Isolatie en in vitro kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen voor de studie van NO-redox biologie

Dit protocol helpt bij het kweken van beenmerg afgeleide macrofagen van iNOS- of BH4-deficiënte muizen met behulp van zorgvuldig gedefinieerde media en serum met lage niveaus van BH4 en nitraat om interferentie met redoxmechanismen te voorkomen. Door de niveaus van potentiële verontreinigingen in het kweekproces zorgvuldig te controleren, kunnen we stikstofmonoxide-interferentie beperken en de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van het modelsysteem garanderen. Deze methode maakt nauwkeurige metingen van biopterinen, stikstofmonoxide en eventuele stroomafwaartse factoren met betrekking tot deze essentiële verbindingen mogelijk.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Thomas Nichol, een postdoctoraal onderzoeker uit ons lab. Plaats om te beginnen de poten gedurende twee minuten in 70% ethanol om eventuele vacht of resten af te spoelen. Breng vervolgens de poten over naar een schone, steriele bacteriologische petrischaal.

Schraap voorzichtig over de lengte van de botten met het mes, snijd door pezen en verwijder de spier uit het bot. Zodra de botten zijn ontdaan van spieren, snijdt u door de epifyse aan de bovenkant van het scheenbeen, net onder de knie. Het scheenbeen kan aan de onderkant worden doorgesneden, net boven de kruising met het kuitbeen.

Snijd ten slotte door de epifyse aan beide uiteinden van het dijbeen, net onder de knie- en heupgewrichten. Om het beenmerg te spoelen, vult u een spuit van 10 milliliter met 10 milliliter PBS en bevestigt u deze aan een naald. Steek vervolgens de naald in de medullaire holte van het bot.

Spoel voorzichtig met één tot twee milliliter PBS en laat de naald op en neer lopen. Trek vervolgens de suspensie vijf tot tien keer in en uit een spuit van één milliliter om uit te splitsen. Verzamel de suspensie in een spuit van één milliliter en breng deze door een celzeef van 70 micrometer in een schone centrifugebuis van 50 milliliter.

Plaats ten slotte de monsters op ijs. Om beenmerg in te vriezen voor later gebruik, centrifugeer de cellen bij 1000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en suspend de rode pellet in twee milliliter antivries.

Incubeer het vervolgens 's nachts bij 80 graden Celsius. Indien bevroren, ontdooi de suspensie snel bij 37 graden Celsius. Breng de celsuspensie over in een schone steriele buis met drie milliliter DMEM/F-12-media.

Pellet vervolgens de cellen door centrifugeren. Gooi het supernatant weg en suspens de pellet in drie milliliter van de bereide DMEM/F-12-media. Tel de cellen en plaats ze in niet-TC-gecoate plastic waren in de voorbereide DMEM / F-12-media.

Incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Voer op de vijfde dag de cellen door 50% van het oorspronkelijke volume DMEM/F-12-media toe te voegen. Stimuleer op de zesde dag de cellen door bereide GM-CSF toe te voegen aan een eindconcentratie van 50 nanogram per microliter rechtstreeks aan de celkweekmedia.

Verwijder op dag zeven alle media uit de cellen. Was vervolgens de cellen kort met voorverwarmde PBS en voeg DMEM / F-12-media toe met 2% laag endotoxine FBS, 1X penicilline of streptomycine, L-glutamine, 25 nanogram per microliter M-CSF en 50 nanogram per microliter GM-CSF. Tot slot incubeer je de cellen 's nachts in media om de macrofagen tot M0-fenotype te activeren.

Voor M1 fenotype, stimuleer de cellen met 100 nanogram per microliter LPS, en 10 nanogram per microliter IFN-gamma. Voor M2 fenotype, stimuleer de cellen met 100 nanogram per microliter IL-4. Incubeer de cellen 's nachts.

Op dag acht zijn cellen klaar voor oogst of downstream verwerking volgens de behoeften van de onderzoeker. Media aangevuld met 10% FBS hadden vergelijkbaar nitriet en tetrahydrobiopterine, ongeacht M-CSF en GM-CSF, of LCM. Maar de totale biopterinespiegels waren hoger in met LCM aangevulde media.

Er werd echter meer variabiliteit tussen verschillende LCM-batches waargenomen. PCR toonde een 1030 base pair product in wild type muizen, terwijl GCH knockout muizen een 1392 base pair product produceerden, wat de excisie van de kritische exonen bevestigde. Tamoxifenbehandeling schafte GCH-eiwit in de knock-outcellen af.

Knock-out- en controlecellen produceerden nog steeds iNOS, na LPS- en IFN-stimulatie. BMDM's gekweekt uit voorwaardelijke GCH knock-out muizen vertoonden significant verminderde tetrahydrobiopterine en verlaagd nitriet. Dezelfde cellen gekweekt in LCM-media hadden geen GCH1-expressie.

De cellen produceren echter aanzienlijke hoeveelheden tetrahydrobiopterine en nitriet na knock-out. Op de achtste dag waren er geen significante verschillen in morfologie tussen niet-geactiveerde controle en GCH knock-out BMDM's bij verschillende concentraties Tamoxifen. De BMDM's vertonen de kenmerken die worden verwacht van niet-gestimuleerde macrofagen, met ronde aanhangende cellen en langwerpige ledematen.

Bij het werken met primaire cellen zoals deze, is het noodzakelijk om al het weefsel en de apparatuur grondig te steriliseren. Bovendien is het kiezen van de juiste media en supplementen belangrijk om een laag stikstofmonoxide en BH4-omgeving te behouden. Celpellets en media kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen, met een focus op de rol van stikstofmonoxide, biopterine of cellulaire redoxtoestand.

Het kan onder andere HPLC, qPCR en Western blot omvatten.