Name: Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer hoe u een ex vivo weefsel-explantatiemodel met varkenshoornvlies gebruikt om antivirale middelen tegen Herpes Simplex Virus-1 te testen. Deze kosteneffectieve methode biedt een relevant alternatief voor dierproeven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY024710, RO1 AI139768 en RO1 EY029426) aan D.S. A.A. werd ondersteund door een F30EY025981-beurs van het National Eye Institute, NIH. Studie werd uitgevoerd met behulp van de varkens hoornvliezen verkregen van Park Packing bedrijf, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Al het varkensweefsel dat in deze studie werd gebruikt, werd geleverd door een externe particuliere organisatie en geen van de dierbehandeling werd uitgevoerd door personeel van de Universiteit van Illinois in Chicago.
1. Materialen
<ol><li>
Reagentia
	<ol>
<li>Gebruik de volgende reagentia voor plaquetest: poedermethylcellulose, Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), penicilline en streptomycine (P / S) voor plaquetest.</li>
		<li>Gebruik kristalviolettabletten en ethanol (moleculair biologische kwaliteit) voor het bereiden van kristalviolette oplossing voor plaque-assay.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vero cell groeimedia - DMEM hele media
	<ol>
<li>Open de DMEM-mediafles in de tissuekweekkap. Verwijder 55 ml media uit de fles met een serologische pipet en gooi deze weg. Voeg 50 ml FBS P/S toe aan DMEM. Koel bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaque assay media - Voorraad van 5% methylcellulose media
	<ol>
<li>Meet 2,5 g methylcellulosepoeder met een roermagneet in een glazen fles van 500 ml en autoclaaf het. Nadat de fles is afgekoeld tot kamertemperatuur, neemt u 500 ml DMEM hele media met 50 ml FBS en 5 ml P / S en voegt u deze toe aan een glazen fles met methylcellulose.</li>
		<li>Roer dit bij 4 °C gedurende 2 dagen met behulp van een magneetroerder. Koel bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mediavoorbereiding voor weggesneden varkenshoornvlies
	<ol>
<li>Open een mem-fles (minimum essential media) in de weefselkweekkap. Gooi 10 ml MEM uit de fles met behulp van een serologische pipet.</li>
		<li>Voeg 5 ml insuline-transferrine-selenium (ITS) en 5 ml antimycotisch-antibioticum (AA) toe aan de media en koel bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Meester- en werkvoorraad kristalviolet:
	<ol>
<li>Om de kristalviolette stamoplossing te maken, voegt u 1 g kristalvioletpoeder toe aan 100 ml 20% ethanol in water. Deze voorraad (1% w/v kristalviolet) kan tot een jaar worden bewaard en gebruikt wanneer deze op een donkere plaats wordt bewaard.</li>
		<li>Om hier een werkvoorraad van te maken, voegt u 50 ml originele voorraadoplossing toe aan 350 ml water. Voeg 100 ml ethanol toe aan deze oplossing om een 500 ml werkende kristalvioletoplossing (0,1% m/v kristalviolet) te maken. OPMERKING: Beide oplossingen moeten in het donker worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Werkwijze
<ol><li>Isolatie van varkenshoornvliezen van hele ogen17
	<ol>
<li>Na ontvangst van de varkensogen van een geschikte verkoper, bewaar op ijs als er een vertraging is met weefselverwerking zoals afgebeeld in figuur 1.</li>
		<li>Zorg ervoor dat persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt en gedragen tijdens deze procedure om besmetting en ongevallen door morsen van glasachtig humor te voorkomen.</li>
		<li>Spuit het werkgebied met 70% ethanol om te reinigen en te desinfecteren. Om ervoor te zorgen dat de werkruimte stabiel is, spreidt u een bankafdekking uit en plakt u de zijkanten stevig af zoals afgebeeld in figuur 2.</li>
		<li>Plaats varkensogen op gaas (figuur 3). Houd met behulp van 50 mm gaas het achterste gedeelte (figuur 4A) van de varkensogen vast, zoals weergegeven in figuur 4B, met één hand.</li>
		<li>Maak met een naald van 30 G voorzichtig een enkele prik in ongeveer het midden van het epitheeloppervlak van het oog en zorg ervoor dat er geen schade aan stroma is(figuur 5). De prik moet worden beperkt tot het epitheel (~ 100-200 μm) om stromale betrokkenheid te voorkomen.</li>
		<li>Maak met behulp van een scherp gesteriliseerd mes een kleine incisie op de sclera op 1 mm afstand van het hoornvlies. Snijd de rand van het hoornvlies af om ervoor te zorgen dat de glasvochthumor niet lekt met behulp van een snelle en soepele roterende actie van de hand(figuur 6A). Door het hoornvlies aan de rand van het hoornvlies-sclera met een plat pincet vast te houden, snijdt u de resterende tethering membranen van het oog af met behulp van het mes (Figuur 6B).</li>
		<li>Neem het hoornvlies en plaats het in een 12-well plaat bedekt met 2 ml hoornvlies medium. Het hoornvlies moet naar boven worden geplaatst, aangetoond in een reeks stappen in figuren 7A-D, figuur 8).</li>
		<li>Voeg 5 μL van de virusoplossing met 5 x 105 plaquevormende eenheden (PFU) van 17 GFP toe aan de gedebrideerde plaats op het hoornvliesoppervlak. Plaats de 12-well plaat met geïnfecteerde varkenshoornvliezen gedurende72 uur in een incubator met 5% CO 2.</li>
		<li>Spray eventuele extra ogen die niet in het experiment zijn gebruikt met 10% bleekmiddel en veilig weggegooid in biohazard-zakken.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualisatie OPMERKING: Het virus moet elke dag worden gevisualiseerd voorafgaand aan de toevoeging van geneesmiddelen.<ol>
<li>Schakel de stereomicroscoop en LED-lichtbron in en laat de lamp van de machine opwarmen voordat u de hoornvliezen in beeld brengen. Draag de plaat met hoornvliezen voorzichtig naar het instrument zonder de oplossing te verstoren. Vervang het filter zodat GFP (380-460 nm) wordt gebruikt om naar monsters te kijken. Stel de belichtingstijd in op 500 ms om beelden vast te leggen.</li>
		<li>Plaats eerst de hoornvliesplaat onder de stereoscoop en leg de beelden vast met de laagste vergroting van 7,5x. Volg dit op met een reeks toenemende vergrotingsbeelden (bijv. 15x, 25x, 35x) zodat alle virale verspreiding en dendrietvorming duidelijk wordt gevisualiseerd</li>
