Name: Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en metabolieten in biologische monsters. Deze gevoelige methode helpt onderzoekers bij het meten van minimale veranderingen zonder gespecialiseerd personeel ter plaatse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De protocollen die in dit manuscript worden gerapporteerd, werden mogelijk gemaakt door de verzamelde bijdragen van eerdere fellows van Dr. Warren Zapol's laboratorium voor anesthesieonderzoek in kritieke zorg, afdeling anesthesie in het Massachusetts General Hospital. We erkennen de bijdrage van Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli en Emanuele Rezoagli.

L.B. ontvangt salarissteun van K23 HL128882/NHLBI NIH als hoofdonderzoeker voor zijn werk aan hemolyse en stikstofmonoxide. LB ontvangt subsidies van "Fast Grants for COVID-19 research" aan het Mercatus Center van de George Mason University en van iNO Therapeutics LLC. B.Y. wordt ondersteund door subsidies van een NHLBI/#R21HL130956 en DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ontving patenten bij MGH op de elektrische opwekking van stikstofmonoxide.
L.B. en B.Y. hebben een patentaanvraag ingediend voor NO delivery in COVID-19 disease PCT application number: PCT/US2021/036269 ingediend op 7 juni 2021. RWC ontvangt salarissteun van Unitaid als hoofdonderzoeker voor technologische ontwikkeling gericht op gedecentraliseerde diagnose van tuberculose bij kinderen in omgevingen met weinig middelen.

Vanwege de hoge gevoeligheid hebben op chemiluminescentie gebaseerde assays voor de bepaling van NO en gerelateerde verbindingen een hoog risico op NO 2-contaminatie. Elk reagens (met name de NO2-blokkerende oplossing) en verdunningsmiddel (inclusief ddH2O) dat in het experiment wordt gebruikt, moet worden getest op zijn NO 2-gehalte om te corrigeren voor achtergrondsignaal. Nitriet is extreem reactief met een halfwaardetijd in volbloed rond de ...

