Name: In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer een snelle in vitro beeldvormingstest voor kwantitatieve analyse van fagocytose door iPSC-microglia met behulp van gelabelde SH-SY5Y-cellen. Deze methode ondersteunt high-content screening voor neurodegeneratief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Val Millar en Dr. Sohaib Nizami voor hun hulp bij microscopie met een hoog gehalte, en Dr. Daniel Ebner voor toegang tot de microscopen met een hoog gehalte. Verder bedanken de auteurs Dr. Emma Mead voor het advies over de ontwikkeling van testen en mevrouw Cathy Browne voor iPSC-ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, subsidiereferentie ARUK-2020DDI-OX), met aanvullende ondersteuning voor de James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) van de Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award van Parkinson's UK (J-1403); het MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 en Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748(2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li>
<li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+in+the+brain%3A+Homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790(2019).</li>
<li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li>
<li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li>
<li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380(2020).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136(2020).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684(2019).</li>
<li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li>
<li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li>
<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li>
<li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+robust+Z%27+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).</li>
<li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+%CE%B1-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson%27s+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li>
<li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia%2Fbrain+macrophages+in+vitro%3A+Involvement+of+lectin-%2C+integrin-%2C+and+phosphatidylserine-mediated+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li>
<li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li>
<li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49(2018).</li>
<li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li>
<li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia hebben belangrijke functies die de initiatie en progressie van neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden, waaronder fagocytose van apoptotische neuronen. Verminderde microgliale fagocytose en ongepaste fagocytose van synapsen zijn beide in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten, hoewel de onderliggende mechanismen en causaliteit niet goed worden begrepen4,23. Dit artikel schetst een fagocytose-assay om fagocytose van apoptotische cellen te meten door iPSC-macrofagen, met ofwel een live-cell time-lapse imaging-uitlezing of fixed-cell high-content microscopie, of een combinatie van beide op een enkele assay. Deze veelzijdigheid betekent dat de test kan worden gebruikt om individuele fagocytische gebeurtenissen in de loop van de tijd in een paar putten te bestuderen of kan worden gebruikt voor screening met een hoog gehalte aan meerdere aandoeningen of behandelingen. Omdat de test met een hoog gehalte op één tijdstip is gefixeerd, kunnen meerdere testplaten tegelijkertijd worden bereid. De test met een hoog gehalte heeft potentieel nut voor het karakteriseren van macrofagen / microglia met ziekte-geassocieerde genetische varianten of het screenen van kleine molecuulremmers op veranderingen in fagocytose. De test kan ook gemakkelijk worden aangepast om fagocytose van andere microgliamodellen of mogelijk astrocyten te bestuderen. De fagocytosetest kan mogelijk worden gemultixt met levendcellige beeldvormingsvlekken, bijvoorbeeld mitochondriën, calcium of ROS-indicatoren, en post-fixatie immunofluorescente kleuring voor eiwitten-van-belang kan worden uitgevoerd. In vergelijking met bestaande fagocytose-assays die apoptotische neuronale cellen gebruiken, zijn de belangrijkste voordelen die dit protocol biedt dat de bereiding van de fagocytische lading relatief eenvoudig en snel is en resulteert in een uniform product. Andere assays induceren apoptose van neuronen of SH-SY5Ys met S-nitroso-L-cysteïne gedurende 2 h25,okadaïnezuur gedurende 3 h22,staurosporine voor 4-16 h26,27,28,29 of UV-bestraling gedurende 24 h30,en kunnen resulteren in cellen in verschillende stadia van apoptose. Bovendien zijn de live-cell imaging en high-content imaging readouts niet eerder beschreven, voor zover de auteurs weten. De belangrijkste beperking van het gebruik van paraformaldehyde-fixatie om de fagocytische lading te bereiden, is dat het het proces van apoptose niet volledig samenvat, omdat fixatie voorkomt dat de cellen zich splitsen in apoptotische lichamen, die waarschijnlijk sneller worden gefagocytoseerd vanwege hun kleinere omvang. Het is niet bekend welk effect fixatie heeft op de secretie van nucleotide "vind me" -signalen (bijv. ATP, UDP) van de doelcel die fagocyten aantrekken. Net als bij apoptotische cellen vertonen de vaste SH-SY5Ys enige membraandoorlaatbaarheid voor propidiumjodide. Membraandoorlaatbaarheid wordt geassocieerd met het vrijkomen van "vind mij" -signalen; dit is echter niet onderzocht in de vaste SH-SY5Ys, en als het nucleotide te snel vrijkomt, zouden ze worden weggespoeld voordat SH-SY5Ys worden toegevoegd aan de iPSC-macrofagen.
De eerste kritische stap in het protocol is het kleuren van dode SH-SY5Y's met een STP-ester van een pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof. Deze kleurstof reageert snel en covalent met vrije primaire amines op het oppervlak van de dode SH-SY5Ys. De duur van de kleuring hoeft niet te worden geoptimaliseerd; er moet echter voorzichtig worden omgegaan met het hanteren van de kleurstof voordat deze wordt gelabeld. De etiketteringsreactie mag niet worden uitgevoerd in buffers die vrije amines bevatten. Bovendien bestaat er een risico op neerslag als de DMSO-voorraad wordt verdund in een koude waterige buffer of bij een hoge eindconcentratie. Precipitaten verschijnen als dichte donkere objecten onder de microscoop. Bovendien kleeft de pH-gevoelige kleurstofoplossing aan gewone plastic centrifugebuizen en spoelt langzaam af; daarom worden laagbindende buizen aanbevolen voor de etiketteringsstap. Het gebruik van een pH-gevoelige kleurstof, in plaats van een permanent fluorescerende kleurstof, helpt bij de identificatie van overspoelde deeltjes, versus deeltjes die het plasmamembraan omsluiten. Aangezien er enige fluorescentie is bij neutrale pH, moet de dichtheid van fagocytische lading en iPSC-macrofagen laag genoeg worden gehouden voor nauwkeurige segmentatie, hoewel hoog genoeg om talrijke fagocytische gebeurtenissen te vangen. Microscopie met een hoog gehalte was in staat om fagocytose met een gemiddelde dichtheid van lading in de put nauwkeurig te identificeren (meer dan 2 SH-SY5Ys per iPSC-macrofaag). Omgekeerd, vanwege de zwakkere gevoeligheid van de microscoop in het dieprode spectrum, was segmentatie van iPSC-macrofagen in de live-cell time-lapse beeldvormingsgegevens minder zeker en was het noodzakelijk om een zeer lage dichtheid van lading te gebruiken om de kans op valse positieven te verminderen (1 SH-SY5Y voor elke twee iPSC-macrofagen). Validatie van de juiste segmentatie en ladingsdichtheid moet worden uitgevoerd met vergelijkingen tussen onbehandelde en cytochalasine D-behandelde putten. In een goed geoptimaliseerde test zou cytochalasine D het gemiddelde aantal vlekken per cel met 90% moeten verminderen ten opzichte van onbehandelde monsters.
Een andere cruciale stap in het protocol is de iPSC-macrofaagkleuring, waarmee de cel kan worden geïdentificeerd en gesegmenteerd in beeldanalyse, zodat externe SH-SY5Ys worden uitgesloten van de telling. De aanbevolen kleurstof is celpermeant, omgezet in een onoplosbaar fluorescerend product in het cytoplasma, fixeerbaar en niet-toxisch (zie Tabel met materialen). De kleuringsstap werd geoptimaliseerd voor het gebruik van iPSC-macrofagen met de high-content imaging fagocytose-test, en we stellen voor dat deze opnieuw moet worden geoptimaliseerd als andere celtypen worden gebruikt. De duur van celkleuring kan worden verhoogd om de afzetting van het onoplosbare fluorescerende product in cellen te verbeteren. Als de kleurstofconcentratie is geoptimaliseerd, moet ervoor worden gezorgd dat toxische niveaus van het organische oplosmiddel worden vermeden.
