Integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie

Adherente cellen oefenen krachten uit op hun omgeving, en die krachten omvatten de krachten die cellen uitoefenen op het substraat, hier weergegeven in groen, en de krachten die cellen uitoefenen op hun buren, weergegeven in rood. Deze krachten kunnen worden gemeten in cellulaire monolagen met behulp van een techniek die monolaagstressmicroscopie wordt genoemd. Kortom, de techniek omvat het bereiden van hydrogels met kleine fluorescerende kralen, net onder het bovenste oppervlak, en grote fluorescerende kralen die op het glas zijn gelijmd.

Op deze hydrogel ziet men de cellen en kweekt ze samenvloeien of welke toestand men ook wenst om krachten te meten. Het meten van krachten vereist het in beeld brengen van de cellulaire monolaag, het nemen van doorgelaten lichtbeelden van de cellen en fluorescerende lichtbeelden van de kleine en grote kralen. Elk van deze beelden wordt verworven in hetzelfde vocale vlak.

Deze beelden worden verkregen wanneer de cellen worden bevestigd en losgemaakt van de hydrogel. En een vergelijking van deze twee sets beelden levert ons de gegevens op die nodig zijn om al deze krachten te kwantificeren. Dat is waar AcTrM en AnViM in het spel komen.

Nadat u de cellen hebt geplateerd, zodat u afbeeldingen op exact dezelfde locatie kunt verkrijgen, op elk gewenst moment, wordt dat protocol geprogrammeerd in AcTrM en vervolgens deze gegevens analyseren en de resultaten visualiseren, dat is het doel van AnViM. In de komende paar minuten zullen we u door het proces leiden van het verkrijgen van beelden voor een samenvloeiingscelmonolaag. Actie stap nul vraagt de gebruiker om het acquisitietype te selecteren.

Een nieuwe acquisitie om een nieuw experiment te starten, of een verdere acquisitie om een eerder experiment te hervatten. Klik op Nieuwe acquisitie om een positielijst te maken. Actie stap één geeft een overzicht van al uw volgende stappen.

En deze acties worden uitgevoerd in het venster van de lijst met podiumposities hier. Klik op Live in Micro-Manager om het voorbeeld te visualiseren voor handmatige aanpassingen. In live view kijken we naar de fase.

Hier is het duidelijk. Nu zal men naar de kralen moeten kijken. Hier kunnen de kralen worden gevisualiseerd in fluorescentie.

Selecteer dus het kanaal dat geschikt is voor de bovenste kralen. Het is ook belangrijk dat je een paar bodemkralen kunt zien, dus laten we eens kijken naar een kanaal voor de onderste kralen. Wat je hier ziet is een wazig beeld van bodemkralen, en dat is helemaal prima zolang je kunt zien dat de onderste kralen er zijn, wat je in deze afbeelding kunt doen.

Positielijst, klik op Markeren. Zo maak je een positielijst. Nadat u een positielijst hebt gemaakt, die in de vorige video is besproken, volgt u de stappen die worden vermeld in actie stap twee met behulp van het multidimensionale acquisitievenster.

Laten we zeggen dat we een lange time-lapse willen uitvoeren. Hier ga ik aangeven hoeveel foto's we willen maken. Het eerste kanaal wordt het fasekanaal.

De volgende zal van de bovenste kralen zijn en de volgende zal de onderste kralen zijn. Klik op sluiten in het multidimensionale acquisitievenster en klik op OK in AcTrM stap twee. De uitvoer wordt opgeslagen in de map die wordt geïdentificeerd in het multidimensionale acquisitievenster.

Actie stap drie zal vragen of het experiment herstel nodig heeft. Het antwoord zal meestal ja zijn. Hier vraagt iTACS, willen we een verfijnd herstel uitvoeren?

