Name: Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Ontdek de evaluatie van antitumoractiviteit van IL-1α in een syngeneic muismodel voor hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom. Dit protocol helpt onderzoekers de therapeutische potentie en toxiciteit te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Merit Review Award #I01BX004829 uit de Verenigde Staten (VS) Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service en ondersteund door het Mezhir Award-programma via het Holden Comprehensive Cancer Center aan de Universiteit van Iowa.

Alle in vivo procedures die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Iowa.
1. Voorbereiding en onderhoud van HNSCC cellijn
OPMERKING: In deze studie zal de murine orofaryngeale epitheelcellijn stabiel getransformeerd met HPV E6 en E7 samen met hRas en luciferase (mEERL) worden gebruikt. Deze cellijn is ontwikkeld op basis van C57BL/6J muizenstam en was een geschenk van Dr. Paola D. Vermeer (Department of Surgery, University of South Dakota Sanford School of Medicine, South Dakota, USA).
<ol><li>Ontdooi een bevroren injectieflacon met mEERL-cellen in een voorverwarmd (37 °C) waterbad en breng vervolgens over naar een conische buis van 15 ml met warme kweekmedia (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] aangevuld met 40,5% 1:1 DMEM/Hams F12, 10% Foetaal Runderserum [FBS], 0,1% gentamicine, 0,005% hydrocortison, 0,05% transferrine, 0,05% insuline, 0,0014% tri-joodthyronine en 0,005% epidermale groeifactor).</li>
	<li>Centrifugeer de conische buis bij 277 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C om het medium te verwijderen. Resuspenseer vervolgens de celpellet in 3-5 ml verse media en breng deze over naar een T-25 celkweekkolf. Voor optimaal herstel uit bevroren opslag, plaatcellen met hoge dichtheid. OPMERKING: T-25 kolven werden gebruikt vanwege hun kleinere formaat, wat resulteert in snellere hersteltijden van bevroren opslag wanneer cellen zich in de buurt bevinden in vergelijking met T-75 kolven.</li>
	<li>Laat de cellen groeien in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2, uitbreiden naar grotere kolven (d.w.z. T-75 of T-150) en passeer elke 3 dagen. Wanneer er voldoende cellen zijn voor de gewenste implantatie in alle muizen, verwijdert u de kolven, gooit u de media weg en spoelt u de cellen voorzichtig af met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg vervolgens 4 ml toe (bij gebruik van T150-kolven) van 0,25% trypsine-EDTA en incubeer bij 37 °C gedurende 2 minuten. Schaal de hoeveelheid trypsine omhoog of omlaag, afhankelijk van de schaal/ kolfgrootte die wordt gebruikt. OPMERKING: Het type cellijn en de mate van confluentie kunnen de trypsinisatietijden beïnvloeden. Lange trypsinisatieperiodes kunnen cellen beschadigen, wat resulteert in een lage levensvatbaarheid. Gebruik de minimale hoeveelheid tijd die nodig is voor trypsinisatie.</li>
	<li>Onder de microscoop bewegen de losse cellen op trypsinisatie vrij. Als sommige cellen nog vastzitten, tik dan heel voorzichtig op de kolf om de resterende aanhangende cellen te mobiliseren. Voeg verse media toe (schaal de hoeveelheid media naar wens) om de trypsinereactie te stoppen en verzamel de celsuspensie in conische buizen van 50 ml. Centrifugeer bij 277 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C om de media te verwijderen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in verse media en tel de cellen. Centrifugeer nogmaals (zoals hierboven beschreven) en voeg vervolgens koude PBS toe aan de cellen om een uiteindelijke concentratie van 10 × 106 cellen / ml te maken. Houd de celsuspensie(s) op ijs voor injectie aan muizen.</li>
</ol>2. Tumorimplantatie, medicamenteuze behandeling en meting
OPMERKING: De proefdieren werden gehouden in de Animal Care Facility aan de Universiteit van Iowa en volgden de juiste aseptische procedures om ze te behandelen.
