Directe detectie van isolevuglandinen in weefsels met behulp van een D11 scFv-alkalisch fosfatasefusie-eiwit en immunofluorescentie
5 juli 2021
Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor de meting van isolevuglandinen in weefsels door immunofluorescentie met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde ScFv D11-antilichamen. Hypertensiemodellen bij zowel muizen als mensen worden gebruikt om de stapsgewijze procedures en fundamentele principes uit te leggen die verband houden met isolevuglandinemeting in weefselmonsters.
Isolevuglandinen zijn betrokken bij verschillende ziekten, met name hart- en vaatziekten. Dit protocol is ontwikkeld om isolevuglandinen te detecteren in weefsels met D11 alkalische fosfatase fusie-eiwit en immunofluorescentie. De huidige detectiemethoden zijn duur of vereisen een secundair antilichaam voor een E-tag.
Het vinden van een betrouwbaar secundair antilichaam is moeilijk, maar dit protocol verwijdert de secundaire antilichaamstap. dompel de dia's van in muizen en menselijke paraffine ingebedde weefsels drie keer gedurende vijf minuten onder in xyleen om de weefsels te deparrafiniseren. Voor het rehydrateren van het weefsel, was de weefsels twee keer met 95% ethanol, gevolgd door twee wasbeurten met 70% ethanol en vervolgens twee keer met 50% ethanol bereid in water.
Was de dia's drie keer in tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 door de diahouder te vullen met TBST. Gooi vervolgens de TBST weg. Plaats de dia's in een voorverwarmde natriumcitraatbuffer en incubeer in een snelkookpan die op hoge druk is ingesteld op vier minuten, voor een totale ophaaltijd van 20 minuten.
Verwijder aan het einde van de incubatie de dia's uit de snelkookpan en laat ze 20 minuten afkoelen bij kamertemperatuur. Geef drie snelle wasbeurten op dia's met TBST zoals gedemonstreerd. Blokkeer de dia's door 2% BSA opgelost in TBST toe te voegen.
Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gooi na incubatie de blokkeringsbuffer weg. Voeg 200 microliter D11 alkalische fosfatase bereid in TBST toe aan de dia's en bedek de dia's met paraffinetape.
Na het incuberen van de dia's in een bevochtigde kamer gedurende drie uur op kamertemperatuur, was u de dia's drie keer met TBST. Ontwikkel de dia's met een calorimetrische alkalische fosfatase-ontwikkelaar voor immunohistochemie, of een fluorescerende alkalische fosfatase-ontwikkelaar voor immunofluorescentie. Was dia's eenmaal met TBST om de overtollige ontwikkelaar te verwijderen en verdere kleurontwikkeling te voorkomen.
Contrakleur de dia's met één microgram per milliliter HEX-kernvlek bereid in PBS voor immunofluorescentie. Was de dia's vervolgens een keer met TBST om overtollige tegenvlekken te verwijderen. Gebruik het montagemedium om de afdekplaat op de ontwikkelde dia's te plaatsen.
Observeer de dia's onder een omgekeerd licht microscoop voor immunohistochemie, of een confocale fluorescerende microscoop voor immunofluorescentie. Vier negatieve controle-experimenten kunnen worden uitgevoerd om de specificiteit van D11 AP-kleuring voor isolevuglandine te bevestigen. Incubeer in het eerste negatieve controle-experiment de weefsels met D11 AP verdund in TBST, of TBST alleen.
Incubeer vervolgens de weefsels met verdund D11 AP en bacterieel pariplasmatisch extract verdund in TBST zonder de D11 AP-linker. Bereid voor de competitieve test isoLG en isoLG geadduceerd tot muizenserumalbumine voor in een molaire verhouding van acht op één. Verdun D11 AP één tot 10 in TBST.
Incubeer vervolgens de verdunde D11 AP met 50 microgram per milliliter isolevuglandine-geadduceerde MSA, of niet-geadduceerde MSA gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg D11 AP met isolevuglandine MSA of D11 AP met niet-geadduceerde MSA toe aan weefsels voor kleuring. Gebruik een relevant enkelvoudig fragment variabel antilichaam D20 om de weefsels voor de uiteindelijke negatieve controleset te kleuren.
Immunofluorescentie van de aorta bij hypertensieve en normotensieve muizen werd bestudeerd met behulp van dit protocol. Kleuring met D11 AP duidde op een verhoogde concentratie van isoLGs in de aorta van muizen met angiotensine II-geïnduceerde hypertensie in vergelijking met de controlemuizen. De D11 AP werd gebruikt om de isolevuglandinen te detecteren die aanwezig zijn in de darmweefsels van menselijke patiënten met hypertensie en normotensieve mensen.
De weefsels van de patiënten met hypertensie hadden verhoogde concentraties isolevuglandinen. Weefsels werden gekleurd met pariplasmatisch extract en zonder D11 AP. De helderdere kleuring werd waargenomen in het weefsel gekleurd met D11 AP in vergelijking met het pariplasmatisch extract-gekleurd weefsel, wat bevestigt dat de kleuring niet te wijten was aan de niet-geconjugeerde bacteriële alkalische fosfatase aanwezig in het pariplasmatisch extract. In de competitieve test vertoonde het weefsel gekleurd met D11 AP voorgeïncubeerd met de isoLG-concurrent verminderde kleuring, vergelijkbaar met de kleuring waargenomen in weefsels met D11 AP, die specificiteit vertoont voor D11 AP voor isolevuglandinen.