Sinds Salvador Moncada en Nobelprijswinnaars Robert Furchgott, Louis Ignarro en Ferid Murad stikstofmonoxide (NO) identificeerden als de eerder bekende endotheel-afgeleide relaxatiefactor (EDRF), is de centrale rol van NO vastgesteld in verschillende belangrijke mechanismen die zich uitstrekken over vasculaire biologie, neurowetenschappen, metabolisme en gastheerrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogene toediening van NO-gas is een gevestigde behandeling geworden voor respiratoire insufficiëntie als gevolg van pulmonale hypertensie bij de pasgeborene8. Stikstofmonoxidegas is ook onderzocht voor de behandeling van respiratoir syncytieel virus (RSV) infectie, malaria en andere infectieuze ziekten, ischemie-reperfusieletsel en voor de preventie van acuut nierletsel bij patiënten die hartchirurgie ondergaan 9,10,11,12. De behoefte aan nauwkeurige meettechnieken om de niveaus van NO, de metabolieten en die van de doeleiwitten en -verbindingen te beoordelen, komt voort uit zowel mechanistische als interventionele studies.
Vanwege de hoge reactiviteit kan NO verschillende reacties ondergaan, afhankelijk van de biologische matrix waarin het wordt geproduceerd en / of vrijgegeven. Bij afwezigheid van hemoglobine (Hb) of andere oxy-hemoproteïnen wordt NO bijna volledig geoxideerd tot nitriet (NO2-).
2NO + O2 → 2NO2
NO2 + NO → N2O3
N2O3 + H2O → NO2- + H+
NO ondergaat eerst autoxidatie met moleculaire zuurstof (O2) om stikstofdioxide (NO2) te verkrijgen en reageert met NO2 zelf om dinitrogentrioxide te genereren (N2O3). Eén molecuul van N2O3 reageert met water (H2O) om twee moleculen van NO2- en een proton (H+)13 te vormen. In volbloed worden14,15, NO en NO2- snel omgezet in nitraat (NO3-) omdat deze moleculen gretig reageren met de geoxideerde heemgroepen van Hb [Hb-Fe2+-O2 of oxyhemoglobine (oxyHb)] tot NO3-. Deze reactie gaat gepaard met de overgang van de heemgroep naar de ijzertoestand [Hb-Fe3+ of methemoglobine (metHb)]:
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-
De barrière van de rode bloedcel (RBC) en de ruimte direct grenzend aan het endotheel zijn de belangrijkste factoren die deze reactie beperken en waardoor een klein deel van het NO dat door het endotheel vrijkomt, kan fungeren als EDRF16,17. In feite is bekend dat celvrij Hb in de bloedsomloop de vaatverwijding in experimentele en klinische omgevingen verstoort17,18. Binnen de RBC reageert, afhankelijk van oxygenatie en NO 2-concentratie, een deel van NO met deoxyhemoglobine (Hb-Fe2+) om ijzer-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO of HbNO) te vormen:
Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO
 In de RBC15,17 kan NO2- Hb-Fe3+ vormen door Hb-Fe2+ te verlagen wat leidt tot het vrijkomen van NO, wat op zijn beurt Hb-Fe2+-O 2 (bij voorkeur) of Hb-Fe2+ bindt.
De generatie van NO-derivaten moet niet strikt unidirectioneel worden beschouwd, aangezien NO kan worden geregenereerd uit NO2- en NO3- in verschillende weefsels en door verschillende enzymen (bijvoorbeeld door darmbacteriën of in mitochondriën, met name onder hypoxische omstandigheden)19,20.
Een variabele hoeveelheid geproduceerd (of toegediend) NO leidt tot de stroomafwaartse generatie van S-nitrosothiolen, voornamelijk door thioltransnitrosatie van N2O3 in aanwezigheid van een nucleofiel die een NO+ donortussenproduct creëert (Nuc-NO+-NO2-):
N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-
Een andere mogelijkheid voor het genereren van S-nitrosothiolen is nitrosylering van geoxideerde thiolen (NO reageren met een geoxideerd thiol):
RS• + NO → RS-NO
Dit mechanisme en de directe thioloxidatie met NO2 zouden alleen mogelijk kunnen zijn in zeer specifieke omstandigheden die elders worden beschreven21. S-nitrosothiolen variëren van lichte moleculen zoals S-nitrosoglutathione tot grote thiolbevattende eiwitten. S-nitrosohemoglobine (S-NO-Hb) wordt gevormd door nitrosatie van een thiolgroep van een geconserveerd cysteïneresidu in de β-keten (β93C)22.
De generatie en het metabolisme van S-nitrosothiolen maken deel uit van belangrijke regulerende mechanismen. Voorbeelden hiervan zijn regulatie van glutathion, caspasen, N-methyl-D-Aspartaat (NMDA) en ryanodinereceptoren 23,24,25,26,27,28. Eerder beschouwd als een belangrijke mediator van NO-biologie in vivo, lijkt nitrosated albumine (S-nitroso-albumine) een NO / NO + transporter te zijn zonder enige specifieke extra biologische activiteit29.
