Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

Ons protocol vergemakkelijkt de formulering van polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor gebruik als biomaterialen. We hopen dat onderzoekers dit materiaal zullen ontwikkelen voor translationele toepassingen en om fundamentele biologische vragen te verkennen. PNP hydrogels worden gemakkelijk geïnjecteerd door naalden en katheters met een kleine diameter, maar genezen snel zelf na injectie.

Dit maakt de niet-invasieve gecontroleerde levering van geneesmiddelen en cellen over lange tijdschalen mogelijk. Deze technologie verlegt de grenzen voor gelokaliseerde therapie en uitgebreide medicijnafgifte, met implicaties voor brede razende aandoeningen van kanker tot weefselregeneratie tot passieve immunisatie. Om nanodeeltjes te synthetiseren door nanoprecipitatie, voegt u 50 milligram PEG-PLA-polymeer toe aan een glazen scintillatieflacon van acht milliliter en voegt u één milliliter acetonitril toe aan de flacon.

Vortex om volledig op te lossen. Voeg vervolgens 10 milliliter ultrazuiver water toe aan een glazen scintillatieflacon van 20 milliliter met een kleine roerstaaf en plaats de flacon op een roerplaat die is ingesteld op 600 omwentelingen per minuut. Gebruik een pipet van 200 microliter om een milliliter polymeeroplosmiddeloplossing druppelgewijs aan de flacon water toe te voegen.

Kern-shell nanodeeltjes zullen zich vormen als de polymeer oplosmiddeloplossing snel wordt verspreid door het water. Controleer de deeltjesgrootte door dynamische lichtverstrooiing volgens standaardprotocollen. Breng vervolgens de nanodeeltjesoplossing over in een centrifugaalfiltereenheid om de oplossing te concentreren op minder dan 250 microliter en de nanodeeltjes in een geschikte buffer te resuspeneren.

Om de hydrogel te bereiden, voegt u 333 milligram 6% HPMC-C12-voorraadoplossing toe aan een Luer-slotspuit van één milliliter en voegt u 500 microliter van de 20% nanodeeltjesvoorraadoplossing en 167 microliter PBS toe aan een flacon van acht milliliter. Gebruik na het mengen een naald om nog een luer-slotspuit van een milliliter te vullen met de verdunde nanodeeltjesoplossing en bevestig de twee spuiten aan een elleboogmixer. Meng de twee oplossingen gedurende ongeveer 60 cycli tot er een homogeen, ondoorzichtig wit hydrogelmateriaal is gevormd.

Om de rheologische eigenschappen van de geformuleerde hydrogel te meten, injecteert u het juiste volume hydrogel volgens de geselecteerde geometrieopening in het midden van een gekartelde rheometerplaat en gebruikt u oscillatie- en stroomtests om de mechanische eigenschappen van het monster te meten. Om de afgifte van geneesmiddelen uit de hydrogel te karakteriseren, bereidt u eerst een glazen haarvaten voor met behulp van epoxy om het ene uiteinde van elke buis af te dichten. Wanneer de epoxy is ingesteld, gebruikt u een 4-inch 22 gauge injectienaald om 100 tot 200 microliter hydrogel in minimaal drie buizen per monster te injecteren en voeg voorzichtig 200 tot 300 microliter PBS toe aan elk volume hydrogel.

Gebruik op de juiste tijdstippen, volgens de verwachte tijdschaal van het vrijkomen van geneesmiddelen, een naald om de PBS voorzichtig uit elk capillair te verwijderen zonder het hydrogeloppervlak te verstoren en een nieuw volume PBS toe te voegen. Analyseer aan het einde van het onderzoek de verzamelde PBS-aliquots met een geschikte methode om de hoeveelheid geneesmiddel te kwantificeren die op elk moment vrijkomt. Om de thermische stabiliteit van gel ingekapselde insuline te karakteriseren, laadt u zowel insuline als thioflavine T in de hydrogel zoals aangetoond en gebruikt u een naald van 21 gauge om 200 microliters van de lading en sonde geladen hydrogel in ten minste drie putten van een zwarte 96-put plaat per monster te injecteren.