De derde kritische factor voor het succes van de assay is de data-analyse. De verstrekte analysepijplijnen zijn bedoeld als leidraad in plaats van prescriptief, omdat verschillen in kleuringsintensiteit of celmorfologie de effectiviteit van segmentatie van de pijpleidingen zoals geschreven kunnen verminderen. Er zullen daarom enkele optimalisaties nodig zijn, waarbij de pijplijn wordt getest op de juiste positieve en negatieve controles, en de parameters die moeten worden geoptimaliseerd, worden aangegeven in de protocoltekst. Negatieve controles moeten een aandoening omvatten waarbij iPSC-macrofagen worden voorbehandeld met een krachtige fagocytoseremmer zoals cytochalasine D vóór toevoeging van SH-SY5Ys. Een andere mogelijke negatieve controle is de toevoeging van de SH-SY5Ys aan eerder onbehandelde putten van iPSC-macrofagen aan het einde van de test, 10 minuten voor de fixatie, waardoor enige bezinking van de lading mogelijk is, maar te kort is voor een merkbare hoeveelheid fagocytose. Een fagocytosegebeurtenis wordt gedefinieerd als een rood-fluorescerend object binnen de grenzen van een iPSC-macrofaag, gedefinieerd door het softwarealgoritme met behulp van het dieprode fluorescentiekanaal. Als de segmentatie van de cellen slecht is(figuur 2),kunnen veel niet-gefagocyteerde SH-SY5Y's in de nabijheid van iPSC-macrofagen ten onrechte in de analyse worden opgenomen, d.w.z. vals-positieven. De belangrijkste factor bij het bereiken van een goede segmentatie is een strikte afbakening van de iPSC-macrofagen. Segmentatie voor beide analyses is geautomatiseerd, dus het is niet mogelijk om perfecte segmentatie voor elke cel te verkrijgen; er kunnen echter enkele parameters worden aangepast om de segmentatie optimaler te maken, met behulp van enkele testafbeeldingen als referentie. De cytochalasine D-controle is belangrijk voor het beoordelen van optimale segmentatie omdat een groot aantal fagocytische gebeurtenissen die in deze aandoening worden gedetecteerd, aangeeft dat de segmentatie suboptimaal is. Optimalisatie van de data-analysepijplijn moet idealiter worden herhaald totdat het aantal fagocytische gebeurtenissen per cel 80% -90% lager is in de cytochalasine D-conditie versus geen remmer.
De problemen met de fagocytosetest die het meest waarschijnlijk optreden zijn: (1) zwakke pH-gevoelige fluorescentie in positieve controles, (2) schaarse of ongelijke verdeling van macrofagen aan het einde van de test, of (3) hoge aantallen vals-positieven in de analyse van niet-fagocytosed SH-SY5Ys. Het oplossen van problemen met zwakke pH-gevoelige fluorescentie moet eerst controleren of kleuring van de SH-SY5Ys resulteerde in een celkorrel met een sterke magentakleur. Als de kleur zwak is, zorg er dan voor dat een verse kleurstofvoorraad wordt gebruikt, zorg ervoor dat de etiketteringsbuffer aminevrij is, voeg een extra was toe aan de SH-SY5Ys voor het kleuren, controleer of het juiste aantal SH-SY5Ys is gekleurd, zorg ervoor dat er geen kleurstofprecipitaten zichtbaar zijn en optimaliseer de etiketteringsconcentratie van de kleurstof. Als de SH-SY5Ys sterk gekleurd zijn, controleer dan of de concentratie die aan de testplaat is toegevoegd correct is en zorg ervoor dat de iPSC-macrofagen gezond en niet te oud zijn. Het tweede type probleem, ongelijke macrofaagverdeling, kan het gevolg zijn van verlies van cellen tijdens het pipetteren en er moeten stappen worden ondernomen om de pipetteerkrachten die door de cellen worden ervaren te verminderen, waarbij smalle boringspunten worden vermeden. Als het probleem zich blijft, verminder dan de incubatietijd van het laden van de iPSC-macrofagen met celpermeante kleurstof. Het derde probleem, met betrekking tot het foutief opnemen van niet-fagocytosed deeltjes in de analyse, geeft aan dat meer optimalisatie van de analysepijplijn nodig is. Probleemoplossing moet zich in de eerste plaats richten op celsegmentatie en of de software aangrenzende objecten opneemt. Specifieke parameters die kunnen worden aangepast, worden voorgesteld in de opmerkingen onder de relevante stappen (stappen 6.1.11-6.1.15 voor de live-cell time-lapse-analyse en stappen 6.2.4-6.2.8 voor de analyse met een hoog gehalte). Als de celsegmentatie niet verder kan worden verbeterd, heeft de analyse met een hoog gehalte een extra stap (stap 6.2.8) die onjuist gesegmenteerde iPSC-macrofagen uitsluit. Bovendien kan de module die geaccepteerde vlekken van pH-gevoelige fluorescentie binnen iPSC-macrofagen filtert, worden geoptimaliseerd, waardoor de drempelintensiteit van geaccepteerde objecten wordt verhoogd, wat zou moeten helpen om niet-fagocytosed SH-SY5Ys uit te sluiten (stap 6.1.17 voor de live-cell time-lapse-analyse en stap 6.2.11 voor de high-content analyse).
We ontwikkelden twee soorten microscopie-uitlezing voor de fagocytose-test die elk voordelen en beperkingen hebben. Live-cell time-lapse beeldvorming heeft de voordelen van het verstrekken van extra informatie over fagocytosekinetiek en is breder beschikbaar dan high-content beeldvormingsplatforms. De aanbevolen open-source software is agnostisch voor de microscoopbron en kan worden gebruikt met elke fluorescerende microscoop van goede kwaliteit, met of zonder live-cell time-lapse-mogelijkheid. De belangrijkste beperking van de live-cell imaging is beperkte gevoeligheid en optica, die het uitdagender maken om goede segmentatie van iPSC-macrofagen te detecteren en uit te voeren. Deze beperking kan worden verzacht door de duur van iPSC-macrofaagkleuring te verhogen of door over te schakelen naar een gevoeligere microscoop, indien beschikbaar. De high-content imaging fagocytose assay is de aanbevolen uitlezing als er een high-content imaging systeem beschikbaar is. Beeldvormingssystemen met een hoog gehalte maken een hogere doorvoer en betrouwbaardere gegevens mogelijk, waardoor deze test kan worden gebruikt voor screening, waarbij een robuuste Z ' van ≥ 0,7 zou worden verwacht voor het "aantal vlekken per cel" output20. In vergelijking met de live-cell time-lapse-methode heeft de high-content microscopie-uitlezing een hogere gevoeligheid, een hogere mate van automatisering en snelheid, kunnen meer putten en beeldvormende velden worden verwerkt en worden confocale beelden met een hoge resolutie geproduceerd. Celsegmentatie is effectiever met goede beelden en segmentatie wordt bovendien geholpen door de software voor beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte die meer celsegmentatiemethoden biedt die geschikt zijn voor zeer onregelmatig gevormde cellen. De high-content imaging analyse software berekende ook meer parameters van fagocytose, vergeleken met de open-source software, zoals het percentage fagocytische cellen. De belangrijkste beperking van de fagocytosetest met een hoog gehalte is er een van kosten en toegankelijkheid van het beeldvormingssysteem en de analysesoftware.
Kortom, de kwantitatieve fagocytose-assay die in dit artikel wordt gepresenteerd, is een nuttig hulpmiddel voor het modelleren van microglia fagocytose van dode neuronen in vitro. De microglia worden gemodelleerd door iPSC-macrofagen en de dode neuronen worden gemodelleerd door paraformaldehyde-gefixeerde SH-SY5Ys. Hoewel niet de meest authentieke microglia en dode / apoptotische neuronmodellen gepubliceerd, zijn deze gemakkelijk te bereiden en schaalbaar. De test zelf is zeer veelzijdig, met twee soorten beelduitlezing gedetailleerd, en het heeft potentieel om te worden aangepast voor gebruik met verschillende microglia / macrofaag monocultuurmodellen, of een ander celtype om als de fagocytische lading te fungeren. De high-content imaging-uitlezing is voordelig voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens en kan worden opgeschaald om kleine molecuulmodulatoren van fagocytose te testen, of genetische varianten in de iPSC-macrofagen te screenen. Omdat beeldvormingssystemen met een hoog gehalte echter duur en gegevensrijk zijn, is een alternatieve beelduitlezing in het protocol opgenomen met behulp van een live-cell time-lapse-microscoop, die indien nodig kan worden vervangen door een conventionele fluorescentiemicroscoop van goede kwaliteit.