Dit eerste deel zal ons vrij dicht bij een verfijnd herstel brengen, maar het onderste deel zal ons nog dichter bij een hogere nauwkeurigheid van herpositionering brengen. Als het herstel wordt uitgevoerd met een beperkt gezichtsveld, wordt deze optie aangeboden, maar voor dit experiment selecteren we die optie niet. Op dit punt is de verwerving van een reeks referentiebeelden voltooid en kan Micro-Manager worden gesloten.

Voor beeldacquisitie start men AcTrM. Selecteer de vergroting en kies de map die gegevensmappen bevat. Selecteer keuzes voor het herpositioneren van de plaat samen met het kanaal dat wordt gebruikt voor herpositionering.

Er is een interface voorzien om wat er momenteel in de camera te zien is af te stemmen op de opgeslagen beelden. Als er overlap is, geven de afbeeldingen een rode en groene kleur weer samen met zwart en kan handmatige aanpassing worden uitgevoerd. Anders druk je op accepteren en gaat de acquisitie door.

We kunnen nu beginnen met FIJI. Selecteer de eerste optie in het vervolgkeuzemenu MSM met het label voorbewerking. Selecteer vervolgens de map met de map tnimgs.

Vervolgens zullen we moeten definiëren welk kanaal overeenkomt met welk beeld. Voor dit voorbeeld is kanaal 0 het doorgelaten lichtbeeld dat het fasecontrastbeeld van de cellen is. De onderste kraalafbeelding is kanaal 2 en de bovenste kraalafbeelding is kanaal 1.

En dan is het je vragen waar de cellen elkaar kruisen en welke kant van het beeld. In dit geval zijn de cellen een monolaag die naar de rechterrand oprukt, dus we zullen Rechts deselecteren en doorgaan. Hier dient een klein gebied van bovenste kralen, ver van de monolaag, hetzelfde doel als onderste kraalafbeeldingen die spaarzamer en groter lijken dan die hier worden getoond.

Nu vraagt het ons of we de helderheid en het contrast willen veranderen, zodat de kralen prominent verschijnen. Dus we passen ons aan met behulp van de schuifbalken in het menu en zodra de kralen prominent verschijnen, klikt u op OK. En nu gaan we positiecorrectie doen. Als er een verschuiving is, zal het er vanaf komen.

En nadat het klaar is, wordt de analysemap gemaakt. In de analysemap wordt de positiemap, P0, gemaakt en de keuzes die we in de vorige voorbewerkingsmenu's hebben gemaakt, worden opgeslagen in analysekeuzen, zoals welke randen zijn gekruist, pixelgrootte en welke afbeelding fasecontrast is en andere. Selecteer in de monolaagstressmicroscopie of het msm-vervolgkeuzemenu de optie MSM-gelvervorming.

Vanaf hier selecteren we de optie die geschikt is voor onze kralendistributie. En terwijl de gegevens worden verwerkt, kunt u zien dat er een nieuwe verplaatsingsmap in de positiemap is verschenen. Dit is waar alle uitvoerbestanden worden opgeslagen.

Dit geeft aan dat de analyse compleet is. We gaan kijken hoe we de krachten kunnen berekenen die worden uitgeoefend over de cel-ECM-junctie en cel-celverbinding en ook het cytoskelet van individuele cellen van de monolaag. Selecteer daarvoor de derde optie.

En men gaat de map kiezen die tnimgs en de analysemap bevat, wat betekent dat men de voorbeeldmap selecteert in plaats van een van deze mappen. Druk op selecteren en het zal je vragen, wat is de schuifmodulus van deze gel? De schuifmodulus is 1250 en de dikte van de hydrogel in dit voorbeeld is 118 micron.

Het verwachte geluidsniveau wordt hier gegeven. Dan is er een gemiddelde verplaatsing is nulvlag, die in dit geval niet wordt gecontroleerd. Selecteer OK en de implementatie die tractie berekent, wordt uitgevoerd via een MATLAB-functie, en dat is hoe deze wordt geïmplementeerd in deze versie van AnViM.