<ol><li>Verdoof C57Bl/6J muizen met ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) mix. Scheer het flankgebied of de gewenste injectieplaats zorgvuldig af met een elektrisch scheermes. OPMERKING: Vergeet niet om het gebruik van gereguleerde stoffen te documenteren zoals vereist door institutionele (of andere) regels en voorschriften.</li>
	<li>Desinfecteer het flankgebied met een ethanolpad en injecteer langzaam 100 μL (met 1 x 106 cellen) van de celsuspensie subcutaan met een spuit van 25-28 G. Verdoof de muizen vóór injectie om plotselinge bewegingen en celverlies te voorkomen. Meng vóór elke injectie voorzichtig de celsuspensie om te voorkomen dat cellen zich op de bodem van de injectieflacon of conische buis nestelen.</li>
	<li>Nadat u de celsuspensie in de spuit hebt opgenomen, verwijdert u alle bubbels en dode ruimte van de bovenkant. Injecteer de celsuspensie op een langzame en gestage manier. Gebruik niet dezelfde naald op meerdere muizen. Maak altijd extra celophangingen om rekening te houden met onbedoeld verlies.</li>
	<li>Plaats het dier in hun respectievelijke kooien en controleer ze totdat ze herstellen van de anesthesie. Tijdens de anesthesie lopen dieren het risico op onderkoeling; zorg daarom voor extra warmte of plaats de muizen dicht bij elkaar om warm te blijven (indien gehuisvest in dezelfde kooi).</li>
	<li>Wanneer tumoren 3 mm in elke richting bereiken, randomiseer de muizen (op tumorgrootte en / of gewicht) in de behandelingsgroepen en start vervolgens de medicamenteuze behandeling. Injecteer de muizen intraperitoneaal (i.p.) met NP's15 die 3,75 μg rIL-1α/muis bevatten op dag 4 en 9. Meet en registreer het tumorvolume (lengte x breedte2) / 2) en het muisgewicht dagelijks of om de andere dag totdat de tumorgrootte of de muizen euthanasiecriteria bereiken. OPMERKING: Zelfs met een ervaren onderzoeker is het moeilijk om de tumor van dezelfde grootte in alle muizen te implanteren. Randomiseer dieren in experimentele groepen op basis van de tumorgrootte en het gewicht van de muis.</li>
</ol>3. Bloedafname en serumscheiding
OPMERKING: Bloedafname uit een submandibulaire ader is een eenvoudige en effectieve techniek die bloedafname van bewuste dieren of dieren onder narcose mogelijk maakt. Voor deze studie werd bloed verzameld van de dieren toen ze onder narcose waren.
<ol><li>Verdoof de muizen met een injectie van ketamine/xylazine mix zoals hierboven vermeld.</li>
	<li>Pak de losse huid over de schouder met de niet-dominante hand en prik de submandibulaire ader door met een naald of lancet van 18 G, iets achter de onderkaak (een witte vlek op dat gebied).</li>
	<li>Prik de ader door om de bloedstroom onmiddellijk te garanderen. Verzamel 200-300 μL bloed (afhankelijk van het gewicht van de muis) in een polypropyleen microcentrifugebuis of serumscheiderbuis van 1,5 ml. Breng na bloedafname zachte druk uit op de punctieplaats totdat het bloeden is gestopt. Breng de muizen terug naar hun respectievelijke kooien en observeer totdat ze herstellen van anesthesie. OPMERKING: Verzamel niet meer dan 1% van het lichaamsgewicht van de muis in één verzameling of gedurende een periode van 24 uur.</li>
	<li>Laat het verzamelde bloed 20-30 min op kamertemperatuur stollen. Plaats de buizen op ijs totdat ze klaar zijn om te worden gecentrifugeerd.</li>
	<li>Centrifugeer het gestolde bloed bij 1540 x g gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel de bovenste laag (serum) zonder de rode bloedcellen te verstoren. Bewaren bij -80 °C tot gebruik.</li>
</ol>4. Multiplexen van verzameld serum
<ol><li>Ontdooi het serum of de plasmamonsters terwijl u ze op ijs bewaart.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 1540 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om eventueel celafval te bezinken en verzamel de serumlaag zorgvuldig van bovenaf.</li>
