Netwerkactiviteit opnemen in spinale nociceptieve circuits met behulp van micro-elektrodearrays

De MEA 4-AP spinale plakvoorbereiding die aan u wordt beschreven, biedt een platform om de connectiviteit van dorsale hoorncircuits te bestuderen en hoe deze netwerken interageren tijdens spinale sensorische verwerking. De gepresenteerde methodologie maakt het mogelijk om de activiteit van het dorsale hoorncircuit te onderzoeken op een macroscopisch regionaal resolutieniveau. Deze voorbereiding kan worden gebruikt als een snelle screening om het vermogen van verbindingen om de signalering in spinale sensorische circuits te verstoren te beoordelen.

Deze methode helpt de kloof te overbruggen in ons begrip van hoe de activiteit van specifieke celtypen en kleine microcircuits grote populaties neuronen beïnvloeden om vervolgens de output van de dorsale hoorngedragsreacties en uiteindelijk de pijnervaring vorm te geven. Vul om te beginnen de MEA goed met paardenserum gedurende 30 minuten. Spoel na het verwijderen van het serum de MEA vijf keer grondig af met gedestilleerd water totdat het gedestilleerde water niet-schuimig wordt.

Vul vervolgens de put met kunstmatige CSF. Verwijder na het onthoofden van de verdoofde muis de huid over de buikstreek door een kleine snee in de huid te maken ter hoogte van de heupen. Trek vervolgens de huid aan weerszijden van de snee rostrally totdat alle huid is verwijderd van de bovenkant van de ribbenkast naar de bovenkant van het bekken, zowel ventraal als dorsaal.

Nadat u het lichaam op ijs hebt geplaatst, gebruikt u een ventrale benadering om de wervelkolom bloot te leggen door de ingewanden te verwijderen en de ribben zijdelings door het borstbeen te snijden. Verwijder de ventrale ribbenkast, zowel schouderblad, als de onderste ledematen en het bekken. Breng de wervelkolom en het ribpreparaat over naar een ontleedbad met ijskoude sucrose kunstmatige liquor.

Pin alle vier de hoeken van het preparaat door pinnen te plaatsen door de onderrugspieren en de bevestigde bovenste ribben. Verwijder alle spier- en bindweefsel boven het ventrale oppervlak van de wervels met de rongeurs en identificeer het wervelgebied over de lumbo-sacrale vergroting, die ongeveer onder de T12-L2 wervellichamen ligt. Verwijder een wervellichaam caudaal naar het lumbo-sacrale vergrotingsgebied om toegang te krijgen tot het ruggenmerg dat op het wervelkanaal zit.

Snijd met behulp van een gebogen veerschaar bilateraal door de wervelstelen terwijl u het wervellichaam rostrale optilt en trekt om de ventrale en dorsale aspecten van de wervels te scheiden en het ruggenmerg bloot te leggen. Zodra de wervellichamen zijn verwijderd om de lumbo-sacrale vergroting te onthullen, verwijdert u voorzichtig de resterende wortels die het ruggenmerg verankeren met een veerschaar totdat het koord vrij zweeft. Isoleer het ruggenmerg met rostrale en caudale sneden boven en onder de lumbo-sacrale vergroting om het doelgebied van het koord vrij te laten zweven.

Voor dwarse plakken, til en plaats het lumbo-sacrale segment via een aangehechte route op een voorgesneden polystyreenblok met een ondiep kanaal in het midden gesneden. Gebruik vervolgens cyanoacrylaatlijm om het blok en het koord aan het snijplatform te bevestigen en plaats het in het snijbad met ijskoude sucrose kunstmatige CSF-slurry. Zodra de 300 micrometer dikke plakken zijn verkregen, brengt u de plakjes over naar een luchtinterface-incubatiekamer met zuurstofrijke kunstmatige liquor en laat u de plakjes gedurende een uur bij kamertemperatuur in evenwicht zijn.

Om te beginnen met het registreren van de dorsale hoornactiviteit, brengt u het plakje over van de incubator naar de MEA-put met behulp van een grote pasteurpistepet gevuld met kunstmatige liquor en voegt u extra kunstmatige liquor toe. Gebruik een fijne verfkwast met kort haar om het plakje over de opname-array van 60 elektroden te plaatsen. Plaats vervolgens een verzwaarde nek over het weefsel om het op zijn plaats te houden en goed contact met MEA-elektroden te bevorderen.

Plaats de MEA in het opnamehoofdstadium. Controleer de positie van het weefsel over de elektroden met behulp van een omgekeerde microscoop om te bevestigen dat zoveel mogelijk elektroden zich onder de oppervlakkige DH bevinden. Zorg ervoor dat ten minste twee tot zes elektroden geen contact maken met het plakje. Nadat u de camera op het apparaat hebt aangesloten, maakt u een referentieafbeelding van het segment ten opzichte van de MEA voor gebruik tijdens de analyse.