		<li>Zorg ervoor dat u de geïnfecteerde hoornvliezen terugbrengt naar de weefselkweekincubator en sla alle foto's op die zijn gemaakt.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering van virusinfecties OPMERKING: Virustiters van varkenshoornvliezen moeten elke dag worden geëvalueerd om het effect van medicamenteuze behandeling te analyseren.<ol>
<li>Om het virus te kwantificeren, zaad Vero-cellen met een dichtheid van 5 x10 5 cellen per put als een 6-well plaat wordt gebruikt, zoals in dit experiment is gedaan. Doe dit een dag voor de infectie. Incubeer de vergulde cellen 's nachts om ervoor te zorgen dat ze samenvloeien voor viruskwantificering.</li>
		<li>Aliquot 500 μL serumvrije media in meerdere microcentrifugebuizen. Plaats steriel wattenstaafje gedompeld in de met serumvrije media gevulde buisjes. De wattenstaafjes moeten minstens 5 minuten voor gebruik worden gedoopt en bevochtigd.</li>
		<li>Zonder de onderliggende media te verstoren, transporteert u de geïnfecteerde hoornvliesplaat van varkens naar een bioveiligheidskast. Maak met behulp van de natte wattenstaafjes 3 omwentelingen met de klok mee en 3 omwentelingen tegen de klok in bij een diameter van 5 mm vanaf het midden van het geïnfecteerde varkenshoornvlies zonder overmatige druk uit te oefenen.</li>
		<li>Steek het wattenstaafje terug in de met serumvrije media gevulde microcentrifugebuis en draai het 5 keer met de klok mee en tegen de klok in. De metalen punt van het wattenstaafje moet worden ingekort zodat het volledig in de microcentrifugebuis past en het deksel kan worden gesloten.</li>
		<li>Plaats de microcentrifugebuis met het afgeveegde watje op een vortexmachine en vortex op hoge snelheid gedurende 1 min.</li>
		<li>Voer viruskwantificering uit via een plaquetest op deze monsters. OPMERKING: Deze kwantificeringsstap moet worden uitgevoerd op dag 2, 4 en optioneel op 6 dagen na infectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Viruskwantificering door Plaque-assay OPMERKING: Om een plaque-assay uit te voeren, groeien en platen Vero-cellen in een 6-putplaat en zorgen voor 90% confluentie van cellen vóór het begin van de test. Gebruik een kolf van 75 cm2 van deze cellen. Alle onderstaande stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.<ol>
<li>Was de samenvloeiende monolaag van Vero-cellen in de kolf met 10 ml verse fosfaatbufferzilte (PBS) na het aanzuigen van het kweekmedium. Herhaal de wasstap nogmaals met PBS na het aanzuigen van de eerste set wasoplossing.</li>
		<li>Voeg 1 ml 0,05% trypsine toe aan de celmonolaag. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende 5 min. Zorg er met het blote oog voor dat de cellen loskomen van het binnenoppervlak van de kolf. Zo niet, wacht dan nog eens 5 minuten voordat u de kolf opnieuw onderzoekt. Wanneer cellen lijken te zijn losgemaakt, voegt u 9 ml hele media toe aan de monolaag om ervoor te zorgen dat de cellen zich volledig losmaken van het kolfoppervlak.</li>
		<li>Verzamel alle cellen uit de kolf samen met het hele medium en plaats ze in een centrifugebuis van 15 ml.</li>
		<li>Gebruik voor elke put van de 6 putplaten die worden gebruikt voor plaque-assay 300 μL uit de centrifugebuis. Top elke put van de 6 putplaat bij met 2 ml hele media. Laat de platen een nacht in de incubator om ze te laten groeien en een confluente monolaag te vormen in elke put.</li>
		<li>Om een plaquetest uit te voeren, moet een seriële verdunning van monsters worden uitgevoerd voordat het virus wordt gekwantificeerd.</li>
		<li>Voer een log101-voudige verdunning van het virus uit in microcentrifugebuizen met behulp van serumvrije media totdat een verdunning van 10-8 is bereikt. Wanneer bij een verdunning van 10-3 1 ml van de verdunning wordt overgedragen aan de monolaag van vergulde cellen na het opzuigen van de groeimedia op de cellen van de 6-putplaat, zal dit de infectiestap zijn. Incubeer de geïnfecteerde plaat bij 37 °C incubator gedurende 2 uur.</li>
		<li>Aspirateer de bestaande infectiemedia, was tweemaal voorzichtig met PBS om cellen te coaten en voeg 2 ml met methylcellulose beladen media per put toe aan alle 6 putten. Incubeer gedurende 72 uur of totdat de vorming van plaques kan worden gezien. Plaques kunnen worden geïdentificeerd door de vorming van kleine openingen tussen cellen in de celmonolaag.</li>
		<li>Voeg langzaam 1 ml methanol toe aan de hoek van elke put en gebruik de muur als geleidingspunt. Incubeer de 6 well plaat op kamertemperatuur gedurende 15 min. Adem langzaam de inhoud van elke put uit de plaat zonder de celmonolaag te verstoren of te roeren.</li>
		<li>Voeg 1 ml kristalviolet werkoplossing toe aan elke put van 6 putplaat, zodat alle cellen bedekt zijn. Incubeer de 6 well plaat in het donker gedurende 30 min. Gooi de kristalviolette oplossing weg door deze op te zuigen en droog de putjes op een vel absorberend papier.</li>
		<li>Tel het aantal plaques bij de hoogste verdunning goed om het totale virusgehalte in de startoplossing te kwantificeren. Herhaal het proces twee keer om de virale titer te bevestigen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
<li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li>
<li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Adaptation+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li>
<li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li>
<li>Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis%3A+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li>
<li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+infection+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li>
<li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li>
<li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li>
<li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li>
<li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22CEN+Case+Report%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li>
<li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+nephrotoxicity%3A+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention%2C+detection%2C+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li>
<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling en geen concurrerende financiële belangen.