	<li>Haal de multiplex kit op kamertemperatuur tevoorschijn. OPMERKING: Er zijn verschillende in de handel verkrijgbare multiplexkits die zijn ontworpen voor specifieke cytokines, chemokines of groeifactoren. Ook is het mogelijk om de kit aan te passen op basis van het eiwit van belang.</li>
	<li>Voer de test uit volgens het protocol van de fabrikant om cytokines te detecteren. OPMERKING: De meeste multiplexkits gebruiken magnetische kralen om het gevangen antilichaam te binden. Het is dus essentieel om een geautomatiseerde of draagbare magnetische wasmachine te gebruiken tijdens het wassen. Anders zullen de magnetische kralen van de plaat afspoelen en zal men niet genoeg gebeurtenissen hebben om de meting te doen.</li>
</ol>5. Verzameling van tumor en inguinale lymfeklier en voorbereiding van eencellige suspensie
<ol><li>Verdoof de muizen met ketamine/xylazine mix. Om volledige sedatie te garanderen, gebruikt u pedaalreflex (stevige teenknijpen). Als de muizen niet reageren, euthanaseer de muizen dan door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Leg elke muis op zijn rug en spuit 70% ethanol op de buikhuid. Gebruik een tang en een schaar om de tumor uit de linkerkant van de muizen en de lymfeklier vanaf de rechterkant te snijden. Als de tumor groot is, snijd dan in kleine stukjes en neem 500-600 mg van het weefsel. Verzamel voor de lymfeklier het hele orgaan. OPMERKING: Er zijn twee lymfeklieren aan beide zijden van het liesgebied. Afhankelijk van de experimentele doelen kunnen de lymfeklier en de tumor van dezelfde kant worden geïsoleerd. Als de tumor echter erg groot wordt, zal het niet gemakkelijk zijn om de lymfeklier van dezelfde kant te verzamelen.</li>
	<li>Plaats de weefsels op de respectieve dissociatorbuizen met 3-5 ml RPMI-media. Homogeniseer het weefsel met behulp van een geautomatiseerde dissociator. OPMERKING: Andere geautomatiseerde of draagbare homogenisatoren kunnen worden gebruikt.</li>
	<li>Breng na homogenisatie de celsuspensie door een filter van 70 μm over in een conische buis van 50 ml. Centrifugeer bij 277 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C om de media te verwijderen. Was en resuspendeer de cellen in 1-2 ml koude PBS.</li>
</ol>6. FACS-kleuring van eencellige suspensie
<ol><li>Gebruik 0,4% trypan blauwe kleuring om de levensvatbare cellen in een hemocytometer te tellen. Bereken het volume dat nodig is om 2-3 miljoen cellen te krijgen en breng ze over naar de respectieve FACS-buis.</li>
	<li>Gebruik levensvatbaarheidskleurstof om op levende cellen te poort; anders kan een niet-specifieke binding van het antilichaam met dode cellen optreden die een vals-positief resultaat kan opleveren. OPMERKING: Zombiekleurstof werd gebruikt voor levende en dode celkleuring in dit experiment. Verschillende fixeerbare en niet-fixeerbare kleurstoffen (bijv. Propidiumjodide) zijn in de handel verkrijgbaar.</li>
	<li>Centrifugeer (277 x g gedurende 5 min bij 25 °C) de getelde cellen. Decanteer het supernatant en resuspensieer de cellen tot 300 μL PBS. Voeg 0,5-1 μL zombiekleurstof/tube toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in het donker.</li>
	<li>Centrifugeer (277 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C) en was de cellen met 1-2 ml FACS-buffer en resuspenseer ze tot 200 μL FACS-buffer.</li>
	<li>Voeg Fc-receptorblokker toe (2 μL per 200 μL of volgens het protocol van de fabrikant) en incubeer de cellen gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer (277 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C) en was de cellen met 1-2 ml FACS-buffer. Voeg de antilichaamcocktail toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.</li>
	<li>Na de incubatie, centrifugeer (277 x g gedurende 5 min bij 25 °C) en was de cellen met 1-2 ml FACS-buffer. Voeg 300-400 μL 2% paraformaldehyde-oplossing toe en resuspend voor fixatie. Bewaar de cellen bij deze stap een paar dagen bij 4 °C of analyseer onmiddellijk met een veelkleurige flowcytometer.</li>
</ol>