Druk vervolgens op start DAQ in de opnamesoftware en bevestig dat alle elektroden een duidelijk signaal ontvangen. Bevestig vervolgens de perfusie-inlaat- en uitlaatleidingen aan de MEA-put gevuld met kunstmatige CSF en schakel het perfusiesysteem in. Controleer het debiet en zorg ervoor dat de uitstroom voldoende is om overloop van het superfusaat te voorkomen.

Nadat u het weefsel gedurende vijf minuten in evenwicht hebt gebracht, registreert u de ruwe basislijngegevens gedurende vijf minuten. Verplaats de perfusie-inlaatlijn van kunstmatige CSF naar een 4-aminopyridine-oplossing en wacht 12 minuten tot de door 4 aminopyridine geïnduceerde ritmische activiteit de steady state bereikt. Noteer vervolgens vijf minuten 4-aminopyridine-geïnduceerde activiteit en wees voorbereid op de volgende opnames om de medicijnen te testen of de stabiliteit van 4-aminopyridine te controleren.

Spoel na elke opnamesessie de lijnen af met kunstmatige liquor. Nadat u de MEA uit het hoofdstadium hebt verwijderd en het net en het weefsel uit de MEA-put hebt verwijderd, spoelt u de MEA en het net af met kunstmatige CSF en herhaalt u het hele proces met een nieuwe plak. Open de analysesoftware en laad de vooraf gemaakte analyselay-out.

Open het interessante bestand en deselecteer de referentie-elektrode en eventuele elektroden die als te luidruchtig worden beschouwd. Stel het tijdvenster voor analyse in. Ga vervolgens naar het filtertabblad voor meerdere kanalen.

Selecteer de complexe referentie- en referentie-elektroden op basis van de afbeelding die tijdens het experiment is gemaakt en de aantekeningen die tijdens het experiment zijn gemaakt en druk op Verkennen voordat u doorgaat. Ga naar het tabblad EAP-filter en pas een tweede orde high-pass Butterworth-filter toe om LFP-activiteit te verwijderen. Ga naar het tabblad LFP-filter en pas een butterworth-filter van de tweede orde toe om EAP-activiteit te verwijderen.

Zorg ervoor dat u op het tabblad EAP-detector de automatische drempel selecteert, vink de stijgende en dalende randvakken aan en stel de dode tijd in op drie milliseconden. Als u positieve en negatieve drempels wilt instellen, inspecteert u de gegevens door terug te keren naar het scherm van de onbewerkte gegevensanalyse, de tijdmarkering te verplaatsen, terug te keren naar het tabblad EAP-detector en op verkennen te drukken. Herhaal het proces totdat de ingestelde detectiedrempel EAP's vastlegt zonder ruis of niet-fysiologische activiteit vast te leggen.

Zorg ervoor dat u op het tabblad LFP-detector de handmatige drempel selecteert, de stijgende en dalende randvakken aanvinkt en de dode tijd instelt op drie milliseconden. Stel de drempel in voor één elektrode en selecteer, eenmaal tevreden, toepassen op alles en druk vervolgens op analyse starten. De badtoepassing van de spanningsafhankelijke natriumkanaalantagonist tetrodotoxine schafte zowel EAP- als LFP-activiteit af, wat de piekafhankelijkheid van deze signalen bevestigde.

De stabiliteit van 4-aminopyridine geïnduceerde activiteitsparameters werd gekarakteriseerd voor EAP of LFP. Alle activiteitskenmerken plus het samenvallen van activiteit voor LFP's waren stabiel op basis van de gelijkenis van 4-aminopyridine geïnduceerde activiteit na 12 minuten na 4-aminopyridine-toepassing en 15 minuten later. De EAP's of LFP's van de functie werden gekenmerkt door een toename van het aantal toevallige gebeurtenissen gedetecteerd over meerdere elektroden.

Het aantal gekoppelde aangrenzende elektroden en de sterkte van koppelingen tussen aangrenzende elektroden en LFP's na 4-aminopyridinestimulatie en vervolgens relatieve stabiliteit. De plakoriëntatie is een belangrijke overweging voor in vitro preparaten. 4-aminopyridinestimulatie veroorzaakte een vergelijkbare ritmische activiteit in de SDH, ongeacht de oriëntatie van de plak.

Ten slotte, om verder licht te werpen op de relevantie van 4-aminopyridine-activering van de DH-netwerken, werd een verhoogde kalium kunstmatige CSF-oplossing toegepast en aangetoond dat deze een vergelijkbare DH-respons op 4-aminopyridinestimulatie oproept. Belangrijke stappen in het protocol zijn de weefselvoorbereiding en plaatsing van secties, ervoor zorgen dat het weefsel gezond is door zorgvuldige, maar tijdige dissectie, evenals delicate optimale positionering van het weefsel op de MEA zal helpen bij het verkrijgen van kwaliteitsresultaten.