Sluit de plaat vervolgens af met een optisch heldere zelfklevende plaatafdichting om verdamping te voorkomen en plaats de plaat in een plaatlezer die is uitgerust met temperatuurregeling, schudden en een kinetische leesprogrammering. Om de levensvatbaarheid van de hydrogel ingekapselde cellen te beoordelen, gebruikt u een naald met een 21 meter om 150 microliter hydrogel met de juiste concentratie cellen in elk van de drie putten per monster te injecteren in een heldere bodemplaat van 96 putten en voegt u 100 microliters van het juiste celmedium toe aan elk volume hydrogel. Vervang op de eerste dag van de kweek het supernatant op elke hydrogel op het juiste tijdstip voor elke monstergroep door 50 microliter calceïne AM-oplossing van twee millimolar.

Na een incubatie van 30 minuten, beeld het centrum van elke put door confocale microscopie. Om het vermogen van de ingekapselde cellen om zich vóór injectie in een spuit te nestelen te evalueren, verdunt u de cellen van belang tot een maal 10 tot de zes cellen per milliliter in PBS-concentratie en bevlekt u de cellen met 50 microliter van twee millimolar Calcein AM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Meng aan het einde van de incubatie de cellen met 500 tot 700 microliter hydrogel zoals aangetoond en gebruik een naald van 21 gauge om 100 tot 200 microliter celhoudende hydrogel in de bodem van ten minste één cuvette per monster te injecteren.

Stel vervolgens de cuvetten die plat op hun zijkanten liggen op het podium van een confocale microscoop onmiddellijk na injectie en op één en vier uur na het zaaien in beeld om te zien of de cellen zich in de hydrogel hebben gevestigd of dat ze zijn blijven hangen. De afschuifverdunning en zelfherstellend vermogen van de gel kunnen worden waargenomen met behulp van respectievelijk flow sweep- en step-shear-protocollen. Karakterisering van de opslag- en verliesmoduli met behulp van een oscillatoire shear frequency sweep experiment in het lineaire visco-elastische regime met frequentiebereiken van 0,1 tot 100 radialen per seconde onthult de vaste eigenschappen.

Er mag meestal geen crossover van de afschuifopslag en verliesmoduli worden waargenomen bij lage frequenties voor stijvere formuleringen, terwijl crossover-gebeurtenissen kunnen worden verwacht voor een zwakkere hydrogelformulering. Het variëren van het polymeergehalte van de PNP-hydrogels kan een directe invloed hebben op de verspreiding van lading via het polymeernetwerk en de snelheid van afgifte uit de materialen. PNP-hydrogels kunnen ook lading stabiliseren die gevoelig is voor thermische instabiliteit, waardoor de houdbaarheid van de lading aanzienlijk wordt verlengd en de afhankelijkheid van opslag en distributie van koudeketens wordt verminderd.

De opname van integrin motieven kan nuttig zijn voor het aanpassen van PNP hydrogels voor cellulaire therapieën. Ingekapselde cellen kunnen fluorescerend worden gelabeld om hun visualisatie en kwantificering te vergemakkelijken. Formuleringen zonder hechtingsplaatsen zullen bijvoorbeeld een lage levensvatbaarheid van cellen hebben, omdat ingekapselde cellen zich niet verspreiden in vergelijking met ingekapselde cellen en formuleringen met adhesiemotieven, zoals RGD.

We onderzoeken nog steeds hoe veranderingen in de formulering de rheologische kenmerken en het dynamische gaas van de polymeermatrix beïnvloeden. We gebruiken FRAP ook om de diffusie van moleculen in de hydrogel te bestuderen. Deze materialen kunnen worden gebruikt om nieuwe biologische vragen te stellen over hoe aanhoudende toediening de levering van geneesmiddelen, de ontwikkeling van vaccins of kankerimmunotherapie kan beïnvloeden.