Microglia zijn macrofagen die in hersenweefsel wonen en hun functies omvatten immuunsurveillance, het coördineren van ontstekingsreacties op letsel / infectie, synaptische remodellering en fagocytose van dode cellen, myeline, eiwitaggregaten en pathogenen. Fagocytose is het proces waarbij microglia lading herkennen met oppervlaktereceptoren en hun cytoskelet reorganiseren om het object te verzwelgen tot een fagosoom, dat vervolgens fuseert met lysosomen voor degradatie van de lading. Gezonde microglia fagocytose apoptotische hersencellen om ze te verwijderen voordat ze necrotisch worden1. De fagocytose van apoptotische cellen is ook bekend als efferocytose en vereist de weergave van een fosfatidylserine "eet-me" -signaal door de stervende cel2. Talrijke microgliareceptoren binden direct aan fosfatidylserine, waaronder TIM-4, BAI1, Stabilin-2 en TREM2. Microgliale TAM-receptoren (bijv. MERTK) en integrinen binden indirect aan fosfatidylserine, met behulp van respectievelijk accessoire-eiwitten GAS6 of MFG-E8. Andere "eet-me" -signalen kunnen nodig zijn voor herkenning van stervende cellen, deze omvatten veranderingen in glycosylatie of lading van oppervlakte-eiwitten; expressie van intracellulaire eiwitten ICAM3, calreticuline, annexine-I aan het celoppervlak; geoxideerd LDL; of coating van de apoptotische cel door microglia-geproduceerd complement C1q1,2.
Neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, frontotemporale dementie en amyotrofische laterale sclerose zijn in verband gebracht met een aantasting van de microgliafunctie, waaronder een opeenhoping van hersenafvalproducten zoals dode cellen, myelinefragmenten en eiwitaggregaten, en overdreven ontstekingsreacties op deze stimuli3. Fagocytose kan worden aangetast bij neurodegeneratieve ziekten en bijdragen aan de pathologie, als gevolg van een combinatie van veroudering, ontsteking of specifieke genetische risicovarianten4,5. Aan de andere kant is er ook bewijs uit diermodellen van neurodegeneratieve ziekten dat microglia ten onrechte levensvatbare neuronen of synapsen kunnen fagocytosen6,7,8. Het mechanisme wordt waarschijnlijk geïnstigeerd door fosfatidylserineweergave van beschadigde neurieten, die direct wordt gevoeld door microgliale fagocytosereceptoren TREM2 of GPR56, of indirect wordt gevoeld door oplosbaar complement C1q dat het fosfatidylserine-verrijkte membraan bedekt, wat leidt tot CR3-gemedieerde fagocytose9,10,11.
In vitro assays van fagocytosefunctie, bijvoorbeeld om de fenotypische impact van een genetische risicovariant in microglia te beoordelen, worden vaak uitgevoerd met behulp van niet-fysiologische ladingen zoals latexparels4. Fluorescerend gelabelde bacteriën en zymosan worden ook gebruikt, die fysiologisch zijn maar niet relevant voor neurodegeneratieve ziekten. Niet-fysiologische fagocytische ladingen kunnen worden gebruikt om defecten in de basismachinerie van fagocytische overspoeling te detecteren, maar slagen er niet in om de eerste "herkenningsstap" in fagocytose van apoptotische neuronen nauwkeurig te modelleren. De grootte, vorm, stijfheid en het type lading dicteren ook de intracellulaire signaalroutes die worden geactiveerd, wat leidt tot verschillende uitkomsten van de activeringstoestand van microglia. E.coli-bacteriën zijn bijvoorbeeld klein en stijf, in tegenstelling tot menselijke cellen, en de lipopolysacchariden op hun oppervlak worden herkend door Toll-like receptor 4 (TLR4) die fagocytose en pro-inflammatoire signaalroutesactiveert 2,12.
In de context van neurodegeneratieve ziektestudies zou een meer relevante fagocytische lading fosfatidylserine-weergave hebben op plasmamembranen van zoogdieren, en idealiter menselijk en neuronaal zijn, om signalen op te nemen die microglia waarschijnlijk zullen tegenkomen. Voor dit fagocytoseprotocol werd de menselijke neuroblastoomcellijn SH-SY5Y gekozen als een neuronmodel dat gemakkelijk te culturen is. Permanente oppervlaktefosfatidylserineweergave werd kunstmatig geïnduceerd door paraformaldehyde, waarvan eerder is aangetoond dat het fosfatidylserine-weergave van bloedplaatjesveroorzaakt 13. Voor het microgliacelmodel werden menselijke iPSC-macrofagen gebruikt, die het ontogenie- en transcriptieprofiel van menselijke microglia nabootsen en fagocytisch competent zijn14,15,16,17. iPSC-macrofagen zijn niet het meest authentieke microgliamodel dat beschikbaar is, ze bootsen bijvoorbeeld geen microgliamorfologie na; men kan het echter vervangen door een meer authentiek monocultuur iPSC-model van microglia indien gewenst, zoals Haenseler et al.15. Menselijke iPSC-modellen hebben de voorkeur boven primaire knaagdiermicroglia voor het bestuderen van neurodegeneratie, vanwege bezorgdheid over de beperkte overlap van de microglia-transcriptionele modules waargenomen in neurodegeneratieve ziekteweefsels van mens versus muis18. De dode SH-SY5Y's zijn gekleurd met een zuurgevoelige kleurstof die zwak fluoresceert bij neutrale pH en sterker in de fagolysosomen van iPSC-macrofagen na fagocytose. Het gebruik van een zuurgevoelige kleurstof verbetert de nauwkeurigheid van het detecteren van fagocytische gebeurtenissen, met veelzijdigheid voor verschillende uitlezingen van levende en vaste macrofagen19. Dit protocol schetst zowel live-cell time-lapse beeldvorming van fagocytose, als een vaste high-content imaging assay voor fagocytose, met dezelfde celvoorbereidingsstappen voorafgaand aan de uitlezing(Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figuur 1: Schematisch schema van de methodologie. Omtrek van de fagocytosetest, waarbij de bereiding van de SH-SY5Ys en kleuring van de iPSC-macrofagen parallel wordt uitgevoerd en vervolgens de SH-SY5Ys op de iPSC-macrofagen worden gepipteerd. Ofwel wordt live-cell time-lapse imaging onmiddellijk uitgevoerd, ofwel worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C/5% CO2 voor de vereiste duur en gefixeerd voordat microscopie met een hoog gehalte wordt uitgevoerd. PFA: paraformaldehyde, HBM: fenol roodvrije HEPES-gebufferde media, pHr: pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof STP Ester oplossing, PRFMM: fenol roodvrije macrofaag media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL conische centrifugeerbuis</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Voor het centrifugeren van cellen</td></tr><tr><td>2-20 &micro;L, 20-200 &micro;L, 100-1000 &micro;L eenkanaals micropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol 50 mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Component van Factory media</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde in PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>Voor het fixeren van cellen</td></tr><tr><td>6-well plaat, behandeld voor weefselkweek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AggreWell-800 24-well plaat</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>Microwell plaat met lage hechting voor het vormen van embryoïde lichamen</td></tr><tr><td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Kit voor annexin V-FITC kleuring, als een assay voor kwaliteitscontrole van gefixeerde SH-SY5Ys. Kit bevat annexin binding buffer, annexin V-FITC en propidiumjodide.</td></tr><tr><td>Automatische celteller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, behandeld voor weefselkweek, zwart, 96-well met deksel</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>96-well weefselkweek (TC)-behandelde microplaat met zwarte welwanden en een optisch heldere bodem, voor fagocytose-assay</td></tr><tr><td>CellProfiler software</td><td></td><td></td><td>Open-source software voor analyse van fagocytose-beelden verkregen door live-cell time-lapse microscoop. Download gratis van de website (http://cellprofiler.org/), dit protocol gebruikte versie 2.2.0.</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red kleurstof</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34565</td><td>Diep rood-fluorescent, cel-doorlatende, succinimidyl ester-reactieve kleurstof voor het kleuren van cytoplasma van iPS-macrofagen. Los CellTracker Deep Red kleurstof op in DMSO tot 2 mM (1,4 mg/mL). Gebruik op 1 &mu;M, door verdunning van DMSO-voorraad met Macrofagen media.&nbsp;</td></tr><tr><td>Klasse 2 laminaire luchtstroom veiligheidskast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 gasfles</td><td></td><td></td><td>Accessoire voor EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>CO2 incubator, ingesteld op 37&deg;C en 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Data opslag en analyseplatform voor Opera Phenix. Ondersteunt alle belangrijke high content screening instrumenten.</td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>Negatieve controlebehandeling voor fagocytose-assay. Reconstitueer in DMSO tot 10 mM en bewaar aliquots bij -20&deg;C, vermijd verdere vries-ontdooi cycli. Gebruik op eindconcentratie 10 &micro;M.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>Component van SH-SY5Y media</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Oplosmiddel voor CellTracker en pHrodo kleurstoffen</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Imaging System</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMF4300</td><td>Live-cell time-lapse beeldvorming microscoop</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>Accessoire voor EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4650</td><td>Accessoire voor EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>Accessoire voor EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Onstage Incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>Accessoire voor EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Component van SH-SY5Y media</td></tr><tr><td>Flowcytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysesoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC-gekwalificeerd, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>hESC-gekwalificeerd basement membrane matrix voor iPSC kweek</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Component van zowel Factory als Macrofagen media</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank&rsquo;s gebalanceerde zout oplossing voor wasstapjes</td></tr><tr><td>Human recombinant BMP4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>Component van Embryoïde Lichaam media</td></tr><tr><td>Human recombinant IL-3</td><td>Gibco</td><td>PHC0033</td><td>Component van zowel Factory als Macrofagen media</td></tr><tr><td>Human recombinant SCF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Component van Embryoïde Lichaam media</td></tr><tr><td>Human recombinant VEGF</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>Component van Embryoïde Lichaam media</td></tr><tr><td>Live Cell Imaging Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>Fenol rood-vrij HEPES-gebufferde media voor het labelen van dode SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>Tubes met lage proteïne binding van 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>Voor het kleuren van SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC9501</td><td>Component van zowel Factory als Macrofagen media</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>iPSC media</td></tr><tr><td>Multikanaals 20-200 uL pipet</td><td></td><td></td><td>Voor vloeistofbehandeling van 96-well plaat</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagens</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 formulering in een druppelfles voor het kleuren van kernen van iPS-macrofagen, gebruik 0,5 druppels/mL in Macrofagen media.</td></tr><tr><td>Opera Phenix High-Content Screening System</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>High-content beeldvorming microscoop, gebruikt met Harmony software versie 4.9.</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Component van Factory, Macrofagen, en SH-SY5Y media</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>pH-gevoelige rode fluorescente kleurstof voor het labelen van dode SH-SY5Ys. Reconstitueer pHrodo iFL Red STP Ester poeder in DMSO tot een concentratie van 5 mg/mL. Voor elke 1 miljoen SH-SY5Ys, voeg 2,5 &mu;L (12,5 &mu;g) van pHrodo iFL Red STP Ester voorraad toe aan voorverwarmde cellen gesuspendeerd in Live Cell Imaging Solution.&nbsp;</td></tr><tr><td>Serologische pipetvuller</td><td>

in vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door ipsc-macrofagen

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orkestreren neuro-immuunreacties bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. Microglia ruimen dode en stervende neuronen op door het proces van efferocytose, een gespecialiseerde vorm van fagocytose. De fagocytosefunctie kan worden verstoord door omgevings- of genetische risicofactoren die microglia beïnvloeden. Dit artikel presenteert een snel en eenvoudig in vitro microscopieprotocol voor het bestuderen van microgliale efferocytose in een geïnduceerd pluripotent stamcelmodel (iPSC) van microglia, met behulp van een menselijke neuroblastoomcellijn (SH-SY5Y) gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof voor de fagocytische lading. De procedure resulteert in een hoge opbrengst van dode neuroblastoomcellen, die oppervlaktefosfatidylserine vertonen, herkend als een "eet-me" -signaal door fagocyten. De 96-well plaattest is geschikt voor live-cell time-lapse imaging, of de plaat kan met succes worden gefixeerd voorafgaand aan verdere verwerking en gekwantificeerd door microscopie met een hoog gehalte. Fixed-cell high-content microscopie maakt het mogelijk om de test op te schalen voor screening van kleine molecuulremmers of het beoordelen van de fagocytische functie van genetische variant iPSC-lijnen. Hoewel deze test is ontwikkeld om fagocytose van hele dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen te bestuderen, kan de test gemakkelijk worden aangepast voor andere ladingen die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten, zoals synaptosomen en myeline, en andere fagocytische celtypen.

