Gemanipuleerde longweefsels bereid uit gedecellulariseerde longplakken

Dit protocol maakt het herhaalbare gebruik van intacte long extracellulaire matrix mogelijk als een driedimensionaal weefselkweeksubstraat en matige doorvoer. Het belangrijkste voordeel van het gemanipuleerde longweefselsysteem is de flexibiliteit van het platform. ELTs kunnen worden aangepast om verschillende weefselsteigers, cellen of kweekmedia van belang te gebruiken.

Zodra de longen zijn geëxtraheerd, vult u een spuit van 10 milliliter met agarose en HBSS zonder fenolrood. Blaas de longen op met ongeveer 10 milliliter lucht via de luchtpijpcanule en injecteer vervolgens onmiddellijk de bereide agarose via de luchtpijpcanule totdat de meest distale uiteinden van de longlobben zijn opgeblazen. Sluit de luchtpijp af door de witte dop van een vierwegstophaan aan het vrouwelijke luerslot van de tracheale canule te bevestigen.

Plaats de long in een petrischaaltje van 150 millimeter op ijs om de agarose te laten stollen. Bereid de longplakken volgens het protocol in het manuscript en vul vervolgens een petrischaaltje van 100 millimeter met 1/3 volume PBS. Breng cassettes en lipjes over naar de schotel met behulp van een tang.

Als de plakjes bevroren zijn, ontdooi dan één gerecht per keer door PBS op kamertemperatuur te gieten. Breng vervolgens een ontdooide plak over op een petrischaaltje van 150 millimeter. Vouw het plakje voorzichtig open met behulp van een fijne tang of een hemostat en zuig voorzichtig overtollige PBS op van rond het weefsel.

Snijd vervolgens een drie millimeter brede, minstens negen millimeter lange strook uit de plak door de volledige lengte van een scheermesje stevig tegen de schaal te drukken en het lichtjes van links naar rechts te wiegen. Als u de tissuestrip in de cassette wilt knippen, zweeft u deze boven de cassette en centreert u deze voorzichtig om langs de gaten in de clips aan beide uiteinden te lopen. Plaats een lipje gedeeltelijk in het gat aan het ene uiteinde met een fijne tang, maak het weefsel voorzichtig recht en zet het tweede lipje.

Gebruik ten slotte een tang om elk lipje volledig in te drukken om het weefsel vast te zetten. Breng na het knippen van alle zijkanten de schotel van 100 millimeter met de cassettes over op een laminaire stromingskap. Breng cassettes over op zes-well platen met de eerste decellularisatie-oplossing met behulp van een gebogen hemostat om de gekerfde zijden vast te pakken.

Plaats vervolgens de zes-well plaat op een orbitale shaker op 30 RPM gedurende 10 minuten. Zuig de vloeistof uit elke put en vervang deze vervolgens door drie milliliter van de tweede decellularisatieoplossing per put. Plaats de plaat op een orbitale shaker met 30 RPM en incubeer gedurende vijf minuten.

Herhaal dit proces met elke oplossing zoals beschreven in het decellularisatieprotocol in het manuscript. Breng na de laatste spoeling met PBS weefsels over naar steriele zesputtenplaten met verse PBS met antibiotica en antimycotica en incubeer gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius. Na sterilisatie met antibiotica en antimycotica kunnen longweefselsteigers onmiddellijk worden gezaaid of tot 30 dagen bij vier graden Celsius worden bewaard.

Voordat u het voor cultuur gebruikt, incubeert u steigers die zijn opgeslagen bij vier graden Celsius met verse PBS en antibiotica en antimycotica 's nachts bij 37 graden Celsius als een extra sterilisatiestap. Spoel vervolgens steigers met steriele PBS, vijf milliliter per put, drie keer, gedurende vijf minuten elk. Onderzoek steigers onder een fasecontrastmicroscoop bij 5X-vergroting om weefsels te selecteren voor zaaien.

Bereid de endotheelcelsuspensie in endotheelmedium voor met 5 miljoen cellen per milliliter met voldoende cellen om 500.000 endotheelcellen per plak te zaaien. Plaats geautoclaveerde zaaibaden in petrischalen van 100 millimeter en breng de spoelsteigers voorzichtig ondersteboven over in de zaaibaden. Draai voorzichtig de bereide celsuspensie om te mengen.

Pipetteer vervolgens voorzichtig 100 microliter cellen direct bovenop elk weefsel aan de basis van de putten, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel niet wordt beschadigd met de pipetpunt. Breng de gezaaide weefsels over naar de celkweekincubator. Voeg 24 uur na het zaaien van endotheelcellen 900 microliter voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put met behulp van een handmatige pipet en breng de plaat vervolgens terug naar de incubator.

Verwijder na 24 uur celzaaien het medium en vervang de ene milliliter vers endotheelmedium per put. 72 uur na het zaaien van de endotheelcellen, tel AEC2s, of alveolaire epitheliale type II-cellen, en fibroblasten met behulp van een hemocytometer en bereid een 1: 1-celsuspensie in AEC2-groeimedium met 5 miljoen cellen per milliliter. Pipetteer het medium uit elk zaaibad goed en draai voorzichtig de voorbereide celsuspensie.

Pipetteer 100 microliter cellen direct bovenop elk weefsel aan de basis van de put. Breng de gezaaide weefsels over naar de celkweekincubator. Voeg na twee uur 900 microliter voorverwarmd AEC2-groeimedium toe aan elke put en breng de plaat terug naar de incubator.

Bereid na 24 uur kweken met AEC2's en fibroblasten een 12-wellsplaat met één milliliter voorverwarmd AEC2-groeimedium per putje, per cassette. Pipetteer 800 microliter medium uit elke put van het zaaibad, verwijder vervolgens de cassettes uit het zaaibad en breng ze aan de rechterkant over op de voorbereide 12-well plaat, één cassette per put. Verander het kweekmedium zorgvuldig met behulp van een glazen Pasteur pipet om de andere dag voor de gewenste kweekduur.

Controleer de mate van weefselherbevolking via fasecontrastmicroscopie bij 5X-vergroting gedurende de hele kweekduur. H- en E-kleuring van weefselsteigers toonde een bewaarde alveolaire architectuur na decellularisatie zonder zichtbare celkernen. Alveolair weefsel werd waargenomen wanneer gedecelluliseerde extracellulaire matrixsteigers werden bekeken bij 5X vergroting door fasecontrastmicroscopie.

In sommige plakjes waren ook grote vertakkende luchtwegen en vaten zichtbaar. Op dag zeven van de kweek toonde fasecontrastmicroscopie aan dat het patroon van recellularisatie in gemanipuleerde longweefsels de alveolaire structuur van weefsels emuleerde in gevallen van succesvolle herbevolking. Slechte recellularisatie was ook zichtbaar.

H- en E-kleuring op dag zeven of acht toonde herbevolking van de alveolaire septa. Immunofluorescentiestand onthulde pro-collageen type I alfa 1-positieve fibroblasten, ABCA3-positieve AEC2's, CD31-positieve endotheelcellen, ans overvloedige SPB-positieve AEC2's. Bovendien toonde de thymidinetest veel prolifererende AEC2's.

Deze techniek heeft de ontwikkeling van strategieën voor longweefseltechnologie vergemakkelijkt en heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar wachtrijen die type II-celproliferatie en differentiatie binnen de alveolus ondersteunen.