen en te verwijderen tijdens de beeldvorming. We presenteren ook op maat gemaakte macro's die we routinematig gebruiken om te corrigeren voor driften en om specifieke kwantitatieve informatie uit time-lapse-analyse te extraheren en te verwerken.

Immobilisatie van Drosophila weefsels met Fibrine stolsels en uitwisseling van kweekmedia tijdens live beeldvorming. Na te zijn ontleed volgens de procedure gepresenteerd in stap 2 (figuur 1) en geïmmobiliseerd in Fibrin-stolsels op dezelfde coverslip na de procedure gepresenteerd in stap 3 (figuur 2), werden larvale hersenen die GFP-gelabelde Bazooka (Baz::GFP), de vliegenortholoog van het polariteitseiwit Par-3, uitdrukken gedurende 30 minuten afgebeeld in time-lapse confocale beeldvorming met meerdere standen. Baz::GFP wordt gecombineerd met apkcas4, een allel dat acute remming van atypische eiwitkinase C (aPKC) mogelijk maakt door de toevoeging van de kleine ATP analoge 1-NAPP120. 1-NAPP1 werd daarom toegevoegd aan het cultuurmedium na de procedure in stap 4 en live beeldvorming werd gedurende 2,5 uur hervat. Controlehersenen met een wild-achtige versie van de kinase-aPKC reageerden niet op de ATP-analoog, terwijl hersenen met bovendien een analoog-gevoelige mutatie van aPKC (apkcas4) een samentrekking van het neuro-epitheel en heldere clusters van Baz in neuroblasten en hun nageslacht vertoonden ( Figuur6, Video 1). Neuroblasten blijven zich gedurende de time-lapse verdelen, wat aangeeft dat het weefsel gezond blijft, en hersenen vertonen weinig drift ondanks de verandering van het cultuurmedium, wat aangeeft dat ze goed geïmmobiliseerd zijn. Evenzo, na te zijn ontleed na de procedure gepresenteerd in27, ovarioles uitdrukken Baz::GFP werden geïmmobiliseerd in Fibrin stolsels op dezelfde coverslip en afgebeeld gedurende 8 min, waarna toepassing van 1-NAPP1 veroorzaakte de samentrekking van apkcas4 mutant folliculaire cellen, maar niet van controles (Figuur 7, Video 2).
Correctie van laterale en focus drift met behulp van MultiHyperstackReg. Een hyperstack met zowel laterale als focus drift(Video 3,linker paneel) werd eerst gecorrigeerd voor laterale drift (stap 6.2, Figuur 3, Video 3, middenpaneel), vervolgens focus drift (stap 6.3, Figuur 4, Video 3, rechter paneel) met behulp van de MultiStackReg plugin en de MultiHyperstackReg macro, wat resulteerde in een aanzienlijke vermindering van de bewegingen waargenomen in de oorspronkelijke hyperstack.
Corticale signaalmeting met behulp van roterende linescans Een neuroblast die Baz uitdrukt::GFP (groen) en het transmembrane-eiwit CD4 gelabeld met een infrarood fluorescerend eiwit (CD4::mIFP, rood) werd afgebeeld tijdens één mitose. Het CD4::mIFP-signaal werd gebruikt als referentie om de cortex op verschillende delen van de neuroblast te detecteren met linescans (stap 7, figuur 5, figuur 8A–C) en het Baz::GFP-signaal werd gemeten op de gedetecteerde posities Figuur 8D). Tijdens hun deling polariseerden neuroblasten tijdelijk door verschillende en tegenovergestelde corticale domeinen vast te stellen: de apicale pool en de basale pool. Baz definieert de apicale pool en, consequent, het Baz::GFP-signaal verhoogd bij de apicale pool van de neuroblast en verlaagd aan de basale pool tijdens de deling (Figuur 8C,D). De positie van de cortex werd bevredigend bijgehouden gedurende de time-lapse (Figuur 8C, Video 4). De Drosophila-lijnen en genotypen worden genoemd in aanvullende tabel 1–2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figuur 6: Toepassing van een ATP analoog op geïmmobiliseerde larvale hersenen tijdens live beeldvorming. (A) Levende beeldvorming van twee larvale hersenen die Baz uitdrukken::GFP geïmmobiliseerd op dezelfde coverslip. Het kweekmedium wordt na 0 min veranderd in een concentratie van 10 μM van de ATP analoge 1-NAPP1. Controlehersenen reageren niet zichtbaar op het ATP-analoog, terwijl hersenen met een analoge gevoelige mutatie van aPKC (aPKCAS4) een samentrekking van het neuro-epitheel (pijlpunten) en heldere