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat BX795 een veelbelovende rol speelt als antiviraal middel tegen HSV-1-infectie; door het TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16te remmen . Zowel TBK1 als autofagie hebben een rol gespeeld bij het helpen remmen van HSV-1-infectie, zoals aangetoond op menselijke cornea-epitheelcellen. BX795 bleek maximaal effectief te zijn met antivirale activiteit bij een concentratie van 10μM en met behulp van zowel western blot-analyse als virale plaque-analyse van belangrijke virale...

Mensen die lijden aan ooginfecties lopen vaak verlies van hetgezichtsvermogen op 1. Met een hoge seroprevalentie wereldwijd lijden HSV-geïnfecteerde personen aan terugkerende ooginfecties die leiden tot cornealittekens, stromale keratitis en neovascularisatie2,3,4,5. HSV-infecties hebben ook aangetoond dat ze minder vaak een reeks ernstige aandoeningen veroorzaken bij immuungecompromitteerde, onbehandelde patiënten zoals encefalitis en systemische morbiditeit6,7,8. Geneesmiddelen zoals Acyclovir (ACV) en zijn nucleoside-analogen hebben consistent succes getoond bij het beteugelen van HSV-1-infectie en zelfs controlereactivering, maar het langdurige gebruik van deze geneesmiddelen is geassocieerd met nierfalen, foetale afwijkingen en het niet beperken van de opkomst van geneesmiddelresistentie tegen evoluerende virale stammen9,10,11,12,13. Complexiteiten geassocieerd met HSV-1 oculaire infecties, zijn eerder in vitro bestudeerd met behulp van monolagen en 3D-culturen van menselijke hoornvliescellen en in vivo met behulp van muizen- of konijnenoculaire infecties. Hoewel deze in vitro modellen significante gegevens opleveren over de cellulaire biologische componenten van HSV-1-infecties, slagen ze er echter niet in om de ingewikkelde complexiteit van hoornvliesweefsel na te bootsen en doen ze weinig om de dendritische verspreiding van het virus te verlichten14. Hoewel in vivo systemen daarentegen inzichtelijker zijn in het aantonen van infectieverspreiding in hoornvliezen en immuunactivatieresponsen tijdens HSV-1-infectie, komen ze met het voorbehoud dat ze getrainde onderzoekers en grote faciliteiten voor dierenverzorging nodig hebben om de experimenten over het hoofd te zien.
Hier gebruiken we varkenshoornvliezen als een ex vivo model om het door HSV-1-infectie geïnduceerde wondsysteem te onderzoeken. Zowel de potentiële farmacologie van bepaalde geneesmiddelen als de cel- en moleculaire biologie van het wondsysteem veroorzaakt door de infectie kunnen worden bestudeerd door middel van weefselexplantatieculturen. Dit model kan ook worden aangepast voor het gebruik voor andere virale en bacteriële infecties. In deze studie werden varkenshoornvliezen gebruikt om de antivirale werkzaamheid van een preklinisch klein molecuul, BX795, te testen. Het gebruik van varkenshoornvliezen had de voorkeur vanwege de gemakkelijke toegang en de kosteneffectiviteit. Bovendien zijn varkens corneamodellen goede modellen van menselijke ogen, waarbij de hoornvliezen gemakkelijk te isoleren zijn, voldoende groot zijn voor infectie en visualisatie en robuust zijn om15te verwerken . Varkenshoornvliezen zijn ook vergelijkbaar met de complexiteit van menselijke hoornvliesmodellen in zowel trans corneapermeabiliteit als systemische absorptie15. Door dit model voor de studie te gebruiken, konden we ophelderen hoe BX795 het waard is om verder te worden onderzocht als een competente remmer van HSV-1-virusinfectie en voegt het toe aan de literatuur van het classificeren als een potentiële antivirale verbinding met klein molecuul16.