<ol><li>Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+inflammation+by+blocking+interleukin-1+in+a+broad+spectrum+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).</li>
<li>de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+interleukin-1+pathway+in+patients+with+hematological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders.</a> Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).</li>
<li>Veltri, S., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+trials+in+cancer+patients%3A+a+review+of+the+toxicity%2C+antitumor+and+hematopoietic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects.</a> Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).</li>
<li>Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+interleukin-1+alpha+and+cisplatin+in+a+murine+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system.</a> Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).</li>
<li>Curti, B. D., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+in+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 in the treatment of cancer.</a> Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).</li>
<li>Smith, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+treatment+with+interleukin-1+alpha+on+platelet+recovery+after+high-dose+carboplatin%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin.</a> New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).</li>
<li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Carbone, A. L., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+fast-degrading+Poly%28anhydride-esters%29%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters).</a> Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021(2009).</li>
<li>Gopferich, A., Tessmar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+degradation+and+erosion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride degradation and erosion.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).</li>
<li>Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+polyanhydrides+as+localized+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Role of polyanhydrides as localized drug carriers.</a> Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).</li>
<li>Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides: an overview.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).</li>
<li>Goldman, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+human+cell+engraftment+in+mice+deficient+in+RAG2+and+the+common+cytokine+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain.</a> British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).</li>
<li>Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspective+on+in+vivo+molecular+imaging+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells.</a> Molecules. 22 (6), (2017).</li>
<li>Espinosa-Cotton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+alpha+increases+antitumor+efficacy+of+cetuximab+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79(2019).</li>
<li>Veltri, S., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+trials+in+cancer+patients%3A+A+review+of+the+toxicity%2C+antitumor+and+hematopoietic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Oncologist%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects.</a> The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol stelt elke onderzoeker in staat om de antitumoractiviteit en enkele van de onderliggende mechanismen van immunomodulerende geneesmiddelen in een in vivo tumormuismodelsysteem te bestuderen. Hier werd een syngeneisch subcutaan tumormodel gebruikt, dat verschillende voordelen heeft ten opzichte van orthotopische modellen, waaronder het technisch eenvoudige protocol, eenvoudige monitoring van tumorgroei, minder morbiditeit bij dieren en hogere produceerbaarheid. Subcutane tumormodellen kunnen ook worde...

