Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten
16 mei 2021
Een verfijnde methode van weefselopruiming werd ontwikkeld en toegepast op het volwassen muizenhart. Deze methode is ontworpen om dicht, autofluorescent hartweefsel te zuiveren, met behoud van gelabelde fibroblastfluorescentie toegeschreven aan een genetische reporterstrategie.
Dit nieuwe weefselontruimingsprotocol verbetert de bestaande technologie om een nauwkeurigere in vivo blik te geven op specifieke celtypen in het hart en hun gedrag onder verwondingsomstandigheden. Dit protocol is snel en vrij eenvoudig. Het maakt het mogelijk om marca fluorescentie te handhaven met minimale interferentie van autofluorescentie van achtergrondweefsel zonder cel- of weefselkleuring te vereisen.
Begin met het gebruik van een 70% ethanol gedrenkt gaasje om het ventrale oppervlak van de experimentele muis te reinigen. Gebruik een chirurgische schaar om een transversale incisie van drie centimeter te maken, ongeveer drie meter onder het xiphoid-proces en de muis van de buik naar het xiphoid-proces te degloveeren om de huid van het onderliggende buikwandweefsel te scheiden. Maak een transversale incisie van twee centimeter in het onderhuidse buikwandweefsel, drie centimeter onder het xiphoid-proces en maak een verticale snede van deze incisie in de middellijn door de ribbenkast.
Speld de ribbenkast terug om het hart bloot te leggen. En gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een 27 gauge naald om koude PBS in de superieure vena cava en aorta te injecteren. Wanneer al het bloed uit het hart is gespoeld, levert u 10 milliliter koude 4% PFA in de superieure vena cava en aorta om het fixatieproces te starten.
Wanneer al het fixatief is geflitst, verwijdert u het hart en gebruikt u een rechte scalpel om de atria, rechterventrikel en septum en linkerventrikel te scheiden. Plaats het hart in een conische buis van 15 milliliter koude 4%PFA voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius op een nutator. Voeg de volgende ochtend een 0,25% foto-initiatoroplossing toe aan een vers bereide hydrogels-oplossing en breng het hart over naar de hydrogel.
Wikkel de conische buis in folie voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius zonder fysieke verstoring. Verwarm de volgende ochtend de buis in een kraalbad van 37 graden Celsius gedurende 2,5 uur voordat u een tang gebruikt om het hart voorzichtig over te brengen in een buis van 15 milliliter PBS. Was het hart driemaal in PBS gedurende één uur per wasbeurt op 37 graden celsius op een nutator en breng het hart over in de mand van een actieve elektroforesemachine.
Zet het deksel vast en vul het actieve elektroforesekamerreservoir met elektroforeseopruimingsoplossing. Zodra de kamer vol is, dompelt u de mand onder in de oplossing en draait u de dop op de elektroforesemachine vast. Laat de elektroforesemachine vervolgens 1,5 uur draaien op 1,5 ampère en 37 graden Celsius.
Controleer na elektroforese het visueel van het hart om er zeker van te zijn dat er geen ondoorzichtig weefsel achter blijft. Was het ontruimde hart driemaal in een 15 milliliter twee gedurende een uur in verse PBS op 37 graden celsius per wasbeurt op een nutator. Voordat u het hart onderdompelt in een ontkleuringsmiddel om de autofluorescentie van heem te verminderen.
Was het hart na 48 uur driemaal in PBS zoals aangetoond en equilibreert het hart in vers bereide RIM's gedurende 48 uur voorafgaand aan de beeldvorming. Voor 3D-beeldvorming van het ontruimde hart plaatst u eerst een dunne laag vacuümvet op de bodem van een 3D-geprint bodemreservoir, op dezelfde hoogte als het monster dat wordt afgebeeld. Vul het reservoir met RIMS en gebruik een pipettip om eventuele bubbels te verwijderen.
Plaats het hart voorzichtig in de RIMS met de linker ventriculaire wand naar boven gericht, zorg ervoor dat er geen bubbels in de oplossing worden geïntroduceerd. Gebruik vacuümvet om een glazen afdekstrip aan het onderoppervlak van een 3D-geprint bovenreservoirstuk te bevestigen en plaats de deksels van het bovenste reservoir op de onderste reservoirs, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen ontstaan. Vul vervolgens de bovenste reservoirs met glycerol.
Gebruik een confocale microscoop om de gewiste harten in beeld te krijgen. De combinatie van verfijnde hartweefselontruiming met 3D-beeldvorming maakt een geavanceerde gedetailleerde visualisatie van hartfibroseblasten mogelijk. Met behulp van deze beeldvormingstechniek worden fibroblasten waargenomen die dicht opeengepakt zijn en een spindelmorfologie hebben in niet-gewonde harten.
Na ischemie reperfusie letsel, een verlies van cardiale fibroblasten wordt gezien in de ischemische regio voor de eerste drie dagen na letsel. Op dag zeven en 14 zijn fibroblasten gemigreerd of verspreid om het gewonde weefselgebied opnieuw te bevolken. Tegen dag 28 is de populatie van hartfibrose rond de gewonde gebieden van het hart op hun grootste dichtheid.
Anderhalve dag na myocardinfarctletsel blijven er weinig fibroblasten achter in de gewonde linkerventrikel. Op dag drie zetten de fibroblasten echter uit en zijn ze aanwezig in het grootste deel van de linkerventrikel. In tegenstelling tot ischemische chirurgie leidt infusie van angiotensine twee en fenolefrine gedurende meerdere weken niet tot hartweefselverlies en wandverdunning.
