Standaardisatie en onderhoud van 3D canine hepatische en intestinale organoïde culturen voor gebruik in biomedisch onderzoek
January 31st, 2022
Experimentele methoden om volwassen stamcellen uit intestinale en leverweefsels van honden te oogsten om 3D-organoïde culturen vast te stellen, worden beschreven. Bovendien worden de laboratoriumtechnieken besproken om een consistente groei te garanderen en standaard operationele procedures te bieden om intestinale en hepatische organoïdeculturen van honden te oogsten, biobank en nieuw leven in te blazen.
De protocollen voor de kweek van hondenhepatische en intestinale organoïden zijn belangrijk voor het standaardiseren van deze nieuwe technologie. Deze techniek maakt de betrouwbare en reproduceerbare vaststelling van de organoïde cultuur van de hond mogelijk, inclusief de organoïde isolatie, onderhoud, oogst en daaropvolgende biobanking van monsters. Canine organoïden kunnen een uitstekend model bieden voor tal van toepassingen, variërend van biologie, ontwikkeling van infectieziekten, het testen en ontdekken van geneesmiddelen, en ook transmissiegeneeskunde.
Bereid om te beginnen vijf centrifugebuizen van 15 milliliter met vijf milliliter 1X complete chelaatoplossing, één buis met drie milliliter 1X complete chelaatoplossing, één lege buis en één buis met vijf milliliter 1X complete chelaatoplossing en twee milliliter foetaal runderserum. Plaats op de dag van isolatie een steriele petrischaal, scalpel, ijsemmer en koud geavanceerd DMEM-voedingsmengsel F12 in de bioveiligheidskast. Plaats het vereiste aantal 24-well celkweekplaat in de kooldioxide-incubator om voor te verwarmen.
Plaats opgeloste extracellulaire membraanmatrix op ijs om te ontdooien. Koel de centrifuge voor op vier graden Celsius. Verplaats complete media met groeifactoren van de vriezer naar een waterbad van 37 graden Celsius om directe blootstelling aan licht te voorkomen.
Schud weefselmonsters gedurende 30 seconden in de transportbuis. Verwijder overtollig supernatant zonder weefsel weg te gooien door langzaam te pipetteren in de buurt van het vloeistofoppervlak totdat er 0,5 milliliter in de buis achterblijft. Breng weefsel en restant over in een steriel petrischaaltje.
Snijd en gehakt het weefsel met behulp van een wegwerp scalpel in kleinere stukjes die lijken op een pureeconsistentie gedurende ongeveer vijf minuten. Pipetteer het gehakte weefsel met vloeistof uit de petrischaal naar de eerste complete chelaatoplossingsbuis en voeg vervolgens twee milliliter geavanceerd DMEM-voedingsmengsel F12 toe aan de petrischaal. Spoel het resterende weefsel en breng het over naar de eerste volledige chelaatoplossingsbuis.
Vortex de 1X complete chelaatoplossingsbuis ongeveer vijf keer gedurende vijf seconden. Laat biopten gedurende één minuut op de bodem van de buis bezinken en verwijder het supernatant totdat er vijf milliliter over is. Breng de 1x complete chelaatoplossing over van de nieuwe buis naar de monsterbuis.
Herhaal de vorige stap voor de volgende twee buizen. En verwijder bij de laatste twee wasbeurten het supernatant tot drie milliliter die nog in de buis zitten. Breng de biopten en 1x volledige chelaatoplossing van de monsterbuis over naar één put van een plaat met zes putten.
Voeg drie milliliter 1x complete chelaatoplossing toe aan de monsterbuis. Draai voorzichtig om eventueel overgebleven weefsel te verzamelen en breng het over naar dezelfde put van de plaat. Voeg 150 microliter ethyleendiamine tetra-azijnzuur toe aan 0,5 molair ethyleendiaminetetra-azijnzuur en plaats de zesputplaat op een rocker van 20 graden 24 RPM bij vier graden Celsius.