Live-cell time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van het eerder geschetste protocol, met wild-type iPSC-macrofagen gezaaid op 20.000 cellen per put. Verschillende hoeveelheden SH-SY5Ys werden toegepast (10.000-30.000 per put zoals geschat op basis van het celgetal in stap 3.1), en de fagocytoseremmer cytochalasine D werd voorgeïncubeerd (1 uur) met enkele putten, die fungocytose voor elke hoeveelheid SH-SY5Ys fungocytose. Beeldvorming begon 40 minuten na de toevoeging van SH-SY5Ys en beelden werden vastgelegd met intervallen van 5 minuten voor de volgende 3 uur (gegevens omvatten de initiële vertraging van 40 minuten). Een representatieve time-lapse video is opgenomen in de aanvullende gegevensen geanalyseerd kwantitatieve gegevens weergegeven in figuur 3. Met de hoeveelheid van 10.000 SH-SY5Ys per put nam het aantal fagocytosed deeltjes (vlekken) per cel lineair toe met de tijd en werd het met ongeveer 50% geremd door cytochalasine D. De remming door cytochalasine D was zwakker dan verwacht, hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door onvoldoende technische of biologische replicaties, aangezien slechts één put per aandoening in beeld werd gesteld met drie beeldvelden. Met hogere hoeveelheden SH-SY5Ys per put (20.000 en 30.000) vertoonde fagocytose een slechte lineariteit, waarschijnlijk als gevolg van slechte segmentatie van iPSC-macrofagen en SH-SY5Ys in een drukker gezichtsveld.
Fixed-cell high-content imaging werd uitgevoerd met behulp van het eerder geschetste protocol, met wild-type iPSC-macrofagen bij 20.000 cellen per put, verschillende hoeveelheden SH-SY5Ys (10.000-80.000 per put), en de testplaat werd na 5 uur gefixeerd en in beeld gebracht. Een representatief beeld van fagocytose wordt weergegeven in figuur 4Aen de geanalyseerde gegevens in figuur 4B17. Het verhogen van de hoeveelheid SH-SY5Ys resulteerde in een hoger aantal fagocytosed deeltjes (vlekken) per cel; een verdubbeling van de SH-SY5Y-hoeveelheid leidt echter slechts tot een toename van 1,5x van het aantal vlekken per cel. Dit geeft aan dat de geteste hoeveelheden niet snelheidsbeperkend zijn voor fagocytose. Vervolgens werd de high-content imaging fagocytose assay gevalideerd met behulp van verschillende remmers van fagocytose (Figuur 4C)17. De actinepolymerisatieremmers cytochalasine D en jasplakinolide remden fagocytose significant met respectievelijk 91% en 90% wanneer ze gedurende 1 uur voorafgaand aan fagocytose werden geprecubeerd. De robuuste Z' van de test wanneer cytochalasine D of jasplakinolide als negatieve controle worden gebruikt, wordt berekend als 0,7 en 0,8, respectievelijk20. De lysosoomverzuringsremmer bafilomycine A1 verminderde fagocytose aanzienlijk met 31%, wanneer geïncubeerd 1 uur voorafgaand aan fagocytose. Het zwakkere effect van de lysosoomverzuringsremmer versus actineremmers suggereert dat detectie van de geïnternaliseerde lading mogelijk geen volledige verzuring van het fagosoom vereist. Recombinant annexine V werd gebruikt als een controle om specifiek fosfatidylserine blootgesteld aan het oppervlak van SH-SY5Ys te blokkeren, waardoor fagocytische receptoren geen toegang krijgt tot het ligand, een belangrijk "eet-me" -signaal. Toevoeging van recombinant annexine V verminderde fagocytose aanzienlijk met 30%, wanneer toegevoegd aan putten onmiddellijk vóór SH-SY5Y-toevoeging. Vaste SH-SY5Y's werden bevestigd om fosfatidylserine bloot te leggen, met behulp van een fluorescerende annexine V-sonde, terwijl levende SH-SY5Y's negatief waren voor annexine V-kleuring(figuur 4D).
De microgliale fagocytosereceptor TREM2 is eerder belangrijk gebleken voor fagocytose van apoptotische neuronen21. De R47H-mutatie van TREM2 is een risicogen voor het late begin van de ziekte van Alzheimer en wordt verondersteld ligandbinding van TREM223te verminderen. Met het oog op de beoordeling van de fagocytische functie van R47H TREM2 en TREM2 KO, werd de fagocytosetest met een vast celgehalte uitgevoerd met behulp van isogene iPSC-macrofaaglijnen met WT / R47H / KO TREM217. Verschillende lengtes van fagocytoseduur van 1 tot 5 uur werden getest, met behulp van een gespreide toevoeging van fagocytische lading (40.000 SH-SY5Ys). Het resulterende signaal neemt lineair toe tot 4 uur en vlakt iets af bij 5 uur (figuur 5)17. Verminderde fagocytosesnelheid en -capaciteit (% spotpositieve cellen) was duidelijk in de TREM2 KO in vergelijking met WT, terwijl de R47H TREM2-mutant geen veranderde fagocytose vertoonde. Het fagocytische defect in TREM2 KO-cellen wordt niet gefenocopieerd door de R47H TREM2-mutatie, schijnbaar omdat de TREM2-functie voldoende is om normale fagocytose te ondersteunen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figuur 3: Voorbeeldgegevens voor live-cell time-lapse fagocytose assay. Opname van dode SH-SY5Ys door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) afgebeeld met intervallen van 5 minuten gedurende 3 uur. De tijden die op de grafiek worden weergegeven, zijn vanaf het begin van fagocytose, inclusief de eerste 40 minuten zonder meting. Het gemiddelde aantal vlekken per cel uit drie repliceerputten wordt uitgezet. Fagocytose van 10.000 SH-SY5Ys wordt geremd met 10 μM cytochalasine D met 1 uur voorbehandeling, terwijl hogere hoeveelheden SH-SY5Ys (20.000 en 30.000) suboptimale kwantificering van fagocytose hebben. Gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), N = 1 experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figuur 4: Optimalisatie en validatie van fagocytosetest met een vast celgehalte met een hoog gehalte. (A) Representatief microscopiebeeld