Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Het doel van deze procedure is om de enzymatische activiteit van individuele leden van de protein arginine methyltransferase familie in cellen te meten. De activiteit wordt gemeten door het bepalen van hun arginine methylatie niveaus en totale niveaus van bio-marker eiwit met behulp van kwantitatieve fluorescerende westerse blotting. Het voordeel van de beschreven methode is de eenvoudige prestaties in elk lab met celcultuur en fluorescerende westerse vlekmogelijkheden.

De gedetailleerde richtlijnen met betrekking tot biomarkers, antilichamen en remmer twee verbindingen zijn opgenomen in het artikel. En hier beschreven we cruciale stappen in de experimentele procedure. En de procedure wordt getoond voor 24 goed formaat.

Bereid eerst de lysisbuffer voor, voeg benzonase en eiwitremmercocktail vers toe voor gebruik. Verwijder alle media uit putten. Was met 100 microliter PBS en voeg 60 microliter lysisbuffer toe aan de put.

Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur en schommel de platen om de lysisbuffer over de cellen te verdelen. Voeg vervolgens drie microliters van 20% SDS toe om een concentratie van 1% te vinden en meng door zachtjes te schudden. Breng lysaat over in Eppendorf-buizen en houd het op ijs.

Bepaal de eiwitconcentratie van uw monsters met behulp van de BCA-eiwittestkit of gebruik een andere methode die 1% SDS in oplossing verdraagt. Na het aanpassen van de eiwitconcentratie met lysisbuffer gelijk over de monsters bij 20 microliter van vier keer de belastingsbuffer tot 60 microliter cellysaat en warmte op 95 graden gedurende vijf minuten. De toevoeging van benzonase aan de lysisbuffer hydrolyseert snel nucleïnezuren, die de viscositeit van cellysaat verminderen.

Lysaten met benzonase zijn niet stroperig. Lysaten zonder benzonase hebben een grote klodder gooey DNA die niet zal pellet wanneer gesponnen. Laad tot vijf tot 20 microgram totaal cellysaat voor histoneiwitten en 20 tot 100 microgram voor andere eiwitten in een gradiënt van vier tot 12 bis-tris eiwitgel.

Rond de gelei in dweilen als de omringende buffer gedurende ongeveer twee uur bij 100 volt, of totdat de blauwe ladingskleurstof de bodem van de gel bereikt. Als u een natte transfer uitvoert, monteert u de transfer sandwich in een ijskoude tris-glycine transferbuffer. Activeer het PVDF-membraan door 30 seconden voor de montage in methanol en equilibraatgel in de transferbuffer te weken.

Plaats sponzen filterpapier, PVDF-membraan en gel volgens de instructies van de fabrikant. Breng eiwitten over in tris-glycine transferbuffer op 70 volt gedurende een tot anderhalf uur op ijs. Na overdracht, incubeer het membraan gedurende 30 minuten in blokkeerbuffer.

Spoel af met wasbuffer en incubeer 's nachts met primaire antilichamen op vier graden. Was het membraan de volgende dag drie keer gedurende vijf minuten met wasbuffer, incubeer met fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en was drie keer gedurende vijf minuten met wasbuffer. Plaats het membraan naar beneden op de glasplaat van de fluorescerende western vlek imager.

Dek af met het rubberen vel en verwijder eventuele luchtbellen. Lees het signaal op 700 en 800 nanometer. Zodra de scan is voltooid, gaat u naar het beeld en past u het 700- en 800-kanaals signaal aan om de banden duidelijk te zien.

Hier vertegenwoordigt het 700-kanaals signaal dat als rood wordt weergegeven de totale eiwitniveaus, en het 800-kanaals signaal dat als groen wordt weergegeven, de niveaus van gemethyleerd eiwit. Ga vervolgens naar analyse en selecteer mediaan boven- en onderlezing. Als u de intensiteit van de banden wilt meten, selecteert u het gereedschap Rechthoek tekenen en tekent u de vorm rond de banden die u wilt kwantificeren.

Ga naar vormen waar je intensiteiten van 700 en 800 kanalen vindt. De kolom met de naam signaal geeft intensiteitsniveaus waarbij de achtergrond wordt afgetrokken. De resultaten kunnen rechtstreeks naar het Excel-bestand worden gekopieerd.

Hier is het voorbeeld dat de analyse van PRMT1-activiteit in cellen bij remming met PRMT type 1-remmer MS023 laat zien. PRMT1-activiteit wordt gemeten door de histon H4 arginine 3 asymmetrische dimethylatieniveaus te bepalen. Hier gaan de methyleringsniveaus, groene banden op een dosisafhankelijke manier omlaag, terwijl de totale histonniveaus rode banden ongewijzigd blijven.

Om de samengestelde IC50 te bepalen, moet de logaritme van de remmerconcentratie worden uitgezet tegen histon H4 arginine-3 asymmetrische dimethylatieniveaus genormaliseerd tot totale histonniveaus, gevolgd door niet-lineaire fitanalyse. De beschreven methode maakt een aansprakelijke en reproduceerbare dubbele detectie van de activiteit van eiwitmethyltransferase in cellen mogelijk. Het voordeel van de methode is dat het gebruik maakt van de bekende westerse blotting-methodologie die toegankelijk is voor academische laboratoria en gemakkelijk kan worden aangepast, afhankelijk van de laboratoriumapparatuur.

De testdetails, waaronder biomarkereiwitten, antilichamen en chemische twee verbindingen voor elk individueel PRMT-familielid, zijn opgenomen in het artikel.