Nu is het klaar om de berekening voor celcel- of cytoskeletkrachten uit te voeren. En de eerste vraag die je moet stellen is, is de monolaag confluent? In dit specifieke geval hebben we een voortschrijdende monolaag en is er een geen celgebied aan de rechterkant van het frame.

Dus het antwoord is dat de monolaag niet samenvloeit, dus we gaan nee zeggen. Nu wordt ons gevraagd om een veelhoek te tekenen rond het grootste niet-celobject. We selecteren de juiste methoden voor segmentatie.

Hier vraagt het ons om de kleur van de cellen aan te geven in methoden drie en vier, dus hier zijn de cellen zwart, dus we zullen zwart kiezen. De segmentatie die wordt geproduceerd uit deze verschillende methoden eindigt met enkele gaten in de celmonolaag en enkele witte gebieden in het geen-celgebied. Hier kunnen we kiezen, plekken automatisch opvullen en op OK.So nu zijn alle plekken opgevuld in de monolaag en geen celgebied.

En dan berekenen we de mechanische spanningen in de cellulaire monolaag. We hebben al deel één uitgevoerd waar we de cellen uit het geen celgebied hebben gesegmenteerd, dus we beginnen deze stap met deel twee dat is segmentatie van de individuele cellen en de afbeeldingen. Men gaat segmentatie selecteren voor individuele cellen.

En hier vraagt het ons om de positiedirectory te kiezen. En er is hier wat meer informatie gegeven voor deze parameters. Vervolgens wordt je gevraagd om een veelhoek rond de kleinste normale cel te tekenen.

Dus wat je hier tekent, wordt gebruikt om het oppervlak te berekenen en het zal bepalen dat alles wat kleiner is dan dit niet als een cel wordt gedefinieerd. En vervolgens vraagt het om de grootste cel. Dus dan tekenen we een veelhoek rond de grootste normale cel, en dan vraagt het, welke is helderder?

Is de cel-cel interface helderder of zijn de celcentra helderder? Dus in dit geval is de cel-cel interface helderder, dus ik ga cel-cel interface selecteren. Dit geeft dus aan dat de berekening is afgerond.

Laten we beginnen met het selecteren van een kaart op celintensiteiten. Eerst vraagt iTACS de gebruiker om de positiemap te selecteren, die ook bekend staat als de P0-map. Als u klaar bent, klikt u op Selecteren.

Vervolgens wordt de gebruiker gevraagd of hij of zij wil dat iTACS celdeling detecteert of cellulaire fluorescentie kwantificeert. In dit geval hebben we geen fluorescerende eiwitten in de cel, dus daarom zullen we ervoor kiezen om celdeling te detecteren. Met de volgende dia kan de gebruiker de grootte van het aangrenzende gebied definiëren, dit is een unieke analyse die AnViM uitvoert waarbij wordt gekeken naar de eigenschappen van individuele cellen en de eigenschappen van het aangrenzende cellengebied.

Hier kan de gebruiker de breedte van een aangrenzend cellengebied kiezen. In dit geval definiëren we de aangrenzende regio's met 60 pixels. Het eerste selectievakje vraagt of we willen dat iTACS eigenschappen van de cellen verzamelt, ja dat doen we, en dit selectievakje vraagt of we willen dat iTACS eigenschappen van de buren verzamelt, ja, we willen dat iTACS dat ook doet.

Onder deze selectievakjes biedt iTACS meer informatie over de selectievakjes als de gebruiker meer informatie over elk selectievakje wil. Dit geeft aan dat de analyse compleet is. Nogmaals, iTACS vraagt de gebruiker om de positiemap te selecteren.

Vervolgens krijgt de gebruiker de keuze om krachtgegevens in kaart te brengen, afbeeldingen van de krachtgegevens te maken, snelheidsgegevens in kaart te brengen en afbeeldingen van de snelheidsgegevens te maken. Het is belangrijk op te merken dat het maken van afbeeldingen tijd kost, dus men kan ervoor kiezen om het nu te doen of te wachten om het later te doen. Daarom krijgt de gebruiker de mogelijkheid om de keuzes te selecteren of niet.