met hoog gehalte van SH-SY5Ys fagocytosed door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Een 3 uur tijdspunt met 40.000 SH-SY5Ys wordt getoond. Fluorescentiekanalen worden samengevoegd, waarbij iPSC-macrofaagvlek als rood wordt weergegeven, kernen als blauw en SH-SY5Ys als geel. Het inzetpaneel is een gedeelte van het beeld dat 3x wordt vergroot. (B) Het aantal vlekken per cel van fagocytosed dode SH-SY5Ys na 5 uur, met behulp van verschillende hoeveelheden ladingtoevoeging aan wild-type iPSC-macrofagen. Gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), voor N = 3 oogsten. (C)Fagocytose (3 h) wordt geremd met 10 μM cytochalasine D (Cyt), 1 μM bafilomycine A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (met 1 uur voorbehandeling; Jas) en 13 μg/ml recombinant annexine V (gelijktijdig toegevoegd aan de dode SH-SY5Ys; Ann). iPSC-macrofagen zonder toegevoegde SH-SY5Y's werden gebruikt als een negatieve controle (-ve), en de positieve (+ve) controle is onbehandelde iPSC-macrofagen met SH-SY5Ys toegevoegd. Gegevens werden genormaliseerd tot het gemiddelde voor de herhaling van het experiment. Betekent ± SEM, voor N = 3-6 oogsten en met twee wild-type cellijnen (SFC840-03-03, de karakterisering van deze lijn wordt beschreven in (Fernandes et al.21 en BIONi010-C). 1-weg ANOVA met Dunnett's post-hoc test, vergelijkingen met onbehandelde cellen. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Vers gefixeerde SH-SY5Ys kleuren gelijkmatig voor fosfatidylserineweergave (annexine V-FITC) en hebben een beperkte celdoorlaatbaarheid (propidiumjodide). Levende SH-SY5Y's vlekken niet op annexine V-FITC of propidiumjodide, behalve focale kleuring die aanwezig is op de weinige dode cellen in cultuur. Cijfers zijn gereproduceerd met toestemming van Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figuur 5: Fagocytose is verminderd in TREM2 KO maar niet in R47H TREM2 iPSC-macrofagen. Fagocytosetest met hoog gehalte uitgevoerd met 40.000 SH-SY5Ys per put met gespreide toevoegingen. Voor de parameters werden middelen gekwantificeerd: aantal vlekken per cel, som van de spotgebieden(μm 2) per cel en percentage cellen dat fagocytosed deeltjes per veld bevat. Gegevens werden genormaliseerd tot gemiddelde voor elk genotype per experiment. Gemiddelde ± SEM, voor N = 3 oogsten. Herhaalde metingen 2-weg ANOVA, Dunnett's post-hoc test, paarsgewijze vergelijkingen met de WT voor elke keer: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Cijfers zijn gereproduceerd met toestemming van Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: Voorbeeld QC voor SH-SY5Ys voorbereiding. Gedissocieerde SH-SY5Y's werden gedurende 10 minuten gefixeerd met 0% (levende cellen), 1% en 2% paraformaldehyde (PFA) en vervolgens gewassen. Cellen werden gekleurd met annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) en onmiddellijk gemeten met flowcytometrie. Kleurdichtheid dot plots werden gemaakt in flowcytometrie analyse software, met behulp van de single-stained en unstained controles om een kwadrant poort te plaatsen. Kwadranten worden geannoteerd met het percentage gebeurtenissen binnen dat kwadrant. Levende cellen bevinden zich voornamelijk in Q4 en vaste cellen bevinden zich voornamelijk in Q2. Q1 = annexine V-/PI-, Q2 = annexine V+/PI+, Q3 = annexine V+/PI-, Q4 = annexine V-/PI- (levende cellen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende video: Live-cell time-lapse fagocytose. Representatieve time-lapse video van SH-SY5Ys fagocytosed door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Er werden elke 5 minuten gedurende 3 uur foto's gemaakt. Video wordt bijgesneden en draait met 3 frames per seconde, waarbij de laatste 1,5 uur van de test wordt weergegeven. De zuurgevoelige kleurstof-gekleurde SH-SY5Ys worden weergegeven in rood, signaalintensiteit neemt toe met fagosoomverzuring. Celkernen gekleurd met Hoechst 33342 zijn blauw weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Deze in vitro imaging assay maakt het mogelijk om het effect van verschillende celbehandelingen of verschillende genotypen op microgliale fagocytose te kwantificeren. Met behulp van twee celtypen die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten, gebruiken we dode neuroblastoomcellen voor de fagocytische lading, die worden bereid op een manier die gemakkelijk en goedkoop kan worden opgeschaald door grote beeldvormingsschermen met een hoog gehalte. Dissociëer SH-SY5Ys in een biologische veiligheidskast van klasse 2 door het medium aan te zuigen.Voeg 4 ml celdissociatiebuffer toe en verwijder de buffer onmiddellijk, zodat er minder dan 1 ml overblijft als een dunne film die de cellen bedekt. Incubeer gedurende 2 tot 3 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervolgens bij 10 ml HBSS in de T-75 kolf.En pipetteer de SH-SY5Ys in een conische centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op 400xG gedurende 5 minuten. Aspirateer het supernatant en suspensie de cellen opnieuw in 2 ml fenol roodvrije HEPES gebufferde media, zorg ervoor dat klonten worden gebroken voordat ze worden gefixeerd.Fixeer de cellen door 2 ml 4% power formaldehyde aan de buis toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te broeden met af en toe zacht roeren. Voeg 10 ml HBSS toe aan de tube. Centrifugeer vervolgens gedurende 7 minuten bij 1200xG.Aspirateer het supernatant en suspensie de celkorrel opnieuw in 2 ml fenol roodvrije HEPES gebufferde media. Tel en verwijder 1 miljoen HS-SY5Y-cellen in een 2 ml laag eiwitbindende buis. Breng het totale volume op 300 tot 500 microliter met fenolrode HEPES gebufferde