Oogsten en uitsplitsen: een over het hoofd geziene stap in onderzoek naar biofilmmethoden

Het algemene doel van deze procedures is om biofilms op de optimale manier te oogsten en uit te splitsen om de reproduceerbaarheid te vergroten. In deze video worden drie technieken gedemonstreerd, elk gericht op het oogsten en uitsplitsen van een ander oppervlaktetype. Deze video demonstreert de juiste technieken voor één, vortexing en sonicerende biofilm van een hard niet-poreus oppervlak, zoals een polycarbonaatcoupon van de CDC-biofilmreactor.

Twee, het schrapen en homogeniseren van de biofilm van het harde niet-poreuze borosilicaatglasoppervlak dat vaak wordt aangetroffen in de druppelstroomreactor. En drie, het schrapen, vortexen en soniceren van biofilm van een poreus siliconen slangoppervlak dat vaak wordt aangetroffen in het kathetermodel. Hallo, mijn naam is Kelly Buckingham-Meyer hier bij het Standardized Biofilm Methods Lab.

In ons lab splitsen we biofilmmethoden op in vier componenten: groei, behandeling, bemonstering en analyse. In de peer-reviewed literatuur zijn details over hoe biofilms worden bemonsterd of geoogst en uitgesplitst van een oppervlak meestal schaars. Dit is de reden voor deze video.

Omdat ons laboratorium gestandaardiseerde biofilmmethoden ontwikkelt en test, hebben we een uitgebreid literatuuronderzoek uitgevoerd waarin de drie meest voorkomende methoden voor het oogsten en uitsplitsen van biofilms werden geïdentificeerd. Die methoden zijn vortexing en sonicating biofilm van een polycarbonaatcoupon, schrapen en homogeniseren van biofilm van een borosilicaatglascoupon en schrapen, vortexen en soniceren van biofilm uit siliconenbuizen. Hoewel methoden op papier krachtig zijn, hopen we dat de video met de technische details gepresenteerd door mijn collega Lindsey Miller en ik nuttig zal zijn.

Om te beginnen, kweek volwassen Pseudomonas aeruginosa 15442 biofilm volgens de ASTM-standaard E2562, de standaardtestmethode voor kwantificering van Pseudomonas aeruginosa Biofilm gekweekt met hoge afschuiving en continue stroom met behulp van de CDC Biofilm Reactor. Bereid je aan het einde van de groeiperiode van 48 uur voor op het behandelen en bemonsteren van coupons volgens de ASTM-standaard E2871, de standaardtestmethode voor het bepalen van desinfecterende werkzaamheid tegen biofilm gekweekt in de CDC-biofilmreactor met behulp van de single tube-methode. Plaats vervolgens aseptisch geautoclaveerde spatschermen in steriele conische buizen van 50 milliliter met behulp van een vlamgesteriliseerde tang.

Herhaal dit voor alle buizen die een behandeling krijgen. Buizen voor bedieningscoupons hebben geen spatscherm nodig. Verwijder aseptisch een staaf uit de CDC-biofilmreactor en spoel deze in 30 milliliter steriel verdunningswater.

Dit zal de losjes gehechte cellen uit de biofilm verwijderen. Houd de staaf evenwijdig aan het tafelblad over de monsterbuizen met spatschermen. Gebruik een vlamgesteriliseerde inbussleutel om de stelschroeven los te draaien om een met biofilm gecoate coupon in de buis te laten vallen.

Herhaal dit voor het gewenste aantal kortingsbonnen. Verwijder de spatschermen en plaats de spatschermen in een aparte container voor sterilisatie. Pipetteer met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter langzaam vier milliliter behandeling of controle in de buizen, zodat de vloeistof langs de binnenkant van de wand van de buis stroomt.

Draai voorzichtig de onderkant van de buis zodat eventuele luchtbellen onder de coupon worden verplaatst. Houd rekening met 30 tot 60 seconden tussen elke toevoeging. Pipetteer aan het einde van de opgegeven contacttijd 36 milliliter neutralisator in de buizen in dezelfde volgorde als waarin de behandeling of controle werd toegepast.

Vortex elke buis op de hoogste stand gedurende 30 plus of min vijf seconden en zorg ervoor dat een volledige vortex wordt bereikt. Plaats buizen in het buizenrek dat in de ontgaste sonicator is opgehangen, zodat het waterniveau in het bad gelijk is aan het waterniveau in de buizen. Soniceer de monsters met 45 kilohertz, 100% vermogen en normale functie gedurende 30 plus of min vijf seconden.

Herhaal de vortex- en ultrasoonapparaatcycli en eindig met een laatste vortex, voor een totaal van vijf cycli. Verdun ten slotte het monster serieel, plaats de verdunning op R2A-agar en incubeer de platen gedurende 24 uur bij 36 graden Celsius. Tel de kolonies zoals geschikt voor de beplatingsmethode en noteer de gegevens.

