Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Deze methode maakt het mogelijk om de scheiding van naast elkaar bestaande eiwitsoorten, inclusief verschillende conformers of varianten en online karakterisering van hun hogere orde structuurverschillen, in een enkele CEMS-meting te voltooien. Het maakt gebruik van het elektroforetische effect om een bijna 100% langdurige omgeving te bieden voor de HDX-reacties en orthogonale scheiding van de naast elkaar bestaande eiwitsoorten tijdens HDX voor top-down MS-analyse. Begin met het conditioneren van de capillaire elektroforese, waterstofdeuteriumuitwisseling of CE HDX-opstelling.

Gebruik ultrasone trillingen in een mengsel van 50% methanol, 49% water en 1% mierenzuur, reinig de stroom door de microviale CE-MS-interface gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Monteer het HPC gemodificeerde capillair op de capillaire elektroferese of CE-instrument. Spoel het capillair met achtergrondelektrolytoplossing of BGE gedurende 10 minuten met behulp van de automatische sampler en laat het gevuld met de BGE.

Gebruik een geschikte lengte van ongewijzigde gesmolten silica capillaire buizen als de infusiebuis voor de modifier-oplossing. Gebruik een unie en de juiste hoes om de modifier-slang aan te sluiten op een gasdichte glazen spuit met een stompe temperatuur en spoel de slang met de modifier-oplossing gedurende ten minste 10 minuten met behulp van een infusiepomp. Plaats de uitgangen van de HPC-gecodeerde CE-capillaire en modifierbuizen geladen met de bijbehorende oplossingen in de gereinigde CE-MS-interface.

Plaats de spuit met de infusiepompen zodanig dat de modifieroplossing de punt van de interface bereikt. Monteer de geassembleerde CE-MS-interface op een nano-elektronensproei-ionisatiebronbehuizing van een massaspectrometer. Breng een spuitspanning van 3-5 kilovolt aan op de CE-MS interface.

Injecteer de modifier-oplossing met de infuserpomp met een debiet van 0,1-10 microliter per minuut en zorg voor een stabiele elektrospray aan de punt van de CE-MS-interface. Plaats de injectieflacon met het monster met de BGE en de automatische sampler, die later zullen worden gebruikt om blanco-elektroferogrammen en blanco massaspectra te verkrijgen. Schat het injectievolume met behulp van de relatie tussen het injectievolume en de injectieparameters.

En injecteer de monsteroplossing met behulp van de automatische sampler bij twee PSI voor een geschikte duur. Start de CE-scheiding door een elektroforetische spanning van 20 kilovolt toe te passen in een infusiedruk variërend van 0-2 PSI en verkrijg het elektroferogram. Verwerf ondertussen de MS-gegevens in de chromatografische modus waarbij de ionenstroomgrafiek wordt verkregen als functie van de tijd en de bijbehorende MS-scans niet automatisch worden gecombineerd in een enkel spectrum.

Sla het lege elektroferogram en massaspectra op als referenties. Plaats de injectieflacons met de gewenste concentraties van de eiwitmonsteroplossingen in de auto sampler en verkrijg de elektroferogrammen en MS1-spectra van de elektroforetisch gescheiden en deuteriumgelabelde eiwitsoort. Voer tandem Ms.-metingen uit voor de soort van belang, hetzij na het verkrijgen van de MS1-spectra binnen dezelfde run of in een volgende afzonderlijke run.

Spoel na elke meting het capillair met BGE bij een druk van 20 PSI gedurende ten minste 10 minuten. Reinig de CEMS-interface en alle slangen voor opslag na voltooiing van de experimenten. Verkrijg een dataset van het HDX-eindpuntmonster met MS in directe infusiemodus.

Een lage infusiedruk resulteerde in een betere scheiding van CE-pieken, maar leidde tot een toename van zowel de migratietijd als de duur van het experiment. Een langere HDX-reactietijd resulteerde in een hogere mate van ontdunning van de eiwitanalyten. De A- en B-variantie van bèta-immunoglobuline of bèta-IG, die verschillen door slechts twee aminozuurresiduen in hun volgorde, gaf aanleiding tot twee adequaat gescheiden pieken in het van de EIC afgeleide elektroferogram.

De differentiële deuterium gelabelde variantie resulteerde in een duidelijke massaverdeling van ionen. Een lager aantal in relatieve abundantie van Z-ionen dan C-ionen werd waargenomen als gevolg van de unieke dysofied koppeling ter bevestiging van bèta-IG die de fragmentatie-efficiëntie tussen CS 82 en CS 176 beperkt. De meeste fragmentionen geproduceerd uit bèta-IGA en bèta-IGB vertonen een vergelijkbare mate van deuteriumopname.

De grotere segmenten die de sequentievariatieplaatsen van bèta-IGA bestreken, werden echter in aanzienlijk grotere mate ontdubbeld dan bèta-IGB. De pH van BGE wordt aangepast aan het iso-elektrische punt van het monster om eiwitaggregatie te voorkomen en scheiding te vergemakkelijken met behoud van het complex.