Name: Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer hoe je geoxideerde cysteïneresten in eiwitten identificeert en kwantificeert met harsondersteunde vangst en isobare tandemmassalabeling. Deze methode biedt betrouwbare site-specifieke data voor redoxbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Delen van het werk werden ondersteund door NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 en U24 DK112349

Alle in het protocol beschreven procedures met betrekking tot dierlijke of menselijke monsters/weefsels werden goedgekeurd door en volgden de institutionele richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek bij mens en dier.
1. Homogenisatie/lysis van het monster
<ol><li>Ingevroren weefselmonsters<ol><li>Gehakt bevroren weefsel (~ 30 mg) op een glazen microscoop glaasje op droogijs met behulp van een vooraf gechilleerd scheermesje en een tang. Breng het gehakte weefsel over in een vooraf gegraveerde buis van 5 ml rondbodempolystyreen met 700 μL buffer A (zie tabel 1) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.</li>
		<li>Verstoor het weefsel gedurende 30 s of totdat het volledig is gehomogeniseerd met een handgezogenheidshomogenisator. Leg de monsters op ijs en laat het schuim nog 10 minuten zakken. OPMERKING: Een aluminium bakplaat geplaatst op droogijs biedt een stabiel werkoppervlak en platform voor de eerste verwerking / gehakt van het weefsel.</li>
	</ol></li>
	<li>U kunt ook aanhangende celculturen gebruiken in 100 mm kweekschalen als uitgangsmateriaal.<ol><li>Houd de cellen op ijs en gebruik een serologische pipet om de cellen tweemaal te spoelen met 10 ml ijskoude PBS met 100 mM NEM.</li>
		<li>Lyseer de cellen door 1 ml koude homogenisatie/ lysisbuffer toe te voegen en krachtig te schrapen met een stijve celschraper. Breng het lysaat over in een centrifugebuis van 2 ml met behulp van een micropipette. OPMERKING: Spoelbuffer en lysisbuffer kunnen worden geschaald op basis van kweekvaten van verschillende grootte. Meestal zijn 2-5 miljoen cellen nodig; dit varieert echter afhankelijk van de lysis-efficiëntie en eiwitopbrengst voor specifieke celtypen. Homogenisatiebuffer kan zonder NEM worden bereid voor monsters die worden geanalyseerd op totale thiolen.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng het resulterende homogenaat (stap 1.1.2 of 1.2.2) over in een centrifugebuis van 2 ml met behulp van een micropipette en centrifugeer op volle snelheid (≥16.000 × g) bij 4 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Breng het supernatant (~ 700 μL of ~ 1 ml voor celkweek) over met behulp van een micropipette naar een conische microcentrifugebuis van 5 ml en incubeer gedurende 30 minuten bij 55 °C in het donker met schudden bij 850 tpm.</li>
	<li>Voeg met behulp van een glazen serologische pipet 4 ml ijskoude aceton toe aan de monsters en incubeer bij -20 °C 's nachts voor precipitatie van eiwit en verwijdering van overtollig N-ethylmaleimide.</li>
</ol>2. Harsondersteunde afvang
<ol><li>Was de neergeslagen eiwitkorrels tweemaal met aceton door gedurende 10 minuten te centrifugeren op 20.500 × g bij 4 °C, de aceton te decanteren, eventuele resterende aceton te verwijderen met behulp van een micropipette en 3 ml verse, ijskoude aceton toe te voegen met behulp van een glazen serologische pipet. Keer meerdere keren om om te mengen. Laat de pellets na de tweede wasbeurt 1-2 minuten aan de lucht drogen, zorg ervoor dat u niet te veel droogt, omdat resuspensie moeilijk kan worden.</li>
	<li>Voeg met behulp van een micropipette 1 ml buffer B toe (zie tabel 1) en verzacht het eiwit met herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een vermogen van 250 W en korte vortexing. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchonininezuur (BCA) assay volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Om de eiwitconcentraties in monsters te standaardiseren voor verdere verwerking en volledige verwijdering van NEM te garanderen, brengt u 500 μg eiwit over naar een centrifugaalfilter van 0,5 ml 10 kDa met behulp van een micropipette en past u het aan een laatste volume van 500 μL aan met resuspensiebuffer.</li>
	<li>Centrifugeer bij 14.000 × g bij kamertemperatuur totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 μL bedraagt. Verzamel de monsters door het filter in een opvangbuis om te keren. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 2 minuten en stel het in op een eindvolume van 500 μL met buffer C (zie tabel 1).</li>
	<li>Verminder de eiwitthiolen door 20 μL van 500 mM dithiothreitol (DTT) met behulp van een micropipette toe te voegen tot een eindconcentratie van 20 mM en de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen tijdens het schudden bij 850 rpm.</li>
	<li>Breng de monsters na reductie met behulp van een micropipette over op 0,5 ml 10 kDa centrifugaalfilters en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 × g bij kamertemperatuur of totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 μL bedraagt. Voeg buffer D (zie tabel 1) toe om het volume in het centrifugaalfilter op 500 μL te brengen.<ol><li>Herhaal de centrifuging en toevoeging aan 500 μL in stap 2.6 drie keer en verzamel na de vierde centrifugatie de monsters door het filter in een verzamelbuis om te keren en gedurende 2 minuten te centrifugeren bij 1.000 × g .</li>
	</ol></li>