clusters van Baz in neuroblasten en hun nakomelingen vertonen. Maximale intensiteitsprojectie van 33 plakjes voor een diepte van 23 μM. Schaalbalk: 20 μM. (B) Vergroting van het neuro-epitheel. Schaalbalk: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figuur 7: Toepassing van een ATP-analoog op geïmmobiliseerde eierkamers tijdens live beeldvorming. Live beeldvorming van twee ovarioles die Baz uitdrukken::GFP geïmmobiliseerd op dezelfde coverslip. Het kweekmedium wordt na 0 min veranderd in een concentratie van 10 μM van de ATP analoge 1-NAPP1. Controle-eierkamers reageren niet zichtbaar op de ATP-analoog, terwijl eierkamers met een analoge gevoelige mutatie van aPKC (aPKCAS4) een samentrekking van het epitheel (pijlpunten) vertonen, wat uiteindelijk leidt tot de schijnbare afbraak van aanhangverbindingen. Maximale intensiteitsprojectie van 33 plakjes voor een diepte van 27 μM. Schaalbalk: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figuur 8: Meting van het corticale signaal met behulp van roterende linescans. (A) Live D. melanogaster neuroblast met Baz::GFP (groen) en CD4::mIFP (rood). Cyaanlijnen: initiële scanlijnen loodrecht getraceerd naar verschillende corticale zones om te meten. Schaalbalk: 5 μM. (B) Identificatie van de cortex (donkerblauwe lijn) met behulp van corticale linescans en CD4::mIFP (rood) als referentiekanaal. Cyaanlijn: gebied gedefinieerd door de parameter "Meten rond" (hier 2 pixels), waarbij het signaal wordt gemeten na cortexdetectie. Schaalbalk: 2 μm. (C) Cyaan: corticale gebieden die tijdens een neuroblastdeling zijn geïdentificeerd door de roterende linescans-methode vanaf de eerste scanlijnen die in (A) worden weergegeven, met CD4::mIFP (rood) als referentiekanaal. Schaalbalk: 5 μM. Pijl: apicale pool. Pijlpunt: basale pool. (D) Meting van de Baz::GFP-signaalintensiteit in de loop van de tijd in de twee overeenkomstige zones die worden geïdentificeerd door roterende linescans weergegeven in (C). Tijdens mitose wordt Baz::GFP tijdelijk verrijkt aan de apicale pool van de neuroblast en is uitgeput van de tegenoverliggende basale pool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Video 1: Toepassing van media-uitwisseling op geïmmobiliseerde larvale hersenen tijdens live beeldvorming om een remmer toe te voegen, gepresenteerd in figuur 6, schaalbalk: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Video 2: Toepassing van media-uitwisseling op geïmmobiliseerde eierkamers tijdens live beeldvorming om een remmer toe te voegen, weergegeven in figuur 7, schaalbalk: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Video 3: Correctie van laterale en focus drift met behulp van MultiHyperStackReg. Live beeldvorming van een neuroblast die de membraansonde PH::GFP uitdrukt. Xy: enkel brandpuntsvlak. Xz: orthogonale reslice. Links: voor correctie van de drift. Midden: na correctie van de laterale drift. Rechts: na correctie de laterale en focus drift, schaalbalk: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Video 4: Detectie van de cortex met behulp van roterende linescans, weergegeven in figuur 8, schaalbalk: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Genotypen van afgebeelde Drosophila weefsels. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Oorsprong van gebruikte transgenen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 1: Oorsprong van gebruikte transgenen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 2: Oorsprong van gebruikte transgenen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 3: Oorsprong van gebruikte transgenen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft toepassingen van monsterimmobilisatie met behulp van Fibrine-stolsels, waardoor driften worden beperkt en de toevoeging en washout van reagentia tijdens live beeldvorming mogelijk is. Monsters worden overgebracht naar een druppel Fibrinogeen met kweekmedium op het oppervlak van een afdeklip, waarna polymerisatie wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine.

Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Dit protocol beschrijft monsterimmobilisatie met behulp van fibrineklontjes. monsters worden overgebracht naar een druppel fibrinogeen bevattend kweekmedium op het oppervlak van een dekglas, waarna polymerisatie wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een borstel om L3-larven over te brengen naar een glazen schaal met negen gaten, gevuld met PBS.Roer om de meeste vliegvoeding los te maken van de larven, en breng het over naar een andere put met kweekmedium. Gebruik pincetten om een larve door zijn volledige diameter in het midden van zijn lichaamslengte vast te grijpen, en breng hem over naar een andere put van de borosilicaatplaat met 200 microliter vers kweekmedium. Laat de larve niet los.Om de larve door zijn volledige diameter in tweeën te snijden, maal of wrijf het vastgegrepen gebied met een laterale beweging van de pincetpunten, of schuif een punt van een ander paar pincetten tussen de twee pincetpunten die de larve vasthouden. Gebruik de pincetten om de larve bij zijn cuticula vast te grijpen, en een ander paar pincetten om de cuticula te scheuren zonder aan de hersenen te trekken. Herhaal dit tot de zenuwen die uit de hersenen komen zichtbaar zijn, en de organen die de hersenen met de monddelen verbinden, kunnen worden bereikt.Terwijl de uit de hersenen afkomstige zenuwen met pincetten worden vastgehouden, snijdt u de verbinding tussen de hersenen en de monddelen met het andere paar pincetten, waardoor de hersenen worden gescheiden van de rest van de cuticula. Houd de hersenen vast aan de axonen die uit het ventrale zenuwsnoer komen en trek de omringende organen voorzichtig weg van de hersenen. Grijp vervolgens de verbinding tussen de oogimaginale schijven en de hersenen met het andere paar pincetten, en snij deze verbinding door zonder aan de hersenen te trekken.Zorg ervoor dat de hersenen goed zijn ontdaan van ander weefsel en niet beschadigd zijn. Gooi de hersenen weg als ze tekenen van beschadiging vertonen. Pipetteer de coatingoplossing met een P20 in en uit om de pipettip te coaten, aspirieer vervolgens de hersenen met de gecoate tip samen met drie microliter medium, en pipetteer het uit in een andere put met 200 microliter schoon kweekmedium.Herhaal dit proces tot er genoeg hersenen zijn gedisseceerd, en vervang af en toe het kweekmedium van de put waarin de dissecties worden uitgevoerd. Gebruik een P20 pipet met een gecoate tip om de gedissekteerde hersenen over te brengen naar een andere put van de borosilicaatplaat met 200 microliter kweekmedium en fibrinogeen. Aspireer één hersen samen met negen microliter kweekmedium en fibrinogeen.Met het uiteinde van de tip bijna tegen de glazen bodem van de celcultuurschaal, pipetteer de inhoud eruit zodat het kweekmedium direct na het verlaten van de pipettip het dekglas raakt. Gebruik een punt van een paar pincetten, of een gesloten paar pincetten, om de hersenen voorzichtig in het kweekmedium en fibrinogeen-druppeltje te duwen en te positioneren. Als de ventrale kant van de hersenen moet worden afgebeeld, induceer fibrinogeenstolling om de hersenen goed te oriënteren binnen het klontje.Duw de hersenen naar een kant van de druppel. Raak met de pipettip de rand van de druppel aan de tegenovergestelde kant van de hersenen en voeg een microliter trombine toe. Wacht een tot twee minuten tot het fibrinogeen begint te polymeriseren, wat resulteert in de vorming van een troebele neerslag aan één kant