<table><tbody><tr><td>30 G hypodermische naalden.</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>500 mL glazen fles.</td><td>Thomas Scientific</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>Antimycotisch en Antibioticum (AA)</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>Als portie in 5 mL buizen en ingevroren tot gebruik</td></tr><tr><td>Benchtop vortexer.</td><td>BioDot</td><td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Bioveiligheidskast met een Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certificering.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6" Steriele Calcium Alginate Standaard Swabs.</td><td>Puritan</td><td>22029501</td><td></td></tr><tr><td>Celkrabber - 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Kristal violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>Bewaar het poeder op een donkere plaats</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Als portie in 50 mL buizen en ingevroren tot gebruik</td></tr><tr><td>Vlakke pincet - 2.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Vriezers --80 &deg;C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>Verse doos met messen.</td><td>Thomas Scientific</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Johnson &amp; Johnson</td><td></td><td>108 vierkante inch folder 12 lagen</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>in huis gekweekt</td><td>-</td><td>Originele stam van Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expresserende HSV-1 stam 17</td></tr><tr><td>Insulin, Transferrin, Selenium - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>Als portie in 5 mL buizen en ingevroren tot gebruik</td></tr><tr><td>Magnetische roerder.</td><td>Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>Metaalschaar.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetten 1 tot 1000 &micro;L.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essentieel Medium - MEM</td><td>GIBCO</td><td>11095080</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985047</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine.</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>Als portie in 5 mL buizen en ingevroren tot gebruik</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>Bewaar op kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Varkenshoornvliezen</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>Speciale bestelling op verzoek</td></tr><tr><td>Procedure bench covers - naar behoefte.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten</td><td>Thomas Scientific</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>Serologisch pipetteerapparatuur.</td><td>Thomas Scientific</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>Roermagneet.</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekkolven, T175 cm2.</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekincubators die 5% CO2 en 37 &deg;C temperatuur kunnen handhaven.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekbehandelde platen (6-well).</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%), fenol rood</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Als portie in 10 mL buizen en ingevroren tot gebruik</td></tr><tr><td>Vero cellen</td><td>American Type Culture Collection ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