	<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Bereid tijdens deze bufferuitwisseling de thiolaffiniteitshars voor door de juiste hoeveelheid hars (30 mg/monster) te wegen met behulp van een microbalans en over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml. Voeg vervolgens met behulp van een serologische pipet water toe voor een uiteindelijke concentratie van 30 mg / ml hars en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met agitatie voor een goede hydratatie van de hars. OPMERKING: De hierboven genoemde thiolaffiniteitshars is door de fabrikant stopgezet. Een mogelijke vervanging voor deze thiolaffiniteitshars is in de handel verkrijgbaar. Deze vervanging heeft echter een bijna 5-voudig minder bindingscapaciteit (zie Aanvullende informatie). Als alternatief kan de thiolaffiniteitshars worden gesynthetiseerd met behulp van 2-(pyridyldithio) ethylaminehydrochloride en N-hydroxysuccinimide-geactiveerde hars (zie Aanvullende informatie).<ol><li>Na hydratatie van de hars plaatst u de spinkolommen op een vacuümspruitstuk en brengt u 500 μL van de harsbrij met behulp van een micropipette over naar elke kolom. Breng vacuüm aan voor het verwijderen van water; herhaal deze stap eenmaal om in totaal 30 mg hars per kolom te verkrijgen. U kunt ook centrifugeren op 1.000 × g gedurende 2 minuten in plaats van hiervoor het vacuümspruitstuk en alle harswas- en elutiestappen te gebruiken. OPMERKING: Het snijden van het uiteinde van een pipetpunt van 1000 μL om de boring te vergroten, helpt bij de overdracht van de hars. Het is belangrijk om te tritureren tussen pipetteren om ervoor te zorgen dat de hars gesuspendeerd blijft en homogene en gelijke hoeveelheden hars worden overgebracht naar elke kolom.</li>
		<li>Was de hars door 500 μL ultrapuur water toe te voegen met een micropipette en vacuüm toe te passen voor het verwijderen van het water; herhaal dit 5 keer. Was de hars vervolgens 5 keer met 500 μL buffer E (zie tabel 1). OPMERKING: Als alternatief kan centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten worden gebruikt in plaats van een vacuümspruitstuk voor alle volgende wasstappen. Alle lopende wasstappen worden uitgevoerd met een volume van 500 μL. Voeg bij het toevoegen van wasbuffers aan de kolom voorzichtig toe met voldoende kracht om de hars volledig te resuspenderen terwijl spatten en verlies van hars worden vermeden; dit maakt het mogelijk om hars volledig en efficiënt te wassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng met behulp van een micropipette 150 μg eiwit van elk gereduceerd monster over naar een nieuwe buis en pas het aan tot een eindvolume van 120 μL buffer C (zie tabel 1). Breng de eiwitoplossing met behulp van een micropipette over op een verstopte spinkolom met de hars, plaats de dop op de kolom en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm.</li>
	<li>Was de hars vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M ureum; gevolgd door vijf keer met 2 M NaCl; gevolgd door vijf keer met 80% acetonitril (ACN) met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA); en ten slotte vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,7, zoals beschreven in stap 2.8.2 en vervang de stekker. OPMERKING: Monsters kunnen hier worden geëlueerd voor analyse op eiwitniveau (bijv. SDS-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE), western blot) zoals beschreven in stap 4.1.</li>
</ol>3. Tryptische vergisting op hars en TMT-etikettering
<ol><li>Bereid voldoende gemodificeerde trypsineoplossing van sequencingkwaliteit voor 6-8 μg per monster door deze op te lossen in een concentratie van 0,5 μg/μL in buffer C (zie tabel 1), zodat het uiteindelijke volume ten minste 120 μL per monster toelaat. Voeg met behulp van een micropipette 120 μL van deze trypsine-oplossing toe aan de monsters en incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 850 tpm. OPMERKING: Om de verteringsefficiëntie te verhogen, kan de volgende dag een extra verteringsstap worden opgenomen door de trypsine-oplossing te verwijderen en te vervangen door een verse oplossing en de spijsvertering gedurende 2 uur voort te zetten.</li>
	<li>Was de hars vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,0; gevolgd door vijf keer 2 M NaCl; gevolgd door vijf keer met 80% ACN met 0,1% TFA; gevolgd door driemaal met 25 mM HEPES, pH 7,7. Was de hars ten slotte twee keer met 50 mM triethylammoniumbicarbonaatbuffer (TEAB) en vervang de plug.</li>
	<li>Bereid TMT-etiketteringsreagentia voor door ze eerst te laten opwarmen tot kamertemperatuur voordat ze kort worden afgecentrifugeerd met behulp van een centrifuge van 16.000 × g. Voeg 150 μL watervrij ACN toe aan elke injectieflacon met TMT-etiketteringsreagens met behulp van een micropipette. Incubeer de injectieflacons bij kamertemperatuur op een thermomixer die gedurende 5 minuten op 850 tpm is ingesteld om het reagens volledig op te lossen. Kort vortex en spin naar beneden bij 16.000 × g om het reagens te verzamelen.</li>
	<li>Voeg met behulp van een micropipette 40 μL 100 mM TEAB toe aan de gewassen hars, voeg vervolgens 70 μL van het opgeloste TMT-reagens toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm. Bewaar eventueel achtergebleven TMT-reagens bij -80 °C. OPMERKING: Let op de afzonderlijke TMT-labels die aan elk biologisch monster zijn toegewezen (figuur 1).</li>
	<li>Was de hars vijf keer met 80% ACN met 0,1% TFA, drie keer met 100 mM ammoniumbicarbonaatbuffer (ABC), pH 8,0 en tweemaal met water zoals eerder beschreven en vervang de plug.</li>
</ol>4. Peptide-elutie
<ol><li>Eluteer de gelabelde peptiden door 100 μL van 20 mM DTT in 100 mM ABC, pH 8,0, aan elke kolom toe te voegen met behulp van een micropipette en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een thermomixer ingesteld op 850 rpm. OPMERKING: Na de toevoeging van DTT zal de hars klonteren. De hars kan worden verstoord met een pipetpunt om klonten te breken en de volledige elutie van de peptiden te garanderen.</li>
	<li>Plaats na deze incubatie de kolom op een vacuümspruitstuk dat bedoeld is voor vastefase-extractie (SPE), breng vacuüm aan en elueerde de monsters in een microcentrifugebuis van 5 ml. Herhaal deze stap eenmaal.</li>
	<li>Voeg ten slotte 100 μL 80% ACN toe met 0,1% TFA, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en eluut in dezelfde centrifugebuis van 5 ml. Verzamel alle fracties in dezelfde microcentrifugebuis van 5 ml. OPMERKING: Om monsterverlies te voorkomen, moeten buizen met een lage binding worden gebruikt voor elutie en moeten volumes op of onder een volume van 4,0 ml worden gehouden voor een enkele buis van 5 ml.</li>
	<li>Plaats de geëlueerde monsters in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar de droge peptiden bij -80 °C en resuspen ze later. OPMERKING: Monsters kunnen ook afzonderlijk worden geëlueerd en een aliquot kan worden verwijderd en geanalyseerd door SDS-PAGE voor analyse op peptideniveau voordat de monsters worden gecombineerd.</li>
