Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Dit protocol heeft veel voordelen ten opzichte van de momenteel gebruikte gist metabolomics omdat het een hoge specificiteit, hoge gevoeligheid heeft en ook veel verschillende klassen van metabolieten kan profileren, waaronder isomeer, isobare, hydrofiele en hydrofobe moleculen. De blusmethode die in dit protocol wordt gebruikt, stopt alle enzymatische reacties en vermindert de lekkage van metabolieten uit de cellen aanzienlijk. De MS1-bibliotheek die in dit protocol is ingebouwd, is afkomstig van de verschillende MS2-uitvoeringen.

Bepaal na een nachtkweek bij 30 graden Celsius en 200 omwentelingen per minuut het aantal gistcellen per milliliter cultuur en voeg vijf milliliter gesteriliseerde 20% bouillonoplossing glucose toe aan elk van de twee Erlenmeyers met 45 milliliter geautoclaveerd YP-medium per kolf. Gebruik een steriele transferpipet om vijf keer 10 aan de zevende gistcellen aan elke kolf toe te voegen en laat de gistcellen gedurende ten minste 24 extra uren groeien bij 30 graden Celsius bij 200 omwentelingen per minuut. Voor metabolietextractie, na kweek, verzamelt u de gistcellen door centrifugering en verwijdert u snel het supernatant.

Plaats de buis op droogijs en voeg twee milliliter minus 20 graden Celsius chloroform, een milliliter minus 20 graden Celsius methanol, een milliliter ijskoud nanozuiver water en 200 microliter van 425 tot 600 micron zuur gewassen glasparels toe aan de cellen. Wanneer de kralen zijn toegevoegd, plaatst u de buis bedekt met aluminiumfolie in een schuimbuishouderset met een houder en vortex het monster gedurende 30 minuten op gemiddelde snelheid bij vier graden Celsius om de extractie van metabolieten te vergemakkelijken. Incubeer vervolgens de buis gedurende 15 minuten op ijs voordat u het monster centrifugeert om scheiding van de bovenste waterige fase van het middelste puin en eiwit en lagere organische fasen mogelijk te maken.

Gebruik een micropipette om ongeveer 400 microliter van de bovenste waterige fase over te brengen naar een gewassen en gelabelde buis van 1,5 milliliter met 800 microliter van minus 20 graden Celsius acetonitril. Centrifugeer vervolgens het monster en breng 800 microliter van het bovenste deel van het supernatant over naar een gelabelde massaspectrometrieflacon voor nulgradenopslag tot vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie analyse. Om de geëxtraheerde metabolieten te scheiden, ultrasoon de monsterflacon gedurende 15 minuten, gevolgd door drie vortexen van 10 seconden bij kamertemperatuur.

Plaats na het vortexen de injectieflacon in de putplaat van de vloeistofchromatograaf en stel de kolom in op 45 graden Celsius met een stroomsnelheid van 0,25 milliliter per minuut en de putplaat op nul graden Celsius. Gebruik vervolgens de tabel om de vloeistofchromatografiegradiënten voor de analyse in te stellen. Gebruik na scheiding 10 microliter monstervolumes van de injectie in zowel de elektrospray ionisatie positieve als negatieve modi in een massaspectrometer uitgerust met verwarmde elektrospray ionisatie om de in water oplosbare metabolieten te identificeren en te kwantificeren.

Open aan het einde van de analyse de ruwe gegevens in een geschikt softwareprogramma voor samengestelde analyse en gebruik de massaspectrale fragmentatiebibliotheek om de massaspectra te matchen om de metabolieten die in de analyse zijn geïdentificeerd te annoteren. De exacte massa's van de MS1- en isotooppatronen kunnen ook worden geïdentificeerd om annotatie van de metabolieten mogelijk te maken met behulp van online databases. Gebruik vervolgens de bibliotheek van databases en spectra om te zoeken naar de MS2-spectra van de ruwe gegevens.

De volgende dag, na het doven van de gistcellen, wast u de cellen grondig met 15 milliliter ABC-buffer en verzamelt u de cellen door centrifugering. Resuspend de pellet in een milliliter verse ABC-buffer en voeg 500 microliter van de propidiumjodide-oplossing toe aan de cellen. Vortex het monster drie keer gedurende 10 seconden per vortex en incubeer de cellen gedurende 10 minuten op ijs beschermd tegen licht.

Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugatie en was de cellen drie keer met één milliliter verse ABC-buffer per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, resuspend de pellet in 300 microliter verse ABC-buffer en voeg 10 microliter van de resulterende celsuspensie toe aan een microscoopglaasje. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om differentiële interferentiecontrast- en fluorescentiemicroscopiebeelden van de cellen vast te leggen met de filters ingesteld op een excitatiegolflengte van 593 nanometer en een emissiegolflengte van 636 nanometer.

Gebruik vervolgens een geschikt beeldanalyseprogramma om het totale celaantal cellen in de brightfield- en fluorescentiebeelden te tellen en om de fluorescentie-intensiteit van kleuring voor individuele cellen te bepalen. De gemodificeerde celblusmethode veroorzaakt aanzienlijk minder schade aan het plasmamembraan en de celwand dan de niet-gebufferde 80% methanol bij min 40 graden Celsius blusmethode. Inderdaad, bijna alle cellen die worden geblust met behulp van de gemodificeerde methode vertonen rode fluorescentie-emissie, wat kenmerkend is voor gistcellen waarin het plasmamembraan en de celwand niet zijn beschadigd.

Daarentegen vertoonden bijna alle cellen die werden geblust met behulp van de niet-gebufferde 80% methanol bij 40 graden Celsius-methode groene fluorescentie-emissie, wat kenmerkend is voor gistcellen waarin het plasmamembraan en de celwand aanzienlijk zijn beschadigd. De gemodificeerde celblusmethode veroorzaakt ook een significant lagere lekkage van in water oplosbare metabolieten uit gistcellen dan de niet-gebufferde 80% methanol bij min 40 graden Celsius blusmethode. De retentietijdverschuivingswaarden van in water oplosbare metabolietnormen zijn aanzienlijk lager en de piekvormen zijn aanzienlijk scherper voor de zwitterionische fasekolom in vergelijking met de omgekeerde fasekolom.

Een ander voordeel van de vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie methode is de mogelijkheid om de zwitterionische fase kolom te gebruiken om efficiënt verschillende in water oplosbare metabolieten met diverse structurele, fysische en chemische eigenschappen te scheiden. Zorg ervoor dat je het propidiumjodide in het donker doet en zorg er ook voor dat je de bovenste fase verzamelt terwijl je de middelste fase niet verstoort. Als een MSP niet kan worden geannoteerd vanwege het ontbreken van de MS2-spectrale bibliotheek, gebruik dan een NMR om deze structuur te illustreren.