Een van de opkomende gebieden van kankerimmunotherapie is het gebruik van inflammatoire cytokines om het immuunsysteem van patiënten tegen hun tumorcellen te activeren. Verschillende pro-inflammatoire cytokines (d.w.z. interferon-alfa (IFNα), interleukine-2 (IL-2) en interleukine-1 (IL-1)) kunnen een significante antitumorimmuniteit opbouwen, wat interesse heeft gewekt in het onderzoeken van de antitumoreigenschappen en de veiligheid van op cytokine gebaseerde geneesmiddelen. Interleukine-1 alfa (IL-1α) in het bijzonder, is een pro-inflammatoir cytokine dat bekend staat als het hoofdcytokine van ontsteking1. Sinds de ontdekking van dit cytokine in de late jaren 1970, is het onderzocht als een middel tegen kanker en een hematopoëtisch medicijn om de negatieve effecten van chemotherapie te behandelen2. Tijdens de late jaren 1980 werden verschillende preklinische en klinische studies uitgevoerd om de antikankereffecten van IL-1α 3,4,5,6 te bepalen. Deze studies vonden veelbelovende antitumoractiviteit van recombinant IL-1α (rIL-1α) tegen melanoom, niercelcarcinoom en ovariumcarcinoom. Toxiciteiten, waaronder koorts, misselijkheid, braken, griepachtige symptomen en de meest ernstig dosisbeperkende hypotensie werden echter vaak waargenomen. Helaas hebben deze dosisgerelateerde toxiciteiten het enthousiasme voor verder klinisch gebruik van rIL-1α getemperd.
Om te proberen het kritieke probleem van IL-1α-gemedieerde toxiciteiten aan te pakken, zullen polyanhydride nanodeeltjes (NP) formuleringen worden onderzocht die de gecontroleerde afgifte van IL-1α door oppervlakte-erosiekinetiek mogelijk maken. Deze NP-formuleringen zijn bedoeld om de voordelen van de antitumoreigenschappen van IL-1α te plukken en tegelijkertijd dosisbeperkende bijwerkingen te verminderen7. Polyanhydriden zijn door de FDA goedgekeurde polymeren die afbreken door oppervlakte-erosie, wat resulteert in bijna nul-orde afgifte van ingekapselde middelen 8,9,10,11,12. Amfifiele polyanhydride copolymeren die 1,8-bis-(p-carboxyfenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) en 1,6-bis-(p-carboxyfenoxy)hexaan (CPH) bevatten, zijn uitstekende toedieningssystemen gebleken voor verschillende payloads in oncologisch en immunologisch onderzoek 8,12. In het volgende protocol zullen 20:80 CPTEG:CPH NP's geladen met 1,5 wt.% rIL-1α (IL-1α-NP's) worden gebruikt om de antitumoractiviteit en toxiciteit van dit cytokine te bestuderen in een muismodel van HNSCC.
Het algemene doel van de volgende procedures is om de antitumoractiviteit van IL-1α-NP's op HNSCCs te beoordelen. De beschreven procedures, waaronder het beoordelen van tumorgroei en overleving, kunnen worden toegepast op elk immuunmodulerend middel van belang. Deze procedures moeten worden uitgevoerd in een syngene muismodel met een intact immuunsysteem13 om de klinische relevantie te maximaliseren. IL-1α-NP toxiciteit zal ook worden beoordeeld door veranderingen in circulerende niveaus van pro-inflammatoire cytokines en dierlijk gewicht te meten. Er zijn veel methoden om in vivo geneesmiddeltoxiciteit te bepalen; de meest gebruikte methoden omvatten echter de meting van serumenzymen voor orgaantoxiciteit en histologische veranderingen in die organen. Om histologische analyses uit te voeren, moet het dier echter worden opgeofferd, wat de overlevingscurves van het experiment zal beïnvloeden. Daarom zal dit protocol een protocol bevatten voor het verzamelen van bloed van levende muizen voor het meten van cytokines in serummonsters. Het verzamelde serum kan worden gebruikt voor het meten van gewenste serumanalyten voor orgaantoxiciteit. Multicolor flowcytometrie zal worden gebruikt om de veranderingen in de immuuncelpopulatie in de micro-omgeving van de tumor en de migratie van immuuncellen naar de lymfeklier te begrijpen. Andere methoden kunnen worden gebruikt om immuuncellen te identificeren, waaronder immunohistochemie en/of immunofluorescentie van geconserveerde rubrieken14. Deze technieken kunnen echter tijdrovend en vervelend zijn om uit te voeren op een groot aantal dieren. Over het algemeen zullen de volgende methoden onderzoekers in staat stellen om de antitumor immuunrespons en potentiële mechanismen van immunostimulerende middelen voor kankerbehandeling te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Bio-Plex 200 Systems</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Het systeem werd geleverd door de Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care</td></tr><tr><td>Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>M60009RDPD</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Muizen</td><td>Jakson Labs</td><td>664</td><td>4 tot 6 weken oud</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>SRP3196-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>12103C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfaat oplossing</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EPX-55555-000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6909-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Millipore Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine/xylazine</td><td></td><td></td><td>Injecteerbare anesthesie</td></tr><tr><td>MEERL cel lijn</td><td></td><td></td><td>Murine orofaryngeale epitheliale cellen die stabiel HPV16 E6/E7 samen met hRAS en luciferase (mEERL) cellen tot expressie brengen</td></tr><tr><td>Portable Balances</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scienceware&nbsp;Digi-Max&nbsp;glijdschaal</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z503576-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Steriele alcohol voorbereidingspad (70% isopropyl alcohol)</td><td>Cardinal</td><td>COV5110.PMP</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine Human</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tri-iodothyronine</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5516-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride il-1α nanodeeltjes