</ol>5. Peptide-alkylering en ontzilting/sanering
<ol><li>Resuspendeer de gedroogde peptiden door een klein volume van 100 mM ABC-buffer, pH 8,0 (niet groter dan 500 μL), toe te voegen met behulp van een micropipette. Gebruik herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een vermogen van 250 W en vortex om op te lossen en over te brengen naar een buis van 2 ml. OPMERKING: Het volume van 100 mM ABC, pH 8,0 dat moet worden toegevoegd, is gebaseerd op het volume dat nodig is om de DTT te resuspenderen bij een molariteit van 150 mM. Gebruikers moeten de hoeveelheid DTT in hun steekproef bepalen op basis van wat oorspronkelijk in stap 4.1 is toegevoegd.</li>
	<li>Voeg voldoende geconcentreerde stamoplossing (600 mM) jodoacetamide (IAZ) opgelost in ABC toe met behulp van een micropipette om een 1:4 molaire verhouding van DTT:IAZ te bereiken en incubeer de monsters bij RT gedurende 1 uur met schudden bij 850 tpm.</li>
	<li>Verzuur de monsters tot pH-< 3 door geconcentreerde TFA (10%) toe te voegen met behulp van een micropipette en monsterontzilting uit te voeren met behulp van omgekeerde fasereiniging volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Plaats de schone peptiden in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar de droge peptiden bij -80 °C tot verdere analyse.</li>
</ol>6. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie
<ol><li>Resuspendeer de gedroogde peptiden door herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een output van 250 W en vortexing in 20-40 μL water met 3% ACN. Bepaal de peptideconcentratie door een BCA-test uit te voeren volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Scheid de monsters door omgekeerde fase LC en MS/MS zoals eerder beschreven6 en noteer de MS1-spectra over het m/z-bereik van 400-2000. Zorg ervoor dat hoogenergetische botsingsdissociatie (HCD) wordt gebruikt om informatie over de ionenintensiteit van reporters te verkrijgen voor de analyse van isobarisch gelabelde peptiden. Zie de methodensecties van eerdere rapporten voor meer informatie over instrumentruncondities27,30 en de analyse van MS-gegevens27,31. OPMERKING: Verschillende LC-MS/MS-systemen of -instellingen kunnen worden gebruikt om de peptidemonsters te analyseren. De dekking en gevoeligheid van peptide-identificatie is afhankelijk van het specifieke systeem en de gebruikte instellingen.</li>
</ol>

<ol><li>Sies, H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+%28ROS%29+as+pleiotropic+physiological+signalling+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).</li>
<li>Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+nitrogen+species+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive nitrogen species in cellular signaling.</a> Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).</li>
<li>Olson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+legacy+of+sulfur%3A+A+roadmap+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824(2021).</li>
<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+eustress%3A+on+constant+alert+for+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis.</a> Redox Biology. 41, 101867(2021).</li>
<li>Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+thiols+and+cysteines+in+redox+biology+and+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry.</a> Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+light%2Fdark+modulation+of+thiol+oxidation+in+cyanobacteria+revealed+by+quantitative+site-specific+redox+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).</li>
<li>Shi, X., Qiu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+S-nitrosylation+of+proteins+in+regulating+cardiac+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress.</a> Antioxidants. 9 (11), 1051(2020).</li>
<li>Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteines+as+redox+molecular+switches+and+targets+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cysteines as redox molecular switches and targets of disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167(2017).</li>
<li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+redox+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The redox proteome.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).</li>
<li>Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+reactivity+across+the+subcellular+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cysteine reactivity across the subcellular universe.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).</li>
<li>Skryhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cysteine+residues+in+redox+regulation+and+protein+stability+of+Arabidopsis+thaliana+starch+synthase+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1.</a> PLoS One. 10 (9), 0136997(2015).</li>
<li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+redox+proteome+and+phosphoproteome+analysis+reveals+redox+switch+in+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt.</a> Nature Communications. 10 (1), 5486(2019).</li>
<li>Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+conformation-specific+protein-protein+interactions+of+the+2-cysteine+peroxiredoxin+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis.</a> Antioxidants. 9 (6), 515(2020).</li>
<li>Pace, N. J., Weerapana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-binding+cysteines%3A+diverse+functions+and+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs.</a> Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).</li>
<li>Schwartz, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+EGFR+inhibitor+analysis+reveals+importance+of+reversible+interactions+to+potency+and+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173(2014).</li>
<li>Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-based+transcriptional+regulation+in+prokaryotes%3A+revisiting+model+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).</li>
<li>Topf, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+redox+switches+for+global+translation+modulation+by+mitochondrially+produced+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species.</a> Nature Communications. 9 (1), 324(2018).</li>