In plaats daarvan lijnt de fibroblast uit langs de as van het rechtshandige helixcontractiepatroon, zoals te zien is bij het gebruik van het protocol voor het ophelderen van geraffineerde naar weefsel. Bovendien lijken de fibroblasten na behandeling met angiotensine twee en fenolefrine klein en afgerond in tegenstelling tot de spindelvorm die wordt waargenomen bij modellen van ischemie-reprofusie en myocardinfarctletsel. De elektroforetische clearing moet zorgvuldig worden uitgevoerd, vooral bij het werken met harten die letselprotocollen hebben ondergaan.
Dit protocol kan worden gebruikt om te beoordelen hoe hartfibrose in vivo reageert op letsel. Verschillende fluorescerende markers kunnen ook worden gebruikt om te begrijpen hoe het hart reageert op letsel op cellulair niveau.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Er werd een verfijnde weefselklaringsmethode ontwikkeld voor het volwassen muizenhart, waardoor het mogelijk is specifieke celtypen te visualiseren terwijl de achtergrondautofluorescentie wordt geminimaliseerd. Dit protocol verbetert bestaande technieken voor het bestuderen van cardiaal weefsel.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Cardiovasculaire biologie
- Weefselengineering
Achtergrond
- Weefselklaringstechnieken zijn essentieel voor het beeldvormen van dichte biologische weefsels.
- Autofluorescentie kan specifieke cellulaire signalen in beeldvormingsstudies verdoezelen.
- Het behoud van fluorescentie van gelabelde cellen is cruciaal voor nauwkeurige analyse.
- Bestaande methoden kunnen kleuring vereisen, wat het proces compliceert.
Doel van de studie
- Om een snel en eenvoudig weefselklaringsprotocol te ontwikkelen.
- Om de visualisatie van fibroblastfluorescentie in cardiaal weefsel te verbeteren.
- Om achtergrondinterferentie van autofluorescentie te verminderen.
Gebruikte methoden
- Gebruikt 70% ethanol voor het reinigen van de ventrale oppervlakte van de muis.
- Uitgevoerde chirurgische insnijdingen om toegang tot het hart te krijgen.
- Toegepast het nieuwe klaringsprotocol op het hartweefsel.
- Marca-fluorescentie behouden zonder kleuring.
Belangrijkste resultaten
- Het nieuwe protocol maakt dichte cardiale weefsels effectief doorzichtig.
- Fibroblastfluorescentie werd tijdens het proces behouden.
- Achtergrondautofluorescentie werd significant verminderd.
- De methode maakt betere in vivo beeldvorming van cardiale cellen mogelijk.
Conclusies
- Deze verfijnde methode verbetert de studie van cardiaal weefsel.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die reacties op hartletsel onderzoeken.
- Het protocol is efficiënt en minimaliseert de behoefte aan aanvullende kleuring.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding cardiac fibroblast dynamics in three dimensions provides critical insights into fibrosis mechanisms that drive ventricular stiffness and heart failure progression. This refined CLARITY-based tissue clearing approach enables high-fidelity, whole-organ visualization of fibroblast behavior without antibody penetration limitations or fluorescence loss, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. The method offers predictive value by revealing spatially resolved fibroblast responses to ischemic and non-ischemic injury models, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast localization and morphology in intact tissue to clarify pathogenic versus reparative roles in cardiac fibrosis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic fibroblast labeling (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) to spatial phenotypes in healthy and injured hearts.
- Predictive Confidence: Reveals injury-specific fibroblast patterns—such as aligned bands post-angiotensin II/phenylephrine or repopulation from border zones post-ischemia—to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces cleared, fluorescently labeled hearts compatible with confocal imaging for quantitative 3D analysis of fibroblast density, distribution, and morphology.
- Reproducibility: Standardized electrophoresis-based clearing (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) and RIMS equilibration ensure consistent tissue optical properties across experimental groups.
- Scalability: Compatible with multi-sample processing in active electrophoresis chambers, enabling side-by-side comparison of control, ischemic, and hypertensive injury models.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Captures fibroblast responses in models mimicking human ischemic injury (reperfusion) and pressure overload (angiotensin II/phenylephrine), aligning with clinical fibrosis phenotypes.
- Translational Continuity: Tracks fibroblast death, border zone repopulation, and density peaks at day 28 post-ischemia—key temporal windows for antifibrotic intervention testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes pro-fibrotic spindle-shaped fibroblasts in ischemia from small, rounded phenotypes in hypertension, informing target-specific pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved phenotypic data that bridges in vitro findings and functional outcomes in preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of fibroblast activation, migration, and proliferation in 3D tissue context, clarifying pathway-level contributions to fibrosis.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (fibroblast density, alignment, morphology) suitable for high-content analysis in compound screening cascades.
- Analytics: Supports morphometric and spatial statistical analysis of fibroblast networks, enabling comparison across genotypes, injuries, and time points.
- Translational Research: Links fibroblast dynamics to ventricular remodeling timelines, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue clearing and imaging platform applicable to multiple cardiovascular disease models and cell types beyond fibroblasts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibroblast function by preserving native tissue architecture and fluorescent signal integrity.
- Operational Value: Eliminates need for sectioning and staining, reducing workflow variability and increasing throughput for 3D phenotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by revealing on-target fibroblast responses that predict functional outcomes in heart failure models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antifibrotic targets based on spatially validated target engagement and phenotypic modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery, perfusion fixation, and hydrogel-based tissue clearing techniques.
- Dependent on access to active electrophoresis equipment, confocal microscopy, and RIMS/glycerol mounting solutions.
- Necessitates standardization of clearing duration and temperature to prevent over-clearing or autofluorescence in injured tissue.
- Adaptation to other disease models may require optimization of decolorization time to reduce heme-derived background without quenching GFP signal.
- Practical limitation: Long-term imaging stability depends on proper RIMS equilibration to prevent refractive index mismatch and signal degradation.