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokinetherapie is een veelbelovende immunotherapeutische strategie die robuuste antitumor immuunresponsen bij kankerpatiënten kan produceren. Het pro-inflammatoire cytokine interleukine-1 alfa (IL-1α) is geëvalueerd als een middel tegen kanker in verschillende preklinische en klinische studies. Dosisbeperkende toxiciteiten, waaronder griepachtige symptomen en hypotensie, hebben het enthousiasme voor deze therapeutische strategie echter getemperd. Op polyanhydride nanodeeltjes (NP) gebaseerde toediening van IL-1α zou in deze context een effectieve aanpak zijn, omdat dit een langzame en gecontroleerde afgifte van IL-1α systemisch mogelijk kan maken en tegelijkertijd toxische bijwerkingen kan verminderen. Hier wordt een analyse beschreven van de antitumoractiviteit van IL-1α-geladen polyanhydride NP's in een hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) syngene muismodel. Murine orofaryngeale epitheelcellen die stabiel HPV16 E6/E7 tot expressie brengen samen met hRAS- en luciferase (mEERL) cellen werden subcutaan geïnjecteerd in de rechterflank van C57BL/6J-muizen. Zodra tumoren 3-4 mm in elke richting bereikten, werd een 1,5% IL-1a - geladen 20:80 1,8-bis (p-carboxyfenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexaan (CPTEG: CPH) nanodeeltje (IL-1α-NP) formulering intraperitoneaal toegediend aan muizen. Tumorgrootte en lichaamsgewicht werden continu gemeten totdat tumorgrootte of gewichtsverlies euthanasiecriteria bereikte. Bloedmonsters werden genomen om antitumor immuunresponsen te evalueren door submandibulaire venapunctie, en inflammatoire cytokines werden gemeten door middel van cytokine multiplex assays. Tumor- en inguinale lymfeklieren werden gereseceerd en gehomogeniseerd tot een eencellige suspensie om verschillende immuuncellen te analyseren via multicolor flowcytometrie. Deze standaardmethoden zullen onderzoekers in staat stellen om de antitumor immuunrespons en het potentiële mechanisme van immunostimulerende NP's en andere immunotherapiemiddelen voor kankerbehandeling te bestuderen.