<li>Gao, X. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+redox+thiol+switch%3A+implications+for+cellular+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).</li>
<li>Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+protein+post-translational+modification+site+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).</li>
<li>Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cellular+oxidative+stress+response+by+stoichiometric+redox+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).</li>
<li>Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-nitrosylation%3A+a+physiological+signal+for+neuronal+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide.</a> Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).</li>
<li>Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+mapping+cysteine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for mapping cysteine oxidation.</a> Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).</li>
<li>Li, R., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin+switch+assays+for+quantitation+of+reversible+cysteine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation.</a> Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resin-assisted+enrichment+of+thiols+as+a+general+strategy+for+proteomic+profiling+of+cysteine-based+reversible+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+comparative+proteome+analysis+using+a+quantitative+cysteinyl-peptide+enrichment+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochiometric+quantification+of+the+thiol+redox+proteome+of+macrophages+reveals+subcellular+compartmentalization+and+susceptibility+to+oxidative+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations.</a> Redox Biology. 36, 101649(2020).</li>
<li>Mitchell, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+pyruvate+kinase+M2+by+cysteine+oxidation+and+S-nitrosation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation.</a> Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).</li>
<li>Campbell, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+mitochondrial+function+with+SS-31+reverses+age-related+redox+stress+and+improves+exercise+tolerance+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice.</a> Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+protein+S-glutathionylation+reveals+redox-dependent+regulation+of+macrophage+function+during+nanoparticle-induced+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress.</a> ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+thiol+oxidation+in+the+rat+lung+following+e-cigarette+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure.</a> Redox Biology. 37, 101758(2020).</li>
<li>Kramer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatiguing+contractions+increase+protein+S-glutathionylation+occupancy+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle.</a> Redox Biology. 17, 367-376 (2018).</li>
<li>Chiao, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-life+restoration+of+mitochondrial+function+reverses+cardiac+dysfunction+in+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice.</a> Elife. 9, 55513(2020).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+site-specific+reactivity+profiling+of+S-nitrosylation+in+mouse+skeletal+muscle+using+cysteinyl+peptide+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry.</a> Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+and+quantification+of+S-glutathionylation+in+mouse+macrophages+using+resin-assisted+enrichment+and+isobaric+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling.</a> Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).</li>
<li>Searle, B. C., Yergey, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+solution+for+resolving+iTRAQ+and+TMT+channel+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk.</a> Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354(2020).</li>
<li>Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+characterization+of+redox-dependent+post-translational+modifications+on+protein+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines.</a> Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).</li>
<li>Behring, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+alterations+in+protein+structure+by+EGF+regulate+cryptic+cysteine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation.</a> Science Signaling. 13 (615), 7315(2020).</li>
<li>Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+cysteine+redoxome+by+iodoacetyl+tandem+mass+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).</li>
<li>Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+reaction+of+N-ethylmaleimide+with+cysteine+and+some+congeners%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).</li>
<li>Hsu, M. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+of+N-ethylmaleimide+on+formyl+peptide-+and+cyclopiazonic+acid-induced+Ca2%2B+signals+through+thiol+modification+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils.</a> Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).</li>
<li>Li, R., Huang, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+total+reversible+cysteine+oxidation+in+an+atherosclerosis+model+using+a+modified+biotin+switch+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+dissection+of+cysteine+oxidative+post-translational+modification+proteome+during+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy.</a> Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).</li>
<li>Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+investigation+of+a+redox+switch+in+the+anti-HIV+protein+SAMHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1.</a> Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

Harsondersteunde afvang is gebruikt in een verscheidenheid aan monstertypen en biologische systemen voor het onderzoek naar oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen 25,29,30. Deze methode maakt de evaluatie van monsters op meerdere niveaus en uitlezingen mogelijk, waaronder eiwitten en peptiden met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse, evenals individuele cysteïnesites met behulp van massaspectrometrie. Ongeacht het m...

