Kraal loading eiwitten en nucleïnezuren in aanhankelijke menselijke cellen

Bead loading is een goedkope test voor het laden van membraan, ondoordringbare deeltjes in levende hechtende cellen. Dit protocol is uiterst nuttig gebleken voor het laden van sondes voor experimenten met een enkele cel of een enkel molecuul of fluorescentiemicroscopie. Bead loading stelt onderzoekers in staat om snel allerlei moleculen te laden, waaronder eiwitten, DNA, RNA, synthetische deeltjes of een combinatie hiervan tegelijkertijd in afzonderlijke cellen.

Bij het voor het eerst laden van kralen is het belangrijk om de tapkracht te testen. Cellijnen reageren anders op het laden van kralen. En zo kan het aantal en de kracht van de kranen worden aangepast voor een optimale celbelasting terwijl het pealen van de cel wordt geminimaliseerd.

Om de procedure te demonstreren, zullen Matthew Saxton en ik worden vergezeld door onze collega's, Dr. Amanda Cook en Gabriel Galindo. Begin met het meten van ongeveer vijf milliliter glasparels in een conische buis van 50 milliliter. Voeg 25 milliliter van twee molaire natriumhydroxide toe aan de buis en meng voorzichtig gedurende twee uur met behulp van een shaker of een rotor.

Draai de buis met kralen kort in een centrifuge als de kralen in suspensie zijn en decanteer vervolgens de natriumhydroxide met behoud van zoveel mogelijk kralen. Was de kralen grondig met water van celkweekkwaliteit tot de pH neutraal is en decanteer het water elke keer. Gebruik de pH-teststrip op het effluent om een neutrale pH te bevestigen en was de kralen vervolgens twee tot drie keer grondig met 100% ethanol.

Deethanol elke keer decanteren. Droog de kralen en strooi ze tot een dun laagje in een steriele container. Laat de container vervolgens open in een bioveiligheidskast om de kralen een nacht aan de lucht te drogen.

Tik of schud voorzichtig op de container en controleer of de kralen een zanderige textuur hebben zonder klonteren of schilferen om ervoor te zorgen dat de kralen volledig droog zijn. Voeg de kralen toe aan het apparaat en bedek de gehele opening van de kraalhoudkamer met een polypropyleengaas of gelijkwaardig materiaal met openingen van 105 micrometer om de kralen door te laten. Klem het gaas tussen de mannelijke en vrouwelijke uiteinden van een metalen herbruikbare beeldvormingskamer, sluit het vervolgens goed af met de wasachtige film en UV-steriliseer het apparaat gedurende 15 minuten.

Het kralenladerapparaat kan nu worden gebruikt om honderden laadtests uit te voeren. Bewaar het apparaat in een droge container die is uitgedroogd door silicagel of een ander droogmiddelmedium en sluit het af. Als de kralen grondig droog worden en steriliseer de kraallader en vervang deze door verse kralen, zoals eerder aangetoond.

Verwijder het medium uit de cellen en aspirateer voorzichtig al het medium rond de randen van de kamer. Kantel vervolgens de kamer in een hoek van ongeveer 45 graden en verwijder de resterende druppel media in de middelste microput. Pipetteer de kraallaadoplossing voorzichtig op de glazen microput die in het midden van de kamer aanwezig is.

Gebruik het kralenlaadapparaat om een monolaag van glaskralen voorzichtig over de cellen te verspreiden. Zorg ervoor dat de kralen de cellen volledig bedekken. Knijp in de kamer met twee vingers, til hem ongeveer twee centimeter op en breng hem stevig naar beneden met een kracht die ongeveer gelijk is aan het laten vallen van de schaal vanaf die hoogte, voeg het medium voorzichtig terug in de kamer toe door langzaam op de plastic kant van de kamer te pipetteren.

Aspirateer eventuele zwevende kralen zonder de cellen te verstoren, de hele kraalbelastingsprocedure moet relatief snel worden uitgevoerd. De cellen drogen dus niet uit als ze zonder medium zitten. Incubeer vervolgens de cellen 4,5 tot twee uur in de incubator.

Was de cellen vóór het afbeelden drie keer met het medium om kralen en overtollige belastingscomponenten in de laadoplossing te verwijderen. Stel de cellen onmiddellijk of wanneer dit nodig is voor het experiment in beeld met behulp van instructies in het tekstmanuscript. Cellen die met succes werden geladen, hadden bijna altijd Cy3-Pa57 en A488-H3K11ac die de eiwitten samen labelden.

Een microgram plasmide-DNA en coderende GFP en 0,5 microgram Cy3-gelabeld eiwit werd ook in de cellen geïntroduceerd via kraalbelasting uitgedrukt en gevisualiseerd. 40% van de cellen waren kralen geladen met fab-eiwit en 21% van de met kralen geladen cellen drukt het kernbeladen plasmide uit. De met kralen geladen cellen drukten verschillende niveaus van plasmide uit.

Het resultaat van die Fisher-ratiotest toonde aan dat hoewel eiwitten één en twee vergelijkbare intensiteitsverdelingen hadden, elk eiwit een significant kleinere verdeling had dan het plasmide. De niveaus van kralen geladen eiwitten hadden weinig cel-tot-celvariantie en de niveaus van twee gelijktijdig geladen eiwitten waren sterk met elkaar gecorreleerd. Het correct laden van kralen had bijna geen merkbaar effect op het aantal menselijke U2OS-cellen of hun morfologie wanneer het direct voor, direct na en 24 uur na het laden van kralen werd afgebeeld.

Slechte kraalbelasting met overmatige kralen en tapkracht veroorzaakten celverlies, slechte celmorfologie en clusters van kralen die op het dekglas achterbleven. hoewel wordt gedacht dat cellen mechanische schade ondergaan tijdens het laden van kralen, groeiden en prolifereerden cellen in de juiste kraalbelaste kamer. Er werd ook waargenomen dat kralen geladen cellen, celdeling ondergaan.

RPE1 en een HeLa-cellijnen werden geladen met fab om de veelzijdigheid van de kralenlaadtechniek te demonstreren. U2OS-cellen werden ook geladen met een Cy5-RNA 9-mer en Cy3-DNA 28-mer samen. Wanneer u dit protocol probeert, zorg er dan voor dat u alleen een monolaag van kralen aan de cellen toevoegt, omdat te veel kralen ervoor zorgen dat cellen loskomen.

Dus na een korte herstelpost van 30 minuten om kralen te laden, zijn cellen onmiddellijk of uren tot dagen later klaar voor beeldvorming, als de procedure verdere stappen vereist, zoals kleuring, dat kan ook na de herstelperiode worden gedaan.