porcine corneal tissue explant om de werkzaamheid van herpes simplex virus-1 antivirale middelen te bestuderen

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Virussen en bacteriën kunnen een verscheidenheid aan oculaire oppervlaktedefecten en degeneratie veroorzaken, zoals wonden en zweren door hoornvliesinfectie. Met een seroprevalentie die wereldwijd varieert van 60-90%, veroorzaakt het Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) vaak mucocutane laesies van het orofaciale gebied die zich ook manifesteren als laesies en infectiegerelateerde blindheid. Hoewel de huidige antivirale geneesmiddelen effectief zijn, vereist het ontstaan van resistentie en persistentie van toxische bijwerkingen de ontwikkeling van nieuwe antivirale middelen tegen deze alomtegenwoordige ziekteverwekker. Hoewel in vitro beoordeling enkele functionele gegevens oplevert met betrekking tot een opkomend antiviraal middel, tonen ze de complexiteit van oculair weefsel in vivo niet aan. In vivo studies zijn echter duur en vereisen getraind personeel, vooral bij het werken met virale agentia. Vandaar dat ex vivo modellen efficiënte maar goedkope stappen zijn voor antivirale testen. Hier bespreken we een protocol om infectie door HSV-1 te bestuderen met behulp van varkenshoornvliezen ex vivo en een methode om ze topisch te behandelen met behulp van bestaande en nieuwe antivirale geneesmiddelen. We demonstreren ook de methode om een plaque-assay uit te voeren met behulp van HSV-1. De gedetailleerde methoden kunnen worden gebruikt om vergelijkbare experimenten uit te voeren om infecties te bestuderen die lijken op de HSV-1-ziekteverwekker.