Onder homeostatische omstandigheden genereren cellen reactieve zuurstof-, stikstof- of zwavelsoorten die helpen om processen te vergemakkelijken, zoals metabolisme en signalering 1,2,3, die zich uitstrekken tot zowel prokaryoten als eukaryoten. Fysiologische niveaus van deze reactieve soorten zijn noodzakelijk voor een goede cellulaire functie, ook bekend als 'eustress'1,4. Daarentegen kan een toename van oxidanten die leidt tot een onbalans tussen oxidanten en antioxidanten oxidatieve stress of 'distress'1 veroorzaken, wat leidt tot cellulaire schade. Oxidanten transduceren signalen naar biologische routes door verschillende biomoleculen te modificeren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden. In het bijzonder zijn cysteïneresiduen van eiwitten zeer reactieve plaatsen die vatbaar zijn voor oxidatie als gevolg van de thiolgroep op cysteïne, die reactief is op verschillende soorten oxidanten5. Dit geeft aanleiding tot een breed scala aan reversibele redox-gebaseerde posttranslationele modificaties (PTM's) voor cysteïne, waaronder nitrosylatie (SNO), glutathionylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidatie (SSH), polysulfidatie (SSnH), acylering en disulfiden. Onomkeerbare vormen van cysteïne-oxidatie omvatten sulfinylering (SO2H) en sulfonylering (SO3H).
Omkeerbare oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen kunnen beschermende rollen vervullen om verdere onomkeerbare oxidatie te voorkomen of dienen als signaalmoleculen voor stroomafwaartse cellulaire routes 6,7. De omkeerbaarheid van sommige thiol redox PTM's zorgt ervoor dat cysteïneplaatsen kunnen functioneren als "redoxschakelaars"8,9, waarbij veranderingen in de redoxtoestand van deze sites de eiwitfunctie veranderen om hun rol in voorbijgaande processen te reguleren. De modulerende effecten van redox PTM's10 zijn waargenomen in vele aspecten van eiwitfunctie11, waaronder katalyse12, eiwit-eiwitinteracties13, conformatieverandering14, metaalionencoördinatie15 of farmacologische inhibitorbinding16. Bovendien zijn redox PTM's betrokken bij cysteïneplaatsen van eiwitten die routes reguleren zoals transcriptie17, translatie18 of metabolisme19. Gezien de impact die redox PTM's hebben op de eiwitfunctie en biologische processen, is het belangrijk om de mate van oxidatie te kwantificeren die een cysteïneplaats ondergaat als reactie op een verstoring van de redoxtoestand.
De identificatie van cysteïneplaatsen met veranderde redoxtoestanden is gericht op de vergelijking van de oxidatietoestand op het locatiespecifieke niveau tussen normale en verstoorde omstandigheden. Vouwveranderingsmetingen worden vaak gebruikt om te bepalen welke sites aanzienlijk zijn gewijzigd, omdat dit gebruikers helpt te interpreteren welke cysteïnesites fysiologisch significant kunnen zijn voor het onderzoek. Als alternatief geven stoichiometrische metingen van omkeerbare thioloxidatie over een specifiek monstertype een algemeen beeld van de fysiologische toestand met betrekking tot cellulaire oxidatie, een belangrijke meting die vaak over het hoofd wordt gezien en onderbenut. Modificatie stoichiometrie is gebaseerd op het kwantificeren van het percentage gemodificeerde thiol als verhouding tot totaal eiwit thiol (gemodificeerd en ongewijzigd)20,21. Als gevolg hiervan bieden stoichiometrische metingen een nauwkeurigere meting dan vouwverandering, vooral bij gebruik van massaspectrometrie. De betekenis van de toename van oxidatie kan gemakkelijker worden vastgesteld door stoichiometrie te gebruiken om de PTM-bezetting van een bepaalde cysteïneplaats te bepalen. Een 3-voudige toename van thioloxidatie kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een overgang van slechts 1% naar 3% of zo groot als 30% tot 90%. Een 3-voudige toename van oxidatie voor een site die slechts 1% bezetting heeft, kan weinig invloed hebben op de functie van een eiwit; een 3-voudige toename voor een site met 30% bezetting in rusttoestand kan echter meer substantieel worden beïnvloed. Stoichiometrische metingen, wanneer uitgevoerd tussen totaal geoxideerde thiolen en specifieke oxidatieve modificaties, waaronder eiwitgluutathionylering (SSG) en nitrosylering (SNO), kunnen verhoudingen en kwantitatieve informatie onthullen met betrekking tot specifieke modificatietypen.