Bij het meten van de concentratie van NO en zijn derivaten van een specifiek biologisch monster binnen een biologische matrix, is het belangrijk om rekening te houden met kenmerken zoals zuurgraad, oxygenatie, temperatuur en de aanwezigheid van reagentia. Voorbeelden hiervan zijn toegediende exogene NO-donoren en, in de setting van acute ontsteking, waterstofperoxide (H2O2) dat reageert met NO2 , wat leidt tot het genereren van supernormale concentratie van vrije radicalen zoals peroxynitriet (ONOO-)21. Naast de analysemethode die wordt gebruikt, is de preanalytische fase van monstervoorbereiding en -opslag van fundamenteel belang. Stroomafwaartse reacties die niet de in vivo NO-activiteit vertegenwoordigen, moeten worden voorspeld, overwogen en geblokkeerd. Een geldig voorbeeld is de instabiliteit van S-NO-Hb, die een speciale behandeling van bloedmonsters vereist wanneer deze is gericht op meting22.
Chemiluminescentie-gebaseerde assays zijn de gouden standaard voor het detecteren van de niveaus van NO en zijn belangrijkste metabolieten [NO2-, NO3-, S-NO en ijzer-nitrosylcomplexen (Fe-NO)] in elke biologische vloeistof, inclusief weefselhomogenaten30,31. Deze methoden zijn gebaseerd op de chemiluminescentiedetector (CLD), een apparaat dat de reactie van NO met ozon (O3) herbergt en NO2 genereert in een aangeslagen toestand (NO2•). Relaxatie van NO2• veroorzaakt emissie van een foton van licht dat wordt gedetecteerd door een fotomultiplicatorbuis, waardoor een elektrisch signaal wordt gegenereerd dat recht evenredig is met het NO-gehalte van het bemonsterde gasmengsel32. Een vereenvoudigd schema van de CLD wordt weergegeven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> Figuur 1: Vereenvoudigd schema van een chemiluminescentiedetector voor stikstofmonoxidegas. Chemiluminescentie-gebaseerde detectie van stikstofmonoxide (NO) is de stoichiometrische generatie van één foton per NO-gasmolecuul die wordt geïntroduceerd in de chemiluminescentiedetector (CLD). De chemiluminescentiereactie wordt verkregen in een aangewezen kamer die wordt geleverd met ozon (O3) van een interne generator, die op negatieve druk wordt gehouden door verbinding met een externe pomp, waardoor een continue en constante instroom van monstergas mogelijk is. De generatie van O3 vereist diatomische zuurstof (O2) die wordt geleverd door een speciale O2-tank die is aangesloten op de CLD (andere fabrikanten leveren CLD's die werken met omgevingslucht). In de reactiekamer reageert elk molecuul NO-gas in het bemonsterde gas met zuurstof om één molecuul stikstofdioxide in de geactiveerde toestand (NO2*) op te leveren. Door terug te keren naar zijn grondtoestand zendt elk NO2*-molecuul één foton uit dat wordt gedetecteerd door een fotomultiplicatorbuis (PMT) die zich naast de reactiekamer bevindt. De PMT met de bijbehorende versterker en centrale verwerkingseenheid produceert een signaal dat evenredig is met het aantal fotonen en het aantal NO-moleculen in de reactiekamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De monsterinlaat van de CLD kan worden aangesloten op een glaswerksysteem met een reactiekamer voor vloeistofmonsters. Het systeem wordt continu gezuiverd met een inert gas zoals stikstof, helium of argon, waardoor NO van de reactiekamer naar de CLD wordt overgebracht. Vloeistoffasemonsters worden via een speciaal membraan in het spoelvat geïnjecteerd.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> Figuur 2: Structuur van een zuiveringsvat voor op chemiluminescentie gebaseerde detectie van stikstofmonoxidegas Het spoelvat (rechts) maakt de detectie van stikstofmonoxide (NO) gas of een andere verbinding mogelijk die gemakkelijk kan worden omgezet in NO-gas wanneer deze vrijkomt uit een vloeibaar fasereagens. De inerte gasinlaat is verbonden met een bron (tank) van een inert gas zoals Argon, Xeon of diatomische stikstof (N2). De naaldklep (opent aan de linkerkant) wordt gebruikt voor drukregeling in het spoelvat en kan volledig worden verwijderd om het vat te reinigen. De injectiepoort wordt afgedekt door een dop met een membraantussenschot voor monsterinjectie. Het membraan moet vaak worden vervangen. Een verwarmde mantel omringt de reactiekamer en is aangesloten op een warmwaterbad om de VCl3 in HCl-assay uit te voeren. De afvoer van het spoelvat is aangesloten op de chemiluminescentiedetector (CLD) of op de NaOH-val (vereist voor VCl3 in HCl-assays). Om de inhoud van de reactiekamer af te tappen, sluit u eerst de stopkranen bij de inerte gasinlaat en de afvoer van het spoelvat, sluit u de naaldklep, verwijdert u de dop bij de injectiepoort en opent u ten slotte de stopkraan bij de afvoer. De NaOH-val (links) moet in lijn tussen het spoelvat en de CLD worden