Om de werkzaamheid van de experimentele antivirale middelen te begrijpen, moeten ze uitgebreid worden getest voordat ze worden verzonden voor in vivo klinische onderzoeken bij mensen. In dit verband moeten positieve controle-, negatieve controle- en testgroepen worden geïdentificeerd. Trifluorothymidine (TFT) wordt al lang gebruikt als de voorkeursbehandeling om herpes keratitis topisch te behandelen16. Gebruikt als een positieve controle, vertonen de tft behandelde hoornvliesgroepen een lagere in...

We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.

Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Het begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in diermodellen is kosten- en arbeidsintensief. Ons protocol dat een ex vivo weefselexplantatiemodel gebruikt, is aanzienlijk lager, zowel in termen van kosten als wetenschappelijk personeel dat nodig is om het onderzoek uit te voeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van varkensogen, die anatomie en fysiologie hebben die erg lijken op menselijke ogen in tegenstelling tot sommige andere kleine diermodellen.Wanneer we geneesmiddelen in vitro testen, kunnen ze werkzaamheid vertonen die mogelijk afwezig is in dier- of menselijke modellen. Ex vivo weefselsystemen zijn de beste manier om te begrijpen of onze in vitro systemen al dan niet kunnen worden vertaald in dier- en mensproeven. Het varkenshoornvliessysteem, hoewel minder arbeidsintensief, vereist trainbare vaardigheden om de medicijnen te isoleren, te onderhouden, te infecteren en te behandelen, vooral het proces van isolatie van het hoornvlies van het hele varkensoog is lastig uit te drukken in woorden, maar vereist visuele demonstratie.Na ontvangst van varkensogen van een geschikte verkoper, bewaar de weefsels op ijs tot de verwerking en trek de jui

porcine-corneal-tissue-explant-to-study-efficacy-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video artikel beschrijven we het gebruik van een...

Ex Vivo Organotypische Corneal model van acute Epitheliale Herpes Simplex Virus Type I infectie

De meeste studies van de herpes ziekte van het hoornvlies gebruik maken van een primaire infectie model. Echter, primaire infectie met HSV-1 gewoonlijk niet tot menselijke ziekte. Hier beschrijven we een terugkerende herpes model van ziekte van het hoornvlies, die beter nabootst menselijke ziekte.

Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK

This video describes a protocol to set up an ex vivo model for bacterial keratitis using a corneoscleral button dissected from the porcine eye. Inoculated bacteria traverse the corneal epithelial incisions to invade the underlying stroma and establish an infection within the corneal tissues that mimic the in vivo infection.

Porcine Ex vivo Cornea Model of Bacterial Keratitis: A Technique to Establish Bacterial Infection in Corneal Epithelial Cells

This video demonstrates a non-invasive laser-assisted procedure to selectively damage the corneal endothelial cells in the porcine eye. The developed ex vivo model of endothelial cell damage can be used to study diseases of the corneal endothelium.

Laser-assisted Selective Ablation of Porcine Corneal Endothelial Cells: A Technique to Induce Focused Porcine Corneal Endothelial Injury for Ex Vivo Studies

This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

De huid is een doelwitweefsel van het humane pathogeen herpes simplex-virus type 1 (HSV-1). Om de invasieroute van HSV-1 in weefsel te onderzoeken, hebben we een ex vivo infectiemodel opgezet van muis-epidermale vellen die de buitenste laag van de huid vertegenwoordigen.

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol om een ex vivo varkensmodel van bacteriële keratitis op te zetten. Pseudomonas aeruginosa wordt gebruikt als een prototypisch organisme. Dit innovatieve model bootst in vivo infectie na omdat bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de bacterie om hoornvliesweefsel te beschadigen.

Het opzetten van een Porcine Ex Vivo Cornea Model voor het bestuderen van medicamenteuze behandelingen tegen bacteriële keratitis

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Leer hoe u een ex vivo weefsel-explantatiemodel met varkenshoornvlies gebruikt om antivirale middelen tegen Herpes Simplex Virus-1 te testen. Deze kosteneffectieve methode biedt een relevant alternatief voor dierproeven.

Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen

Meer video's verkennen