media.Verwarm de buis vervolgens kort in een waterbad van 37 graden Celsius. Reconstitueer de pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof STP-ester volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens 12,5 microgram kleurstof per miljoen SH-SY5Y-cellen toe.Meng zachtjes door op de buis te vegen. En incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht. Voeg 1 ml HBSS toe en centrifugeer bij 1200xG gedurende 7 minuten en 4 graden Celsius.Gooi het supernatant weg. En wassen met 2 ml HBSS. Suspensie van de celkorrel in fenolrode macrofaagmedia opnieuw tot een concentratie van 0,2 tot 1,2 miljoen cellen per ml, zodat 50 microliter 10.000 tot 60.000 cellen bevat.Bereid in een biologische veiligheidskast een oplossing van dieprood fluorescerende celpermeant succinimidylester-reactieve kleurstof in macrofaagmedia. Voeg Hoechst 33342 toe en verwarm de werkoplossing tot 37 graden Celsius in een waterbad. Aspirateer het iPSC macrofaagmedium voorzichtig op door het celsupernatant met een meerkanaalspipet in een steriel reservoir te pipetteren.Voeg 70 microliter per putje van de kleurstofoplossing toe aan de iPSC-macrofagen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Herstel experimentele behandelingen in fenolrode macrofaagmedia.Adem na de incubatie het iPSC-macrofaagmedium heel voorzichtig op met een meerkanaalspipet en voeg 100 microliter HBSS per put toe. Verwijder HBSS onmiddellijk door zachtjes te pipetteren. Voeg vervolgens 100 microliter fenol roodvrije macrofaagmedia toe, plus experimentele behandelingen in afzonderlijke putten.Incubeer gedurende 10 minuten tot 1 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 microliter van de gelabelde SH-SY5Ys per put toe te voegen vanaf de zijkanten van elke put aan de rand van de vloeistof. Incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 3 tot 5 uur.Na de fagocytose-incubatie, aspirateer voorzichtig celsupernatanten door pipetteren met een meerkanaalspipet en weggooien. Eén keer wassen met 100 microliter PBS. Fixeer vervolgens de cellen door 100 microliter 2% formaldehyde toe te voegen en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te broeden.Aspirateer putten en voeg 100 microliter PBS toe. Ga direct over tot beeldvorming met de microscoop met een hoog gehalte, of dek af met plaatsealer en folie en bewaar de plaat bij 4 graden Celsius, totdat deze nodig is. Schakel de beeldmicroscoop met hoog gehalte in en open de software voor het vastleggen van afbeeldingen.Laad de testplaat in de microscoop door op het load-pictogram boven aan het scherm te klikken. Selecteer het tabblad SETUP. Selecteer in de vervolgkeuzemenu's linksboven het juiste plaattype.De autofocus optie: twee piek "Het objectief: 40x Water, NA 1.1 "Confocal"-modus en Binning van 1. Spoel de 40x Water objective voor gebruik door via het instellingenmenu. Gebruik in het kanaalselectievak het pluspictogram om de kanalen DAPI, Alexa 647 en Alexa 568 toe te voegen.Stel deze in op een enkel vlak van één micrometer. Optimaliseer tijd- en vermogensinstellingen voor de kleurefficiëntie van de testplaat. Zorg ervoor dat de kanalen niet tegelijkertijd worden gemeten door op kanaalvolgorde te klikken om de kanalen te scheiden.Selecteer onder navigatie en lay-out definiëren de meetputten en selecteer 9 tot 12 velden per put. Klik tijdens het instellen op een representatief veld op de plaatkaart. En controleer elk meetkanaal op zijn beurt om er zeker van te zijn dat de kleuring aanwezig is en dat de beelden worden scherpgesteld door de kanaalverschuiving aan te passen.Om de gegevens naar een server te uploaden voor analyse op afstand, klikt u op het vak online vacatures en de relevante schermnaam. Sla het testprotocol op door op de knop Opslaan te klikken en klik bovenaan op het tabblad Experiment uitvoeren. Noem de experimentplaat en klik vervolgens op start"Een live cell time lives fagocytose-test toonde aan dat met 10.000 SH-SY5Ys per put het aantal fagocytosedeeltjes per cel lineair toenam met de tijd en met ongeveer 50% werd geremd door Cytochalasine D.Met hogere hoeveelheden SH-SY5Ys per put vertoonde fagocytose een slechte lineariteit, waarschijnlijk als gevolg van slechte segmentatie van iPSC, macrofagen en SH-SY5Ys in een drukker gezichtsveld.De volgende resultaten werden verkregen door het uitvoeren van een beeldvorming met een hoog gehalte aan vaste cellen, inclusief dit representatieve beeld van fagocytose. Het verhogen van de hoeveelheid SH-SY5Ys resulteerde in een hoger aantal fagocytosed deeltjes per cel. De fagocytosetest werd gevalideerd met behulp van verschillende remmers van fagocytose.Cytochalasine D en Jasplakinolide remden fagocytose significant met respectievelijk 91 en 90 procent. En Bafilomycine A1 verminderde fagocytose aanzienlijk met 31% wanneer het gedurende 1 uur voorafgaand aan fagocytose werd voorgebrokt. Toevoeging van recombinant Annexin 5 verminderde fagocytose aanzienlijk met 30% wanneer toegevoegd aan putten onmiddellijk vóór SH-SY5Y-toevoeging.Vaste SH-SY5Ys we zijn bevestigd om fosfatidylserine bloot te stellen met behulp van een fluorescerende Annexin 5-sonde. Terwijl levende SH-SY5Y's negatief waren voor Annexin 5-kleuring. Verschillende lengtes van fagocytoseduur, van 1 tot 5 uur, werden getest met behulp van gespreide toevoeging van fagocytische lading.De totale lengte van deze protocall kan worden verkort door de fagocytische lading voor te bereiden en de iPSC-macrofagen parallel te kleuren. Als u dit wilt doen, werkt u de timing van tevoren uit en gebruikt u uw incubaties om oplossingen voor de toekomstige stappen voor te bereiden.

