Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om vakkundig een chemiluminescentiedetector te gebruiken voor het meten van stikstofmonoxidemetabolieten zonder de begeleiding of kosten van het in dienst nemen van toegewijd personeel ter plaatse. Chemiluminescentie-gebaseerde test is de meest gevoelige methode om minimale veranderingen in de niveaus van stikstofmonoxide en zijn metabolieten in een bepaald biologisch monster te detecteren. Geïnhaleerd stikstofmonoxide is een therapeutisch gas dat wordt gebruikt voor een breed scala aan ziekten.

Het is van cruciaal belang dat ziekteprogressie en herstel nauwkeurig worden gecorreleerd met stikstofmonoxidemetabolietniveaus. Geïnhaleerd stikstofmonoxide, een antimicrobieel middel, is veelbelovend bij de behandeling van patiënten met infectieziekten in de luchtwegen. De chemiluminescentiemethode geeft inzicht in het correleren van stikstofmonoxidedosis en zijn metabolieten met microbiologische en pathofysiologische veranderingen.

Om de DETA-NONOate-oplossing te bereiden, voegt u 10 milligram DETA-NONOaat toe aan 610 microliter 10-millimolair natriumhydroxide in PBS van pH 7,4 om 100 millimolar DETA-NONOaat te genereren en het op ijs te houden. Om verder te gaan, sluit u de zuurstofleiding aan op de chemiluminescentiedetector en opent u de zuurstoftank met een druk volgens de instructies van de fabrikant in de tekst. Sluit vervolgens de diëlektrische filterlijn met een intens veld aan op de chemiluminescentiedetector.

Begin op de chemiluminescentiedetectorinterface met het uitvoeren van het detectieprogramma voor vloeistoffasetests, zorg ervoor dat de zuurstoftoevoer voldoende is en de detector begint met bemonstering, wat wijst op detectie per signaal in millivolts, anders een negatief diagnostisch signaal. Om het spoelvat voor te bereiden, sluit u het spoelvat op alle drie de poorten door de naaldklep volledig naar rechts te schroeven en de inlaat- en uitlaatstopkranen te sluiten. Verwijder de dop van het spoelvat.

Voeg een voldoende hoeveelheid van het reagens dat specifiek is voor de geplande test toe aan de reactiekamer, zodat de spuitnaald die wordt gebruikt om de monsters te injecteren de vloeistofkolom kan bereiken en tegelijkertijd de aanwezigheid van een stabiele, gewenste uitgangswaarde kan verifiëren. Om de spoelgasstroom te starten, moet u ervoor zorgen dat de inerte gastank is uitgerust met een tweetrapsregelaar en de inerte gastank verbinden met de gasinlaat van het vat. Open vervolgens de uitlaat van het spoelvat en open het gas met een uitlaatdruk op de regelaar van één tot vijf pond per vierkante inch.

Open vervolgens de inlaat van het spoelvat en open langzaam de naaldklep van het spoelvat om de instroom van gas mogelijk te maken en het borrelen in het spoelvat te verifiëren. Om de gasstroom aan te passen, registreert u de celdruk gemeten door de chemiluminescentiedetector met de intense-veld diëlektrische filterlijn die omgevingslucht bemonstert. Verplaats de dop op het spoelvat en sluit de diëlektrische filterleiding met intense velden aan op het spoelvat.

Gebruik de naaldklep om dezelfde celdruk te bereiken op het niveau van de chemiluminescentiedetector dat wordt geregistreerd in de omgevingslucht. Om het chemiluminescentiesignaalacquisitieprogramma te starten, sluit u de seriële poort van de chemiluminescentiedetector aan op de seriële poort van de computer waarin het acquisitieprogramma is geïnstalleerd. Voer vervolgens het analyseprogramma uit.

Klik op Verwerven, selecteer vervolgens de map om het gegevensbestand op te slaan, typ de bestandsnaam en klik op Opslaan. Pas tijdens de voorbereiding op monsterinjectie de spanningsschaal op het scherm aan om controle te hebben over de beoogde basislijn door op de minimum- en / of maximumknoppen te klikken en vervolgens de gewenste waarde in te voeren. Om de monsterinjectie uit te voeren, spoelt u de spuit ten minste tweemaal of meer met gedeïoniseerd en gedestilleerd water voordat u elk monster opneemt en zorgt u voor een onbelemmerde wateruitworp op een taakdoekje.

Plaats vervolgens de spuit in de monsterbuis terwijl u zowel de spuit als de buis op korte afstand houdt en trek de zuiger op tot het gewenste volume terwijl u ervoor zorgt dat er geen luchtbel of niet-gehomogeniseerde vaste delen worden opgesloten. Reinig de punt van de spuit met een taakwisser en steek de spuit in de setterdop bij de injectiepoort. Nadat u hebt gecontroleerd of de punt van de spuit zich in de vloeibare fase bevindt, injecteert u het monster in de reactiekamer.

Om de injectie in het softwareprogramma te markeren, typt u de monsternaam door op het grijze vak onder Monsternamen te klikken en vervolgens op Injectie markeren terwijl u controleert of de injectie een opwaartse verandering in het signaal of naar beneden in het stikstofmonoxideverbruik veroorzaakt door celvrije hemoglobinetest. De dosisresponsrelatie tussen celvrij hemoglobine- en stikstofmonoxideverbruik werd gemeten door chemiluminescentie na cardiopulmonale bypass. Er kan worden aangenomen dat er een hoge concentratie heemgroepen is in de geoxideerde status die stikstofmonoxide opruimt.

Bij patiënten die stikstofmonoxide krijgen tijdens cardiopulmonale bypass, is in plaats daarvan de meerderheid van de heemgroepen verminderd en verbruikt geen stikstofmonoxide. Metingen van de celvrije hemoglobineconcentratie wezen op een langzame eliminatie uit plasma binnen 12 uur na cardiopulmonale bypass. De consumptie van stikstofmonoxide piekte echter na 15 minuten en weerspiegelde niet de eliminatie van celvrij hemoglobine.

De lineaire regressiecurven van stikstofmonoxideconsumptie door celvrij hemoglobine vertoonden een prevalentie van geoxideerd en stikstofmonoxide-consumerend hemoglobine na 15 minuten, in tegenstelling tot meer verlaagd hemoglobine bij baseline 4 uur en 12 uur post-cardiopulmonale bypass. De effecten van stikstofmonoxidegastoediening op het stikstofmonoxideverbruik werden gemonitord. Wanneer patiënten intra- en postoperatief met stikstofmonoxidegas werden behandeld, was de waargenomen toename van vrij hemoglobine na de cardiopulmonale bypass niet gekoppeld aan een toename van het stikstofmonoxideverbruik.

De resultaten gaven aan dat exogene toegediend stikstofmonoxide het grootste deel van het vrije hemoglobine verminderde en stikstofmonoxide-opruiming voorkwam. Het experiment is alleen geldig als alle voorwaarden hetzelfde blijven. Als de hoogte van het vloeistofniveau de reactiekolom overschrijdt, moeten we stoppen en een nieuwe kalibratie uitvoeren.