van de druppel, en duw vervolgens voorzichtig de hersenen in het fibrineklont, ervoor zorgen dat de ventrale kant zo dicht mogelijk bij het dekglas ligt zonder de hersenen te vervormen.Pipetteer één microliter trombine-oplossing dicht bij de kant van de hersenen die niet in het fibrineklont is gestoken. Wacht twee tot drie minuten tot het tweede fibrineklont is gestold, en druk vervolgens op de randen van het klont om het sterker aan het dekglas te laten hechten, zorg ervoor dat u de hersenen niet vervormt. Als de hersenen te ver van het dekglas lijken te zijn, breng ze dichterbij door het fibrineklont dichter bij de hersenen te drukken.Om het fibrineklont te induceren voor het afbeelden van het dorsale deel van de hersenen, plaats de hersenen in het midden van de druppel, met de dorsale kant naar het dekglas. Gebruik een P2 pipet, raak met de pipettip de rand van de druppel aan de tegenovergestelde kant van de hersenen en pipet één microliter trombine. Wacht twee tot drie minuten tot het fibrinogeen begint te polymeriseren, wat resulteert in de vorming van een troebele vezelachtige neerslag, en druk vervolgens op de randen van het klont om het sterker aan het dekglas te laten hechten, zorg ervoor dat u de hersenen niet vervormt.Met het uiteinde van de tip op ongeveer 0,5 centimeter boven het klont gepositioneerd, pipetteer voorzichtig 390 microliter kweekmedium zonder fibrinogeen druppelsgewijs op het klont. Voeg het kweekmedium niet toe aan de zijden van het klont, omdat het kan losraken van het dekglas. Om het overtollige trombine weg te wassen, verwijder 300 microliter uit de schaal en voeg vervolgens 300 microliter schoon kweekmedium toe, waarbij u ervoor zorgt dat de klonten volledig ondergedompeld blijven.Om temperatuurveranderingen die focusveranderingen veroorzaken te voorkomen, houd de oplossing met de reagentia op dezelfde temperatuur als de kweekschaal. Verwijder het deksel van de kweekschaal zonder de schaal zelf te verplaatsen. Plaats voor gemakkelijker verwijdering het deksel van de 35 millimeter schaal ondersteboven op de schaal voordat u gaat beeldvormen.Plaats een P1000 pipettip dicht bij het oppervlak van het medium in de kweekschaal, en laat voorzichtig het juiste volume reagentiëloplossing erop vrij, zonder sterke stromingen te genereren die de klonten kunnen losmaken. Gebruik een P200 pipet om een kleine hoeveelheid van de oplossing langzaam in en uit vijf keer te pipetten om de oplossing in de kweekschaal te homogeniseren. Plaats

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Een eenvoudige microfluïdische apparaat is ontwikkeld om verdoving gratis uit te...

Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; En zebravis

Een protocol voor levende beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten of autofluorescerende structuren in...

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Dit protocol beschrijft een methode voor het monteren van Drosophila larven om langer dan 10 uur ononderbroken time-lapse beeldvorming bij intacte levende dieren te bereiken. Deze methode kan worden gebruikt om veel biologische processen dicht bij de larve lichaam wand beeld.

LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging

Leer een methode voor immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming. Dit protocol minimaliseert drift en maakt dynamische observatie van neurale processen mogelijk.

Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

Meer video's verkennen