Deze volgende biofilmoogst- en desaggregatietechniek is nuttig voor harde niet-poreuze coupons die de standaard zijn in de druppelstroomreactor. Kweek een volwassen Pseudomonas aeruginosa 15442 biofilm volgens de ASTM-standaard E2647 de standaard testmethode voor kwantificering van Pseudomonas aeruginosa Biofilm gekweekt met behulp van drip flow biofilm reactor met lage schuif en continue stroom. Stel het bemonsteringsstation in met een bemonsteringsbord, 95% ethanol in een bekerglas, een alcoholbrander, hemostaten, een gereedschap voor het verwijderen van coupons, bekers met steriel verdunningswater en verdunningsbuizen voor het spoelen van de coupons.

Schakel de pomp uit, verwijder de kanaalafdekking en gebruik steriele couponverwijderingstool en hemostaten om de coupon te verwijderen, waarbij u voorzichtig bent om de biofilm niet te verstoren. Spoel de coupon door voorzichtig met een vloeistofbeweging onder te dompelen in 45 milliliter steriel verdunningswater in een centrifugebuis van 50 milliliter. Draai de motie om de coupon te verwijderen onmiddellijk terug.

Plaats de coupon in een bekerglas met 45 milliliter steriel verdunningswater. Schraap het met biofilm bedekte couponoppervlak gedurende ongeveer 15 seconden in neerwaartse richting met behulp van een steriele spatel of schraper. Spoel de spatel of schraper af door deze in het bekerglas te roeren.

Herhaal het schraap- en spoelproces drie tot vier keer en zorg voor volledige dekking van het couponoppervlak. Spoel de coupon af door deze in een hoek van 60 graden boven het steriele bekerglas te houden en een milliliter steriel verdunningswater over het oppervlak van de coupon te pipetteren. Herhaal dit voor een totaal van vijf spoelingen.

Het uiteindelijke volume in het bekerglas is nu 50 milliliter. Werk in de bioveiligheidskast en homogeniseer het geschraapte biofilmmonster. Bevestig een steriele homogenisatorsonde aan de homogenisator.

Plaats de sondepunt in de vloeistof en zet de homogenisator aan en voer op tot 20.500 RPM. Homogeniseer het monster gedurende 30 seconden. Zet het toerental lager en schakel de homogenisator uit.

Ontsmet de sonde tussen biofilmmonsters door te homogeniseren in negen milliliter steriele verdunning blanco bij 20, 500 RPM gedurende 30 seconden zoals hierboven beschreven. Homogeniseer een buis van negen milliliter van 70% ethanol gedurende 30 seconden en maak de sonde los en laat deze één minuut in de ethanolbuis staan. Homogeniseer twee extra verdunningslekken.

Ook kan voor elk monster een steriele wegwerphomogenisatorsonde worden gebruikt. Verdun het gehomogeniseerde monster serieel, plaats de verdunningen op R2A met behulp van de juiste beplatingsmethode en incubeer de platen gedurende 24 uur bij 36 graden Celsius. Tel de kolonies en noteer de gegevens.

Deze laatste biofilmoogst- en desaggregatietechniek is nuttig voor biofilm die in poreuze slangen wordt gekweekt, zoals de siliconenslang die in het kathetermodel wordt gebruikt. Om deze procedure te starten, kweekt u een volwassen E.coli 53498 biofilm in siliconenkatheterbuizen. Bereid de bemonsteringsmaterialen voor: gespoelde buizen, een steriele centrifugebuis, een lege steriele petrischaal, vlamsteriliseerde roestvrijstalen hemostaten, een schaar, een timer en een liniaal.

Gebruik, terwijl de pomp is gepauzeerd, 70% ethanol om de buitenkant van de slang te reinigen. Meet twee centimeter van het uiteinde, vermijd het gebied dat aan de connector is bevestigd en markeer buizen om snijlocaties te bepalen. Knip met een vlamsteriliseerde schaar de slang op de markering van twee centimeter.

Spoel het slangsegment af om planktoncellen te verwijderen. Met vlamsteriliseerde tang dompelt u het slangsegment voorzichtig onder in 20 milliliter steriel verdunningswater en verwijdert u het onmiddellijk. Plaats het segment in 10 milliliter neutralisator.

Houd met een vlamsteriliseerde tang het slangsegment vast en schraap met een steriele houten applicatorstok totdat alle binnenste delen van de buis zijn geschraapt. Spoel de stok af en toe in de 10 milliliter neutralisator en plaats het segment terug in de monsterbuis. Het geschraapte buizensegment is nu de 10 tot de nul of de nulverdunning.