geplaatst als de VCl3 in HCl-test wordt uitgevoerd vanwege de corrosie van HCl. De verbinding met de CLD vereist altijd dat een intens veld diëlektrisch (IFD) filter wordt geplaatst tussen de CLD en de uitgang van het spoelvat (of de NaOH-val, indien gebruikt). Het IFD-filter verwijdert deeltjes in de lucht en voorkomt dat vloeistof door het spoelvat gaat. PTFE = polytetrafluorethyleen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Als gevolg hiervan kan elke verbinding die door een specifieke en gecontroleerde chemische reactie in NO kan worden omgezet, met hoge gevoeligheid worden gedetecteerd in elke biologische vloeistof en weefselhomogenaat24. Directe meting van gasfase NO door chemiluminescentie wordt uitgevoerd in zowel experimentele als klinische omgevingen. Deze technieken worden elders uitgebreid beschreven 33,34,35. Meting van NO2-, S-nitrosothiolen, S-nitrosated eiwitten en Fe-NOs kan worden uitgevoerd door monsters toe te voegen in een reactiemengsel met triiodide (I3-), dat stoichiometrisch GEEN gas vrijgeeft uit al deze verbindingen:
I3- → I2 + I-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
terwijl ik3- niet reageert met NO 3-15. Nauwkeurige metingen van elke verbinding worden mogelijk gemaakt door voorbehandeling van monsters met aangezuurd sulfanilamide (AS) met of zonder kwikchloride (HgCl2). In het bijzonder verwijdert de voorbehandeling met AS alle NO 2-inhoud. Als gevolg hiervan weerspiegelt het NO-gehalte gemeten door de CLD alleen de som van de concentratie van S-NOs en Fe-NOs. Injectie van HgCl2 in een monster aliquot vóór AS-injectie zorgt ervoor dat NO2- wordt vrijgegeven door S-NO. Behandeling met AS (leidend tot NO 2-verwijdering) zorgt ervoor dat het gemeten NO-gehalte alleen de concentratie van Fe-NOs weerspiegelt. Een reeks aftrekkingen tussen de beoordelingen maakt het mogelijk om de precieze concentratie van de drie NO-derivaten te berekenen22.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> Figuur 3: Stappen in monstervoorbereiding voor de I3- in azijnzuur chemiluminescentietest. De opeenvolgende stappen voor de bereiding van de I3- in azijnzuur chemiluminescentietest worden geïllustreerd. Het gebruik van lichtbeveiligde centrifugebuizen is vereist. De buizen 1, 2 en 3 worden gebruikt om de test voor te bereiden. Een ander monster aliquot (buis 4) is nodig voor de VCl3 in HCl-test als de meting van nitraat (NO3-) vereist is. Stappen worden aangegeven met cijfers in het rood. Voorvullen (stap 1) zoals aangegeven met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) of HgCl2 voordat het monstervolume wordt toegevoegd. Voeg het monstervolume (2) toe zoals aangegeven, vortex, en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voeg (3) PBS of aangezuurd sulfanilamide (AS) toe zoals aangegeven, vortex en incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Voer de test uit (4). De concentratie gemeten met de test is de som van de concentratie van de verbindingen die onder elke buis worden gerapporteerd. Buis nummer 1 maakt metingen van nitriet (NO2-), S-nitrosothiolen (S-NO) en ijzer-nitrosylcomplexen (Fe-NOs) als één signaal mogelijk. Voor nitraatmetingen (NO3-) moeten monsters worden uitgevoerd met zowel I3- in azijnzuur als VCl3 in HCl-assays, en de waarde verkregen uit buis 1 moet worden afgetrokken van die verkregen uit buis 4. *voorgestelde hoeveelheden die moeten worden gebruikt voor Hb-analyse voor de bepaling van restnummer2-, S-nitrosohemoglobine en ijzer-nitrosyl-hemoglobine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Voor NO 3-meting wordt Vanadium (III) chloride (VCl3) in zoutzuur (HCl) gebruikt voor de omzetting van NO3- in NO in het spoelvat om NO3- stoichiometrisch te meten met de CLD:
2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+
Om een voldoende snelle omzetting te bereiken, moet de reactie worden uitgevoerd bij 90-95 °C. Reductie van NO3- naar NO2- gaat gepaard met reductie van NO2- naar NO door HCl. Vanadiummetaal vermindert ook S-NOs waardoor hun NO-deelwordt bevrijd 22,36. De eindconcentratie verkregen door CLD met VCl3 in HCl weerspiegelt de totale concentratie van NO3-, NO2 en andere nitrosaatverbindingen. Aftrekking van deze laatste waarde van de met CLD met I3- opgewekte concentratie maakt het mogelijk om NO3- concentratie36,37 te berekenen (figuur 3).
In de NO-consumptietest genereert de continue afgifte van NO in het spoelvat door NO-donoren zoals (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolaat (DETA-NONOaat) een stabiel signaal waardoor celvrije oxyHb in de geïnjecteerde monsters kan worden gekwantificeerd. De hoeveelheid NO die in het zuiveringsvat wordt verbruikt, staat in een stoichiometrische relatie met de hoeveelheid oxyHb in het monster38.