Omdat reversibele thioloxidatie typisch een posttranslationele modificatie met een lage abundantie is, zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld voor de verrijking van eiwitten die deze modificaties bevatten uit biologische monsters. Een vroege aanpak bedacht door Jaffrey en anderen, genaamd de biotine switch techniek (BST)22, omvat meerdere stappen waarbij ongewijzigde thiolen worden geblokkeerd door alkylering, reversibel gemodificeerde thiolen worden gereduceerd tot ontluikende vrije thiolen, ontluikende vrije thiolen worden gelabeld met biotine en de gelabelde eiwitten worden verrijkt door streptavidin affiniteit pulldown. Deze techniek is in veel studies gebruikt om SNO en SSG te profileren en kan worden aangepast om te onderzoeken op andere vormen van reversibele thioloxidatie23,24. Hoewel BST is gebruikt om te onderzoeken op verschillende vormen van omkeerbare thioloxidatie, is een zorg bij deze aanpak dat verrijking wordt beïnvloed door de niet-specifieke binding van niet-geïnbiotinyleerde eiwitten aan streptavidin. Een alternatieve aanpak die in ons laboratorium is ontwikkeld, genaamd resin-assisted capture (RAC)25,26 (figuur 1), omzeilt de kwestie van verrijking van thiolgroepen via het biotine-streptavidin-systeem.
Na de reductie van reversibel geoxideerde thiolen, worden eiwitten met ontluikende vrije thiolen verrijkt met de thiolaffiniteitshars, die covalent vrije thiolgroepen vangt, waardoor meer specifieke verrijking van cysteïnebevattende eiwitten mogelijk is dan BST. Het koppelen van RAC aan de multiplexingkracht van de recente vooruitgang in isobare etikettering en massaspectrometrie creëert een robuuste en gevoelige workflow voor de verrijking, identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen op proteoombreed niveau. Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben een veel diepere profilering van het thiol redoxproteoom mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van zowel de oorzaak als het gevolg van eiwitthioloxidatieis toegenomen 27. De informatie die wordt verkregen uit locatiespecifieke kwantitatieve gegevens maakt verdere studies mogelijk van de mechanistische effecten en downstream-effecten van omkeerbare oxidatieve modificaties28. Het gebruik van deze workflow heeft inzicht gegeven in de fysiologische effecten van omkeerbare cysteïne-oxidatie met betrekking tot normale fysiologische gebeurtenissen zoals veroudering, waarbij de niveaus van SSG verschilden met betrekking tot leeftijd. De verouderingseffecten op SSG werden gedeeltelijk omgekeerd met behulp van SS-31 (elamipretide), een nieuw peptide dat de mitochondriale functie verbetert en de SSG-niveaus bij oudere muizen verlaagt, waardoor ze een SSG-profiel hebben dat meer lijkt op jonge muizen29.
Van pathofysiologische aandoeningen die worden toegeschreven aan blootstelling aan nanodeeltjes is aangetoond dat SSG betrokken is bij een macrofaagmodel van muizen. Met behulp van RAC in combinatie met massaspectrometrie toonden de auteurs aan dat SSG-niveaus direct gecorreleerd waren met de mate van oxidatieve stress en aantasting van de macrofaagfagocytische functie. De gegevens onthulden ook pathway-specifieke verschillen in reactie op verschillende gemanipuleerde nanomaterialen die verschillende graden van oxidatieve stress induceren30. De methode heeft ook zijn nut bewezen bij prokaryote soorten, waar het werd toegepast om de effecten van dagcyclussen in fotosynthetische cyanobacteriën met betrekking tot thioloxidatie te bestuderen. Brede veranderingen in thioloxidatie in verschillende belangrijke biologische processen werden waargenomen, waaronder elektronentransport, koolstoffixatie en glycolyse. Bovendien werd door orthogonale validatie bevestigd dat verschillende belangrijke functionele locaties werden gewijzigd, wat suggereert dat deze regulerende rollen van deze oxidatieve modificaties6.
Hierin beschrijven we de details van een gestandaardiseerde workflow (figuur 1), die het nut van de RAC-benadering aantoont voor de verrijking van totale geoxideerde cysteïnethiolen van eiwitten en hun daaropvolgende etikettering en stoichiometrische kwantificering. Deze workflow is geïmplementeerd in studies naar de redoxtoestand in verschillende monstertypen, waaronder celculturen 27,30 en hele weefsels (bijv. skeletspieren, hart, longen)29,31,32,33. Hoewel het hier niet is opgenomen, is het RAC-protocol ook gemakkelijk aan te passen voor het onderzoek naar specifieke vormen van omkeerbare redoxmodificaties, waaronder SSG, SNO en S-acylering, zoals eerder vermeld 25,29,34.