In deze studie werd de antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α in een syngene muismodel van HNSCC onderzocht. Recombinant IL-1α (rIL-1α) vertraagde significant de groei van mEERL-tumoren (figuur 1A), hoewel gewichtsverlies werd waargenomen bij de behandelde muizen, dat werd hersteld na stopzetting van de behandeling (figuur 1B). IL-1α-NP's induceerden geen significant antitumoreffect in vergelijking met zoutoplossing of blanco-NP's (figu...

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Deze protocollen bieden een effectieve manier om de antitumoractiviteit van immuunmodulatoraanvallen te bestuderen. Bovendien kan de analyse van de geassocieerde kansen in de circulerende cytokines en immuuncelpopulaties worden gedaan met behulp van deze voorgestelde methoden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een gemakkelijke en ongecompliceerde manier is om een tumor te implanteren en de groei ervan te volgen. De directe implicatie van deze techniek is het beoordelen van de werkzaamheid van bepaalde therapieën of uitdagingen in antikankeronderzoek. Bovendien zijn sommige aspecten van deze technieken geschikt voor toxiciteitsstudies. Ontdooi om te beginnen een bevroren flacon met muizen EERL-cellen in een voorverwarmd waterbad bij 37 graden Celsius en breng ze over in een conische buis van 15 milliliter met warme kweekmedia. Centrifugeer de conische buis op 277 keer G gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius om de media te verwijderen. suspendeer vervolgens het celgehemelte opnieuw in drie tot vijf milliliter verse media en breng het over in een T25-celkweekkolf. Laat de cellen groeien in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, E

evaluation-vivo-antitumor-activity-polyanhydride-il-1

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Type B gelatine-based ontworpen nanovectors systeem (Gens) is ontwikkeld voor systemische genafgifte en transfectie in de behandeling van alvleesklierkanker. Door modificatie met epidermale groeifactor receptor (EGFR) specifieke peptide op het oppervlak van nanparticles, kunnen ze gericht zijn op de EGFR-receptor en laat plasmide onder reducerende omgeving, zoals een hoge intracellulaire glutathion-concentraties.

Gene Levering en Transfectie in Human alvleesklierkankercellen met epidermale groeifactor receptor-gerichte Gelatine-Based Engineered Nanovectors

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. This video describes the in vivo anti-tumor efficacy analysis using photosensitizer containing nanoparticles in a tumor-bearing mouse, to determine the phototoxic potential of the photosensitizer.

In Vivo Antitumor Efficacy Analysis of PDT: A Technique to Determine the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Tumor Bearing Mice

Een voorbeeld van een nano geneesmiddel op basis polymalic zuur gepresenteerd naar het rationele ontwerp van gepersonaliseerde geneeskunde die voor kanker. Het beschrijft de synthese van een nano geneesmiddel Her2-positieve menselijke borst kanker in naakt muizen.

Polymalic Acid-gebaseerde Nano Biopolymeren voor Targeting van Multiple Tumor Markers: een kans voor Gepersonaliseerde Geneeskunde?

Het doel van dit protocol is om de bereiding en karakterisering van fysiek opgesloten, slecht oplosbare geneesmiddelen in micellaire geneesmiddelafgiftesystemen, samengesteld uit amfifiele blokcopolymeren, te beschrijven.

Bereiding en karakterisering van de individuele en multi-geneesmiddel beladen Fysiek Ingesloten Polymeer Micellen

Fotodynamische therapie (PDT) is een alternatieve keuze voor de behandeling van longkanker. Om het therapeutische effect van PDT te verhogen, werden op longkanker gerichte nanodeeltjes in combinatie met chemotherapie ontwikkeld. Zowel in vitro als in vivo werden de antikankereffectiviteiten van PDT met bereide nanodeeltjes geëvalueerd.

Antikanker werkzaamheid van Photo Dynamische Therapie met longkanker-Gerichte Nanodeeltjes

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Om efficiënt adjuvantia rationeel te ontwerpen, ontwikkelden we poly-melkzuur-co-glycolzuur nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE). De PNPE bezat unieke zachtheid en een hydrofobe interface voor krachtig cellulair contact en bood antigeenbelasting met een hoog gehalte, waardoor de cellulaire affiniteit van het afgiftesysteem voor antigeen-presenterende cellen werd verbeterd en efficiënte internalisatie van antigenen werd geïnduceerd.

Cellulaire affiniteit van deeltjesgestabiliseerde emulsie om antigeenintern internalisatie te stimuleren

Ontdek de evaluatie van antitumoractiviteit van IL-1α in een syngeneic muismodel voor hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom. Dit protocol helpt onderzoekers de therapeutische potentie en toxiciteit te bestuderen.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Meer video's verkennen