Protocollen voor het meten van NO2-, NO3-, S-nitrosothiolen, ijzer-nitrosylcomplexen en NO-consumptie door celvrij Hb in plasmamonsters worden geïllustreerd. Studies naar NO in de RBC-omgeving vereisen een specifieke monsterbehandeling gevolgd door exclusiechromatografie om extreem fragiele S-NO-Hb en Hb-NO te meten in combinatie met de bepaling van de totale Hb-concentratie15,22. Monstervoorbereiding is instrumenteel bij het corrigeren van metingen. Het pre-bestaan van NO2- in H2O en het vrijkomen van NO2- tijdens de test kan leiden tot meting van kunstmatig hogere concentraties NO-derivaten zoals S-NO-Hb14,39. Belangrijke aspecten van monstervoorbereiding worden ook gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - vloeistof</td></tr><tr><td>Antifoam B Emulsie</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - vloeistof</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) zonder calcium, zonder magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Zoutzuur 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - vloeistof</td></tr><tr><td>Jodium</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - vast</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Kwik(II)chloride ACS reagens > 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - vast (oplossen in water)</td></tr><tr><td>Mili-Q Waterzuiveringssysteem</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 705 RN 50 µL spuit</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Microliter spuit</td></tr><tr><td>Model 802 N 25 µL spuit</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Microliter spuit</td></tr><tr><td>N-ethylmaleïmide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g - kristallijn</td></tr><tr><td>Stiikstofmonoxide-analysator + bundelsoftware - uitspoelvat</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Chemiluminescentie detector</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferraat (III) ACS reagens > 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - poeder</td></tr><tr><td>Kaliumjodide ACS reagens > 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - vast</td></tr><tr><td>Kaliumnitriet kristallen. Voor analyse EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - kristallijn</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Mechaanse homogenisator</td></tr><tr><td>RV3 Tweedelige roterende schotpomp</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>Vacuümpomp - Gebundeld met analyaor</td></tr><tr><td>Natriumheparine - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 USP eenheden</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide watervrij ACS reagens > 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - pellets</td></tr><tr><td>Natriumnitraat ACS reagens > 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - poeder</td></tr><tr><td>Natriumnitriet > 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - kristallijn</td></tr><tr><td>Sulfanilamid > 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - vast</td></tr><tr><td>Vanadium(III)chloride</td><td>Sigma</td><td>112393</td><td>25 g - vast - Voorzichtig (exotherm)</td></tr><tr><td>Whatman 1 Filterpapier</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Stikstofmonoxide (NO) activiteit in vivo is de gecombineerde resultaten van de directe effecten, de werking van de derivaten gegenereerd door NO autoxidatie, en de effecten van nitrosated verbindingen. Het meten van NO-metabolieten is essentieel voor het bestuderen van NO-activiteit, zowel op vasculaire niveaus als in andere weefsels, vooral in de experimentele omgevingen waar exogene NO wordt toegediend. Op ozon gebaseerde chemiluminescentietests maken nauwkeurige metingen van NO- en NO-metabolieten mogelijk in zowel vloeistoffen (inclusief plasma, weefselhomogenaten, celculturen) als gasmengsels (bijv. Uitgeademde adem). NO reageert met ozon om stikstofdioxide te genereren in een aangeslagen toestand. De daaruit voortvloeiende lichtuitstraling maakt fotodetectie en het genereren van een elektrisch signaal mogelijk dat het NO-gehalte van het monster weerspiegelt. Aliquots uit hetzelfde monster kunnen worden gebruikt om specifieke NO-metabolieten te meten, zoals nitraat, nitriet, S-nitrosothiolen en ijzer-nitrosylcomplexen. Bovendien wordt NO geconsumeerd door celvrij hemoglobine ook gekwantificeerd met chemiluminescentieanalyse. Een illustratie van al deze technieken wordt gegeven.