In de negatieve controle resulteerde kleuring van de muisaorta met D11 AP in sterke kleuring in vergelijking met D20, wat wijst op de specificiteit van D11 AP voor isolevuglandinen in de hypertensieve aorta. Het is belangrijk om endogene alkalische fosfatase in weefsel te inactiveren om achtergrondkleuring te beperken.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methodologie voor het meten van isolevuglandines in weefselmonsters met behulp van immunofluorescentie met een alkalische fosfatase-geconjugeerd D11-antilichaam. Met gebruik van hypertensiemodellen bij muizen en mensen worden stapsgewijze procedures beschreven om de betrouwbaarheid van de detectie van isolevuglandines te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Cardiovasculaire ziekten
- Immunologie
- Weefselanalyse
Achtergrond
- Isolevuglandinen zijn betrokken bij verschillende ziekten, voornamelijk cardiovasculaire aandoeningen.
- Huidige detectiemethoden vereisen secundaire antilichamen, wat het protocol compliceert.
- Deze studie vereenvoudigt het proces door de behoefte aan een secundair antilichaam weg te laten.
Gebruikte methoden
- Immunofluorescentie met gebruik van D11 alkalische fosfatase-fusie-eiwit
- Muis- en menselijke weefselmonsters
- Stapsgewijs protocol met details over weefselpreparatie, antigeenherstel en kleuring
Belangrijkste resultaten
- D11 AP-kleuring wees op hogere niveaus van isolevuglandines in hypertensieve aorta's vergeleken met controles.
- Weefsels van menselijke patiënten vertoonden eveneens verhoogde isolevuglandineconcentraties bij hypertensieve individuen.
- De specificiteit van D11 AP werd bevestigd door middel van diverse controle-experimenten.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een betrouwbare methode voor het detecteren van isolevuglandines, wat waardevolle instrumenten bijdraagt aan cardiovasculair onderzoek.
- De bevindingen onderstrepen de relevantie van isolevuglandines bij hypertensie en aanverwante ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De detectie van reactieve lipidmediatoren zoals isolevuglandines in weefsels is cruciaal voor het begrijpen van inflammatoire pathways bij cardiovasculaire aandoeningen. Huidige methoden zijn arbeidsintensief en kostbaar, wat de doorvoer bij targetvalidatie en mechanistische studies beperkt. Deze immunofluorescente methode maakt directe, specifieke visualisatie van IsoLG-accumulatie mogelijk, wat hypothesegestuurde screening en translationele biomarkerexploratie bij hypertensie en aanverwante pathologieën ondersteunt.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de vorming van IsoLG-eiwitadducten te onderzoeken als mechanistische readout van lipideperoxidatie in ziektemodellen.
- Operationele waarde: Biedt een directe imaging-benadering die de noodzaak van secundaire antilichamen omzeilt, waardoor de complexiteit en variabiliteit van de assay worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt target de-risking door de accumulatie van IsoLG te koppelen aan hypertensieve fenotypes in menselijk weefsel en muisweefsel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve fluorescentieresultaten voor de lokalisatie van IsoLG in weefselcompartimenten.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een alkalische fosfatase-developer die compatibel is met zowel chromometrische als fluorescentiedetectie, wat zorgt voor flexibiliteit van het platform.
- Schaalbaarheid: Compatibel met in paraffine ingebedde weefselarchieven, wat retrospectieve analyse van klinische monsters faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Aangetoonde werkzaamheid in zowel hypertensieve muismodellen als menselijke patiëntweefsels ondersteunt de validiteit tussen verschillende soorten.
- Afstemming van biomarkers: Maakt evaluatie van de IsoLG-last mogelijk als een potentiële translationele biomarker voor oxidatieve stress bij hart- en vaatziekten.
- Mechanische risicoreductie: Maakt visualisatie van target engagement in pathofysiologische contexten mogelijk, wat de causale inferentie bij targetvalidatie versterkt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses tot preklinische validatie, in het bijzonder voor oxidatieve stressroutes in cardiovasculaire programma's.
- Discovery Biology: Ondersteunt de functionele validatie van IsoLG-gerelateerde mechanismen door directe detectie in relevante weefsels mogelijk te maken.
- Screening: Genereert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs die geschikt zijn voor assay-standaardisatie tussen laboratoria.
- Analytics: Levert ruimtelijke en op intensiteit gebaseerde read-outs die de vergelijking van IsoLG-accumulatie onder verschillende experimentele condities vergemakkelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt preklinische bevindingen met menselijke weefselanalyse, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar immunohistochemie/immunofluorescentie-platform voor de detectie van lipide-adducten dat toepasbaar is op diverse ziektebeelden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in IsoLG-gemedieerde proteïne-crosslinking en inflammatie.
- Operationele waarde: Elimineert de afhankelijkheid van secundaire antilichamen, wat de workflow vereenvoudigt en variabiliteit tussen reagentia-lots vermindert.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go beslissingen mogelijk door duidelijke, specifieke read-outs van biomarkers voor oxidatieve stress te leveren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van targets die betrokken zijn bij lipideperoxidatieroutes.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentiemicroscopie en protocollen voor weefselverwerking.
- Afhankelijk van toegang tot alkalische fosfatase-ontwikkelsystemen en geschikte microscopie (confocaal of geïnverteerd).
- Vereist standaardisatie van blokkerings-, antigeenherstel- en wasstappen tussen gebruikers.
- Aanpassing aan vers-bevroren of cryogesneden weefsels kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Endogene alkalische fosfatase-activiteit moet worden geïnactiveerd om het achtergrondsignaal te minimaliseren.