Hier vraagt iTACS de gebruiker om de grootte van het naburige gebied opnieuw te bepalen en u kunt dezelfde grootte gebruiken die u hebt bepaald voor toewijzingsintensiteiten, in ons geval 60 pixels. En nogmaals, de gebruiker wordt gevraagd om eigenschappen van de cellen en het naburige gebied te verzamelen. Dit geeft aan dat de analyse compleet is.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu monolaagstressmicroscopie of MSM de optie resultaten bijhouden van gegevens. Eerst vraagt iTACS de gebruiker om de positiemap te selecteren, die ook bekend staat als de P0-map. Als u klaar bent, klikt u op Selecteren.

Hier vraagt iTACS welk framenummer de gebruiker wil dat iTACS gegevens gaat bijhouden. Het is vrij veilig om te beginnen met volgen vanaf frame nummer twee, omdat de snelheid niet kan worden bepaald voor frame nummer één. Hier vraagt iTACS de gebruiker om het maximale aantal percelen aan te geven dat tegelijkertijd moet worden gevuld.

En in wezen is dit een manier om het bijhouden van gegevens te versnellen. Als u klaar bent, klikt u op OK en de opties voor het kiezen van variabelen tijdens het bijhouden worden op dezelfde manier gepresenteerd als de opties voor het genereren van heatmaps. Algemene interessante eigenschappen worden weergegeven in het tekstvak boven aan het venster.

Maar als u uw variabelen wilt aanpassen, hoeft u alleen maar alles in het tekstvak te verwijderen en de specifieke eigenschappen hieronder te selecteren. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Monolayer Stress-microscopie of MSM de optie Resultatenplot. Daarna vraagt iTACS de gebruiker of de gebruiker het plotten wil beperken tot cellen met ononderbroken track.

Als u het plotten niet wilt beperken tot ononderbroken tracks, klikt u op Nee.Maar als u het plotten wilt beperken tot cellen met ononderbroken tracks, klikt u op Ja Hier iTACS vraagt hoeveel variabelen de gebruiker wil dat het programma plot. iTACS is in staat om maximaal drie variabelen uit te zetten, en in dit geval zullen we slechts twee variabelen plotten om de relatie tussen die factoren te zien. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Monolayer Stress-microscopie of MSM de optie Resultatenafbeelding.

Hier is de positiemap en als u klaar bent, klikt u op Selecteren. iTACS vraagt ons vervolgens om het startframe te kiezen. Hier selecteerden we frame nummer twee.

De opties voor het maken van heatmaps worden op dezelfde manier gepresenteerd als de opties voor het plotten van tijdsporen van individuele cellen. Daarmee concluderen we hoe we een heatmap kunnen maken. Hier vertegenwoordigt het tijdsspoor van cellulaire snelheid in cytoskeletale spanning voor cel nummer één.

De eigenschappen worden weergegeven op een gedeelde verticale as en de horizontale as geeft het tijdinstantienummer aan, waarbij de frames met intervallen van 15 minuten worden verkregen. De tweede output is een reeks heatmaps een uur na het experiment. De hier getoonde eigenschappen omvatten verspreidingsgebied, oriëntatie, circulariteit, snelheid, bewegingsrichting, maximale spanningsoriëntatie, cytoskeletspanning, substraattractie en spanningsanisotropie van individuele cellen.

Dit is dus een inkijkje in één reeks experimenten. Er zijn verschillende andere experimentele situaties waarin AnViM en AcTrM de gebruiker kunnen helpen het experiment reproduceerbaar uit te voeren en deze contacten worden vermeld in het manuscript. Enkele van de belangrijkste kenmerken van iTACS zijn automatisering van het experimentele protocol, geautomatiseerde gegevensanalyse en er is geen technische achtergrond vereist.