Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Deze protocollen bieden een effectieve manier om de antitumoractiviteit van immuunmodulatoraanvallen te bestuderen. Bovendien kan de analyse van de geassocieerde kansen in de circulerende cytokines en immuuncelpopulaties worden gedaan met behulp van deze voorgestelde methoden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een gemakkelijke en ongecompliceerde manier is om een tumor te implanteren en de groei ervan te volgen. De directe implicatie van deze techniek is het beoordelen van de werkzaamheid van bepaalde therapieën of uitdagingen in antikankeronderzoek. Bovendien zijn sommige aspecten van deze technieken geschikt voor toxiciteitsstudies. Ontdooi om te beginnen een bevroren flacon met muizen EERL-cellen in een voorverwarmd waterbad bij 37 graden Celsius en breng ze over in een conische buis van 15 milliliter met warme kweekmedia. Centrifugeer de conische buis op 277 keer G gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius om de media te verwijderen. suspendeer vervolgens het celgehemelte opnieuw in drie tot vijf milliliter verse media en breng het over in een T25-celkweekkolf. Laat de cellen groeien in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, Expand naar grotere kolven en passage om de drie dagen. Als er voldoende cellen zijn voor de gewenste implantatie in alle muizen, verwijdert u de kolven, gooit u de media weg en spoelt u de cellen PBS voorzichtig af. Voeg vervolgens vier milliliter 0,25% trypsine EDTA toe en incubeer gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius. Voeg verse media toe om de trypsinereactie te stoppen en vang de celsuspensie op in conische buizen van 50 milliliter. Suspendeer de cellen opnieuw in nieuwe media en tel de cellen. Centrifugeer nog een keer en voeg vervolgens koude PBS toe aan de cellen om een uiteindelijke concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter te maken. Bewaar de celsuspensie vóór de injectie op ijs. Desinfecteer het flankgebied met een ethanolpad. Om celsuspensie in muizen te injecteren, zuigt u 100 microliter celsuspensie in de spuit en verwijdert u alle luchtbellen en dode ruimte van bovenaf. Injecteer vervolgens de celsuspensie subcutaan op een langzame en gestage manier in verdoofde muizen. Plaats de dieren in hun respectievelijke kooien en houd ze in de gaten totdat ze herstellen van de anesthesie. Om bloed op te vangen, pakt u de losse huid over de schouder vast met de niet-dominante hand en prikt u de submandibulaire ader door met een 18 gauge naald of lancet. Verzamel 200 tot 300 microliter bloed in een polypropyleen microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter of serumseparatorbuisje. Oefen na de bloedafname lichte druk uit op de prikplaats totdat het bloeden is gestopt. Breng de muizen terug naar hun respectievelijke kooien en observeer totdat ze herstellen van de anesthesie. Laat het verzamelde bloed 20 tot 30 minuten stollen bij kamertemperatuur. Plaats de buisjes vervolgens op ijs totdat ze klaar zijn om gecentrifugeerd te worden. Centrifugeer het gestold bloed bij 1.540 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verzamel voorzichtig de serumlaag van bovenaf. Ontdooi de serum- of plasmamonsters terwijl u ze op ijs bewaart. Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 1.540 keer G om eventuele celresten te bezinken en de serumlaag voorzichtig van bovenaf te verzamelen. Plaats de multiplexkit op kamertemperatuur en voer de test uit volgens het protocol van de fabrikant. Leg elke muis op zijn rug en spuit 70% ethanol op de huid van de buikstreek. Gebruik een tang en een schaar om de lymfeklier aan de rechterkant van de muizen af te knippen en de tumor aan de linkerkant te verwijderen. Als de tumor groot is, snijd hem dan in kleine stukjes en haal ongeveer 500 tot 600 milligram uit het weefsel. Plaats de weefsels op de respectievelijke dissociatorbuizen met drie tot vijf milliliter RPMI-media. Homogeniseer het weefsel met behulp van een geautomatiseerde dissociator. Filtreer na homogenisatie de celsuspensie door een filter van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer op 277 maal G gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius om de media te verwijderen. Was en suspendeer de cellen opnieuw in één tot twee milliliter koude PBS. Gebruik 0,4% trypsineblauwe kleuring om de levensvatbare cellen in een hemocytometer te tellen.Bereken het volume dat nodig is om twee tot drie miljoen cellen te krijgen en breng ze over naar de betreffende faxbuis. Centrifugeer getelde cellen bij 277 keer G gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius.Decanteer het supernatans en suspendeer de cellen opnieuw in 300 microliter PBS. Voeg 0,5 tot één microliter zombiekleurstof per tube toe en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer de cellen Was ze met één tot twee milliliter faxbuffer en suspendeer ze opnieuw in 200 microliter faxbuffer. Voeg FC-receptorblokker toe volgens het protocol van de fabrikant en incubeer de cellen gedurende 10 minuten. Centrifugeer opnieuw op de eerder beschreven instellingen en was de cellen met één tot twee milliliter faxbuffer. Voeg de antilichaamcocktail toe en incubeer 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Centrifugeer en was de cellen na de incubatie met een faxbuffer van één tot twee milliliter. Voeg 300 tot 400 microliter 2%paraformaldehyde-oplossing toe en suspendeer opnieuw voor fixatie. Bewaar de cellen een paar dagen bij vier graden Celsius of analyseer ze onmiddellijk met een meerkleurige flowcytometer. In deze studie is de antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1