De NO-consumptie door celvrije Hb-test werd gebruikt in monsters met bekende concentraties celvrij oxyHb (figuur 4). Omdat één heem oxyHb stoichiometrisch één NO-molecuul vrijgeeft in de test, wordt gezuiverde celvrije oxyHb gebruikt om de kalibratiecurve voor de test te bouwen (aanvullende figuur 3).
De dosis-responsrelatie tussen celvrij Hb (gemeten met een colorimetrische assay) en NO-consumptie bij patiënten die tijdens hartchirurgie van cardi...

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om vakkundig een chemiluminescentiedetector te gebruiken voor het meten van stikstofmonoxidemetabolieten zonder de begeleiding of kosten van het in dienst nemen van toegewijd personeel ter plaatse. Chemiluminescentie-gebaseerde test is de meest gevoelige methode om minimale veranderingen in de niveaus van stikstofmonoxide en zijn metabolieten in een bepaald biologisch monster te detecteren. Geïnhaleerd stikstofmonoxide is een therapeutisch gas dat wordt gebruikt voor een breed scala aan ziekten.Het is van cruciaal belang dat ziekteprogressie en herstel nauwkeurig worden gecorreleerd met stikstofmonoxidemetabolietniveaus. Geïnhaleerd stikstofmonoxide, een antimicrobieel middel, is veelbelovend bij de behandeling van patiënten met infectieziekten in de luchtwegen. De chemiluminescentiemethode geeft inzicht in het correleren van stikstofmonoxidedosis en zijn metabolieten met microbiologische en pathofysiologische veranderingen.Om de DETA-NONOate-oplossing te bereiden, voegt u 10 milligram DETA-NONOaat toe aan 610 microliter 10-millimolair natriumhydroxide in PBS van pH 7,4 om 100 millimolar DETA-NONOaat te genereren en het op ijs te houden. Om verder te gaan, sluit u de zuurstofleiding aan op de chemiluminescentiedetector en opent u de zuurstoftank met een druk volgens de instructies van de fabrikant in de tekst. Sluit vervolgens de diëlektrische filterlijn met een intens veld aan op de chemiluminescentiedetector.Begin op de chemiluminescentiedetectorinterface met het uitvoeren van het detectieprogramma voor vloeistoffasetests, zorg ervoor dat de zuurstoftoevoer voldoende is en de detector begint met bemonstering, wat wijst op detectie per signaal in millivolts, anders een negatief diagnostisch signaal. Om het spoelvat voor te bereiden, sluit u het spoelvat op alle drie de poorten door de naaldklep volledig naar rechts te schroeven en de inlaat- en uitlaatstopkranen te sluiten. Verwijder de dop van het spoelvat.Voeg een voldoende hoeveelheid van het reagens dat specifiek is voor de geplande test toe aan de reactiekamer, zodat de spuitnaald die wordt gebruikt om de monsters te injecteren de vloeistofkolom kan bereiken en tegelijkertijd de aanwezigheid van een stabiele, gewenste uitgangswaarde kan verifiëren. Om de spoelgasstroom te starten, moet u ervoor zorgen dat de inerte gastank is uitgerust met een tweetrapsregelaar en de inerte gastank verbinden met de gasinlaat van het vat. Open vervolgens de uitlaat van het spoelvat en open het gas met een uitlaatdruk op de regelaar van één tot vijf pond per vierkante inch.Open vervolgens de inlaat van het spoelvat en open langzaam de naaldklep van het spoelvat om de instroom van gas mogelijk te maken en het borrelen in het spoelvat te verifiëren. Om de gasstroom aan te passen, registreert u de celdruk gemeten door de chemiluminescentiedetector met de intense-veld diëlektrische filterlijn die omgevingslucht bemonstert. Verplaats de dop op het spoelvat en sluit de diëlektrische filterleiding met