in-vitro-quantitative-imaging-assay-for-phagocytosis-dead

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we perform the microglial phagocytosis assay for neuroblastoma using induced pluripotent stem cells. The assay helps assess the impairment of microglial function in neurodegenerative diseases.

Microglial Phagocytosis Assay: An In Vitro Assay to Establish Microglial Phagocytosis Model for Neuroblastoma Cells Using iPSC Macrophages

In this video, we evaluate the phagocytic capacity of purified astrocytes in vitro by live imaging assay. The assay serves as an effective screening platform to identify chemical compounds that can enhance or inhibit the phagocytic capacity of astrocytes.

In Vitro Phagocytosis Assay: A Live Imaging Based Method to Study Real-time Astrocyte Mediated Synaptosome Phagocytosis

Source: Funes, S., et. al.,  Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates an assay to study the phagocytic capacity of microglia-like cells using pH-sensitive fluorescent dye-labeled synaptosomes.

Live-cell Phagocytosis Assay of Microglia-Like Cells Using Human Synaptosomes

Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

Dit protocol biedt een in vitro live-imaging fagocytose assay voor het meten van de fagocytische capaciteit van astrocyten. Gezuiverde rat astrocyten en microglia worden gebruikt samen met pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. Deze methode kan detecteren real-time engulfment en afbraak kinetiek en biedt een platform geschikt screening om te identificeren factoren moduleren Astrocyt fagocytose.

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Dit protocol beschrijft de robuuste generatie van macrofagen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en methoden voor hun latere karakterisering. Celoppervlaktemarkerexpressie, genexpressie en functionele tests worden gebruikt om het fenotype en de functie van deze iPSC-afgeleide macrofagen te beoordelen.

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.

Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Leer een snelle in vitro beeldvormingstest voor kwantitatieve analyse van fagocytose door iPSC-microglia met behulp van gelabelde SH-SY5Y-cellen. Deze methode ondersteunt high-content screening voor neurodegeneratief onderzoek.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Meer video's verkennen