Vortex elke buis op de hoogste stand gedurende 30 plus of min vijf seconden. Plaats de buizen in het buizenrek dat in het sonicatorbad hangt, zodat het waterniveau in het bad gelijk is aan het vloeistofniveau in de buizen. Soniceer bij 45 kilohertz, 100% vermogen en normale functie gedurende 30 plus of min vijf seconden.

Herhaal deze vortex- en ultrasoonapparaatcyclus en eindig vervolgens met de laatste vortex. Verdun de monsters serieel in gebufferd water. Plaat op tryptische soja-agar met behulp van de juiste platingmethode en incubeer vervolgens de buizen bij 36 plus of min twee graden Celsius gedurende 24 uur.

Tel de kolonies zoals passend bij de gebruikte beplatingsmethode en noteer de gegevens om het rekenkundig gemiddelde te berekenen. Deze vier foto's gemaakt door Danielle Or en Blaine Fritz helpen allemaal om het belang van deze oogst- en desaggregatieprocedure te illustreren. Alle vier deze coupons waren gekleurd met kristalviolet om de hoeveelheid Pseudomonas aeruginosa biofilm op de coupons voor en na het vortex- en ultrasoonapparaatproces te visualiseren.

Coupon A is volledig bedekt met biofilm, terwijl coupons B, C en D allemaal aanzienlijk minder biofilm op hun oppervlak hebben. Coupons B, C en D werden allemaal onderworpen aan het vortex- en ultrasoonapparaatproces dat eerder werd beschreven. Deze twee foto's gemaakt door Lindsey Miller op een confocale microscoop met een vergroting van 12,5X tonen een Pseudomonas aeruginosa biofilm die werd behandeld met de live / dode vlek van het achtergrondlicht.

Het beeld aan de linkerkant werd gesoniseerd op 45 kilohertz en 10% vermogen, terwijl het beeld aan de rechterkant werd gesoniseerd op 45 kilohertz en 100% vermogen. Het is duidelijk dat de coupon aan de linkerkant veel meer biofilm op zijn oppervlak heeft in vergelijking met de coupon aan de rechterkant. Deze laatste figuur laat zien hoe de manipulatie van verschillende ultrasoonapparaatparameters van invloed is op de hoeveelheid Pseudomonas aeruginosa biofilm die van het couponoppervlak wordt verwijderd.

Al deze coupons werden gesoniseerd op 45 kilohertz, 100% vermogen en op normale instelling gedurende 30 plus of min vijf seconden. Deze foto's zijn gemaakt met een vergroting van 12,5x door Lindsey Miller. Coupons in rij één werden gesoniseerd in verdunningswater, terwijl de coupons in rij twee werden gesoniseerd in DE-neutraliserende bouillon.

Het lijkt erop dat er minder biofilm overblijft op de coupons die werden gesoniseerd in DE-bouillon die een oppervlakteactieve stof bevat in vergelijking met het verdunningswater. Coupons A, B, E en F werden allemaal gesoniseerd in een volume van 10 milliliter, terwijl coupons C, D, G en H werden gesoniseerd in 40 milliliter oplossing. Er staat duidelijk minder biofilm op de coupons die in de kleinere volumes werden gesoniseerd.

Coupons A, C, E en G werden in het bad gesoniseerd met drie buizen tegelijk, terwijl coupons B, D, F en H werden gesoniseerd in een bad met 12 buizen tegelijk. Het lijkt erop dat de monsters met minder buizen superieure biofilmoogst vertoonden. Uiteindelijk lijken het minimaliseren van het volume in de buizen, het verminderen van het aantal buizen dat in één keer wordt gesoniseerd en het gebruik van DE-neutraliserende bouillon allemaal bij te dragen aan een verbeterde biofilmoogst.

Er is geen perfecte methode om de biofilm te oogsten en uit te splitsen, maar sommige benaderingen zijn beter voor verschillende oppervlakken en / of toepassingen. De technieken die in deze video worden gedemonstreerd, zijn de drie meest voorkomende methoden volgens een literatuuronderzoek. Deze drie technieken kunnen een startpunt bieden voor onderzoekers.

Het is belangrijk om de tijd te nemen om de gekozen oogst- en uitsplitsingsmethode te valideren. Alle apparatuur is iets anders, dus zelfs als de methode is gestandaardiseerd, is het nog steeds verstandig om het proces voor de gebruikte apparatuur te bevestigen. Onderzoek heeft aangetoond dat onjuiste keuzes kunnen leiden tot bevooroordeelde testresultaten.

Na het bekijken van deze video zal deze informatie onderzoekers hopelijk helpen beter geïnformeerde beslissingen te nemen over welke methode ze moeten gebruiken en richtlijnen bieden voor het verbeteren van de reproduceerbaarheid voor de drie oppervlaktetypen en aanvullende oogst- en desaggregatietechnieken.