intense velden aan op het spoelvat.Gebruik de naaldklep om dezelfde celdruk te bereiken op het niveau van de chemiluminescentiedetector dat wordt geregistreerd in de omgevingslucht. Om het chemiluminescentiesignaalacquisitieprogramma te starten, sluit u de seriële poort van de chemiluminescentiedetector aan op de seriële poort van de computer waarin het acquisitieprogramma is geïnstalleerd. Voer vervolgens het analyseprogramma uit.Klik op Verwerven, selecteer vervolgens de map om het gegevensbestand op te slaan, typ de bestandsnaam en klik op Opslaan. Pas tijdens de voorbereiding op monsterinjectie de spanningsschaal op het scherm aan om controle te hebben over de beoogde basislijn door op de minimum- en / of maximumknoppen te klikken en vervolgens de gewenste waarde in te voeren. Om de monsterinjectie uit te voeren, spoelt u de spuit ten minste tweemaal of meer met gedeïoniseerd en gedestilleerd water voordat u elk monster opneemt en zorgt u voor een onbelemmerde wateruitworp op een taakdoekje.Plaats vervolgens de spuit in de monsterbuis terwijl u zowel de spuit als de buis op korte afstand houdt en trek de zuiger op tot het gewenste volume terwijl u ervoor zorgt dat er geen luchtbel of niet-gehomogeniseerde vaste delen worden opgesloten. Reinig de punt van de spuit met een taakwisser en steek de spuit in de setterdop bij de injectiepoort. Nadat u hebt gecontroleerd of de punt van de spuit zich in de vloeibare fase bevindt, injecteert u het monster in de reactiekamer.Om de injectie in het softwareprogramma te markeren, typt u de monsternaam door op het grijze vak onder Monsternamen te klikken en vervolgens op Injectie markeren terwijl u controleert of de injectie een opwaartse verandering in het signaal of naar beneden in het stikstofmonoxideverbruik veroorzaakt door celvrije hemoglobinetest. De dosisresponsrelatie tussen celvrij hemoglobine- en stikstofmonoxideverbruik werd gemeten door chemiluminescentie na cardiopulmonale bypass. Er kan worden aangenomen dat er een hoge concentratie heemgroepen is in de geoxideerde status die stikstofmonoxide opruimt.Bij patiënten die stikstofmonoxide krijgen tijdens cardiopulmonale bypass, is in plaats daarvan de meerderheid van de heemgroepen verminderd en verbruikt geen stikstofmonoxide. Metingen van de celvrije hemoglobineconcentratie wezen op een langzame eliminatie uit plasma binnen 12 uur na cardiopulmonale bypass. De consumptie van stikstofmonoxide piekte echter na 15 minuten en weerspiegelde niet de eliminatie van celvrij hemoglobine.De lineaire regressiecurven van stikstofmonoxideconsumptie door celvrij hemoglobine vertoonden een prevalentie van geoxideerd en stikstofmonoxide-consumerend hemoglobine na 15 minuten, in tegenstelling tot meer verlaagd hemoglobine bij baseline 4 uur en 12 uur post-cardiopulmonale bypass. De effecten van stikstofmonoxidegastoediening op het stikstofmonoxideverbruik werden gemonitord. Wanneer patiënten intra- en postoperatief met stikstofmonoxidegas werden behandeld, was de waargenomen toename van vrij hemoglobine na de cardiopulmonale bypass niet gekoppeld aan een toename van het stikstofmonoxideverbruik.De resultaten gaven aan dat exogene toegediend stikstofmonoxide het grootste deel van het vrije hemoglobine verminderde en stikstofmonoxide-opruiming voorkwam. Het experiment is alleen geldig als alle voorwaarden hetzelfde blijven. Als de hoogte van het vloeistofniveau de reactiekolom overschrijdt, moeten we stoppen en een nieuwe kalibratie uitvoeren.