```html
<table><tbody><tr><td>2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-101794</td><td>Reagens voor in-house resin synthese</td></tr><tr><td>2.0 mL LoBind centrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>5.0 mL LoBind centrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5.0 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Activated Thiol&ndash;Sepharose&nbsp;4B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8512</td><td>Mogelijke vervanger voor thiol-affiniteit resin</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC5010BK</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonicic acid (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Eiwit Assay Reagens</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20291</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>BioSpec Products</td><td>985370</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetimide (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17-0906-01</td><td>Reagens voor in-house resin synthese</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>Spin columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>69705</td><td></td></tr><tr><td>Strata C18-E reverse phase columns</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S001-DAK</td><td>Peptide desalting</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td></td></tr><tr><td>Thiopropyl Sepharose 6B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0420-01</td><td>Thiol-affiniteit resin; *De productie van Thiopropyl Sepharose 6B resin is gestopt door de fabrikant (zie protocol voor details).</td></tr><tr><td>TMT isobaric labels (16 plex)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A44522</td><td>Peptide labeling reagens; beschikbaar in meerdere formaten</td></tr><tr><td>Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5820</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>vacuum concentrator</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>
```

harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Reversibele oxidatieve modificaties op eiwitthiolen zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke mediatoren van cellulaire functie. Hierin beschrijven we de gedetailleerde procedure van een kwantitatieve redox proteomics-methode die gebruik maakt van resin-assisted capture (RAC) in combinatie met tandem mass tag (TMT) isobare etikettering en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) om multiplexed stochiometrische kwantificering van geoxideerde eiwitthiolen op proteoomniveau mogelijk te maken. De site-specifieke kwantitatieve informatie over geoxideerde cysteïneresiduen biedt extra inzicht in de functionele effecten van dergelijke modificaties. 
De workflow is aanpasbaar voor vele soorten monsters, waaronder gekweekte cellen (bijv. Zoogdier, prokaryote) en hele weefsels (bijv. Hart, long, spier), die aanvankelijk worden gelyseerd / gehomogeniseerd en waarbij vrije thiolen worden gealkyleerd om kunstmatige oxidatie te voorkomen. De geoxideerde eiwitthiolen worden vervolgens gereduceerd en gevangen door een thiolaffiniteitshars, die de workflowstappen stroomlijnt en vereenvoudigt door de lopende verterings-, etiketterings- en wasprocedures uit te voeren zonder extra overdracht van eiwitten / peptiden. Ten slotte worden de gelabelde peptiden geëlueerd en geanalyseerd door LC-MS / MS om uitgebreide stoichiometrische veranderingen te onthullen die verband houden met thioloxidatie in het hele proteoom. Deze methode verbetert het begrip van de rol van redox-afhankelijke regulatie onder fysiologische en pathofysiologische toestanden gerelateerd aan eiwitthioloxidatie aanzienlijk.

Voltooiing van het protocol zal resulteren in zeer specifieke verrijking van voorheen geoxideerde cysteïnebevattende peptiden, vaak met >95% specificiteit 27,35,36. Verschillende belangrijke stappen van het protocol vereisen echter speciale aandacht, bijvoorbeeld de initiële blokkering van vrije thiolen voorafgaand aan monsterlysis / homogenisatie, die kunstmatige oxidatie en niet-specifieke verrijking van kunstmatig geoxideerde...

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Dit protocol beschrijft een methode die locatiespecifieke identificatie van geoxideerde cystineresiduen van eiwitten mogelijk maakt. De methode maakt het mogelijk kwantitatieve en locatiespecifieke gegevens van geoxideerde cystineresiduen te genereren uit verschillende monstertypen. Om de geassisteerde vangstprocedure te starten, wast u de neergeslagen eiwitkorrels tweemaal met aceton door centrifugeren op 20.500 G, in vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Decanteer vervolgens de aceton en verwijder de resterende aceton met een micropipet. Voeg met behulp van een glazen serologische pipet drie milliliter verse ijskoude aceton toe aan de buis en meng goed door de buis meerdere keren om te keren. Laat de pellets na de tweede wasbeurt één tot twee minuten aan de lucht drogen zonder ze te laten drogen.Voeg een milliliter buffer B toe aan de gedroogde eiwitkorrel. Om het eiwit op te lossen, soniceert u de pellet herhaaldelijk in een badsonicator met een vermogen van 250 watt gedurende 15 tot 30 seconden per keer, samen met korte vortexing. Voer de Bicinchoninic acid of BCA assay uit om de eiwitconcentratie te meten.Om de eiwitconcentraties te standaardiseren, brengt u 500 microgram eiwitmonster over naar een centrifugaalfilter van 0,5 milliliter, 10 kilodalton en volume verhoogt u het monster tot 500 microliter met resuspensiebuffer. Centrifugeer het eiwitbuffermengsel bij 14.000 g bij kamertemperatuur, totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 microliter is. Verzamel het monster door het filter in een opvangbuis om te keren.Centrifugeer het monster gedurende twee minuten bij 1000 G en voeg buffer C toe om een eindvolume van 500 microliter