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden voor het testen en evalueren van de aanwezigheid van reactieve zuurstofradicalen in de cellen.

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

De endogene productie van stikstofoxide (NO) regelt diverse biologische functies. Het wordt steeds duidelijker dat verstoring of ontregeling van NO op basis van signalering is betrokken bij vele ziekten bij de mens. Methoden voor het kwantificeren van relevante NO metabolieten kunnen nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers voor ziekte bij de mens.

Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

NADPH oxidase is de belangrijkste bron van reactieve zuurstof species (ROS) in fagocyten. Vanwege de vluchtigheid van ROS is moeilijk te meten en te controleren ROS levels in levende dieren. Een minimaal invasieve methode voor seriële kwantificering van ROS in levende muizen beschreven.

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O 2 .- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.

En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Dit protocol beschrijft een nieuwe intraoperatieve beeldvormingstechniek die gebruik maakt van een rutheniumcomplex als bron van chemiluminescente lichtemissie, waardoor hoge signaal-ruisverhoudingen worden geproduceerd tijdens in vivo beeldvorming. Intraoperatieve beeldvorming is een groeiend veld dat de manier waarop chirurgische ingrepen worden uitgevoerd, zou kunnen revolutioneren.

Een nieuwe techniek voor het genereren en Observing Chemiluminescence in een biologische instelling

Stikstofmonoxide (NO) is een belangrijk signaalmolecuul bij vasculaire homeostase. NO-productie in vivo is te laag voor directe meting. Chemiluminescentie biedt nuttige inzichten in de NO-cyclus via het meten van zijn precursoren en oxidatieproducten, nitriet en nitraat. De bepaling van nitriet/nitraat in lichaamsweefsels en -vloeistoffen wordt uitgelegd.

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Dit manuscript presenteert protocollen voor de toepassing van nieuwe genetisch gecodeerde stikstofmonoxide (NO•) sondes (geNOps) om NO• schommelingen in één cel in real-time te monitoren met behulp van fluorescentiemicroscopie. De Ca2+-getriggerde NO• vorming op het niveau van individuele endotheelcellen werd gevisualiseerd door geNOps te combineren met een chemische Ca2+ sensor.

Toepassing van genetisch gecodeerde Fluorescent stikstofoxide (NO •) Probes, de geNOps, voor real-time beeldvorming van NO • Signalen in afzonderlijke cellen

We presenteren protocollen voor drie verschillende methoden voor de homogenisatie van vier verschillende spiergroepen van rattenskeletspierweefsel om de niveaus van nitraat en nitriet te meten en te vergelijken. Verder vergelijken we verschillende monstergewichten om te onderzoeken of de grootte van het weefselmonster de resultaten van homogenisatie beïnvloedt.

Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen

Het vastleggen van dynamische veranderingen in de eiwitactivering van geënucleeerde rode bloedcellen brengt methodologische uitdagingen met zich mee, zoals het behoud van dynamische veranderingen in acute stimuli voor latere beoordeling. Het gepresenteerde protocol beschrijft monstervoorbereidings- en kleuringstechnieken die het behoud en de analyse van relevante eiwitveranderingen en daaropvolgende detectie mogelijk maken.

Op immunostaining gebaseerde detectie van dynamische veranderingen in rode bloedceleiwitten

Dit protocol beschrijft een methode om de productie van stikstofoxide (NO) te kwantificeren in luchtwegepitelculturen die gedifferentieerd zijn bij het lucht-vloeistofinterface (ALI) door nitriet te meten in apicale secreties met behulp van een trijodide-gebaseerde chemiluminescentie-assay.

Meting van stikstofmonoxideproductie in muizen-tracheale epitheelcelculturen, onderscheiden aan de lucht-vloeistofgrens

Leer chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en metabolieten in biologische monsters. Deze gevoelige methode helpt onderzoekers bij het meten van minimale veranderingen zonder gespecialiseerd personeel ter plaatse.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds (Video) | JoVE Journal

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Meer video's verkennen