te krijgen. Om de eiwitthiolen te verminderen, voegt u 20 microliter 500 millimol dithiothreitol of DTT toe aan het monster om een uiteindelijke concentratie van 20 millimol te krijgen en incubeert u de monsters gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met schudden bij 850 RPM. Na reductie centrifugeert u de monsters tot 0,5 milliliter centrifugaalfilters van 10 kilodalton bij 14.000 G bij kamertemperatuur, totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 microliter bedraagt.Voeg buffer D toe om het volume op te voeren tot 500 microliter en herhaal centrifugatie. Na de vierde centrifugatie verzamelt u de monsters door het filter in een verzamelbuis om te keren om gedurende twee minuten bij 1000 G te centrifugeren. Meet vervolgens de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test.Plaats vervolgens de spinkolommen op een vacuümspruitstuk en breng met behulp van een micropipet 500 microliter van de vers bereide thiolaffiniteitshars slurry over naar elke kolom. Breng vacuüm aan voor het verwijderen van water. Herhaal de procedure eenmaal om 30 milligram hars per kolom te verkrijgen.Was de hars vijf keer met 500 microliter ultrapuur water, door een vacuüm toe te passen om het water te verwijderen en vervolgens vijf keer met 500 microliter buffer E.In een nieuwe buis, voeg buffer C toe aan 150 microgram van het gereduceerde eiwitmonster totdat het uiteindelijke volume 120 microliter is. Breng de eiwitoplossing over in een verstopte spinkolom met de hars. Plaats de dop op de kolom en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm.Was de hars zoals beschreven in het manuscript. Vervang de stekker. Om tryptische vertering op hars uit te voeren, voegt u 120 microliter vers bereide trypsine-oplossing toe aan de monsters en incubeert u de kolom 's nachts bij 37 graden Celsius, met schudden bij 850 RPM.Was de hars de volgende dag meerdere keren zoals beschreven in het manuscript en vervang de plug. Voeg met behulp van een micropipet 40 microliter 100 millimol Triethylammonium bicarbonaatbuffer toe aan de gewassen hars. Voeg vervolgens 70 microliter van de opgeloste tandemmassatag of TMT-etiketteringsreagens toe en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 RPM.Bewaar alle resterende TMT-reagens bij min 80 graden Celsius. Was de hars en vervang de plug. Eluteer de TMT-gelabelde peptiden door 100 microliter 100 millimolar ammoniumbicarbonaatbuffer bij pH 8,0, met 20 millimolar DTT, aan de kolom toe te voegen en de kolom op een thermische mixer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 850 RPM te incuberen.Voer na incubatie elutie uit door de kolom op een vacuümspruitstuk te plaatsen, het vacuüm toe te passen en de monsters in een microcentrifugebuis van vijf milliliter te elueren. Herhaal de stap eenmaal en voeg vervolgens 100 microliter 80% acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur toe aan de kolom. Nadat u de kolom gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur hebt ingecubeerd, elueert u het monster in dezelfde centrifugebuis van vijf milliliter.Plaats de geëlueerde monsters in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar vervolgens de droge peptiden bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. De kwalitatieve analyse van peptidemonsters uit RAW 264,7-cellen werd uitgevoerd met SDS-PAGE, waarbij monsters werden vergeleken door verschillende niveaus van oxidatie als gevolg van behandelingen te bepalen.De gescheiden eiwitten werden vervolgens onderzocht door western blot om de oxidatieniveaus van individuele eiwitten verder te onderzoeken. Gerapporteerde ionenintensiteiten van cystine bevattende peptiden werden geanalyseerd door vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie. De thioloxidatie stoichiometrie van iTRAQ, gelabeld verrijkte en geoxideerde peptiden op individuele cystine site niveaus werden gekwantificeerd.Verwijder aceton voorzichtig zonder de eiwitkorrel te verstoren. Zorg ervoor dat de eiwitpellet volledig nauwkeurig is opgelost en gekwantificeerd en dat hars nauwkeurig wordt toegewezen aan spinkolommen. Zorg ervoor dat u hars resuspendeert tijdens de wasstappen.Verdere evaluatie van verrijkte eiwitten en peptiden kan worden uitgevoerd door SDS-PAGE en kleuring, western blotting en massaspectrometrie.

resin-assisted-capture-coupled-with-isobaric-tandem-mass-tag-labeling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Reactive oxygen species niveau wordt verhoogd wanneer de cellen tegenkomen stress. Hier laten we het voorbeeld van 3'-3 'diaminobenzidine vlekken en cysTMT etikettering en massaspectrometrie om de redox proteoom profileren...

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

We presenteren een geoptimaliseerd tmt-labelprotocol (tandem mass tag) dat gedetailleerde informatie bevat voor elk van de volgende stappen: eiwitextractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering, indiening bij een proteomics-faciliteit en gegevensanalyses.

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten is een opkomende techniek voor de structurele karakterisering van eiwitten. Verschillende oplosmiddel additieven en liganden hebben verschillende hydroxyl radicale opruimeigenschappen. Om de eiwitstructuur in verschillende omstandigheden te vergelijken, is real-time compensatie van hydroxylradicalen die in de reactie worden gegenereerd nodig om reactieomstandigheden te normaliseren.

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Leer hoe je geoxideerde cysteïneresten in eiwitten identificeert en kwantificeert met harsondersteunde vangst en isobare tandemmassalabeling. Deze methode biedt betrouwbare site-specifieke data voor redoxbiologisch onderzoek.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie (Video) | JoVE Journal

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Meer video's verkennen