Incubeer de levermonsters gedurende 10 minuten en de darmmonsters gedurende een uur op de bewegende rocker. Transporteer de zes-well plaat terug naar de bioveiligheidskast en breng het gehakte weefsel en de vloeistof over in een buis met 1X complete chelaatoplossing met foetaal runderserum. Laat de weefsels bezinken en transporteer het supernatant met 0,2 milliliter van het bovenste deel van het weefsel naar een lege buis.
Draai de buis met het monster gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 700 XG. Stamcellen worden nu samen met het gehakte weefsel gepelletiseerd. Verwijder en gooi het bovennatuurlijk voorzichtig weg om de pellet niet te verstoren.
Resuspend de pellet in geavanceerde DMEM F12. Draai de buis opnieuw en zuig het supernatant op zonder de pellet te storen. Voeg het berekende volume van de opgeloste extracellulaire membraanmatrix toe aan de monsterbuis.
Wees voorzichtig bij het verwijderen van media om de celkorrel niet te verliezen. Pipetteer bij het toevoegen van een extracellulaire membraanmatrix langzaam om geen overmatige bubbels in de organoïde suspensie te creëren. Houd het monster met de opgeloste extracellulaire membraanmatrix op ijs en zaai de suspensie in het midden van de putten, zodat de opgeloste extracellulaire membraanmatrix een koepelachtige structuur vormt.
Transporteer de plaat naar een incubator en laat de opgeloste extracellulaire membraanmatrix gedurende 30 minuten stollen. Meng ROCK-remmer en GSK3 beta in complete media met groeifactoren en voeg 500 microliter van deze oplossing toe aan elke put. Plaats het bord in de couveuse.
Het canine organoïde protocol genereert meestal ongeveer 50.000 tot 150.000 darm- of levercellen per put. Na stamcelisolatie beginnen hepatische hondenorganoïden hun levenscyclus als expanderende sferoïden en na zeven dagen veranderen ze in ontluikende en differentiërende organoïden. Het volume, het oppervlak, het 2D-ellipsoppervlak en de omtrek van de sferoïden werden berekend.
2D-ellipsgebied en omtrek werden gebruikt om de gezondheid van de organoïdecultuur te beoordelen. Beoordeling van de expressie van de markers op een semi-kwantitatieve manier toonde aan dat de sferoïden bij voorkeur de cholangiocytmarker KRT7 tot expressie brachten, variërend van één tot 26%De stamcelmarker LGR5-expressie varieerde tussen 0,17 en 0,78%, terwijl hepatocytmarkers in lagere mate tot expressie kwamen bij 0,05 tot 0,34% voor Forkhead box 1A en 0,03 tot 0,28% voor cytochroom-P450. Een incubatie van 12 minuten met trypsine-achtig protease remde de groei van organoïden niet.
De groei van organoïden werd echter negatief beïnvloed met behulp van een incubatie van 24 minuten. De overlevingskansen van canine hepatische organoïden in een ongunstige omgeving werd geanalyseerd om het volume van organoïde media en keldermatrix te bepalen dat nodig is voor de succesvolle groei en overleving van leverorganoïden. De overlevingskans van organoïden varieerde van 12,9 dagen tot 18 dagen.
Basis celkweektechnieken en aseptische benaderingen zijn de essentiële voorwaarden voor een goede organoïde isolatie en onderhoud.
Overzicht
Dit artikel beschrijft experimentele methoden voor het oogsten van volwassen stamcellen uit hondenintestinale en leverweefsels om 3D-organoïde culturen te vestigen. Het schetst laboratoriumtechnieken voor consistente groei en standaard operationele procedures voor het oogsten, biobanking en het nieuw leven inblazen van deze organoïd culturen.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Stamceldonderszoek
- Organoïde Technologie
Achtergrond
- Hondenorganoïden dienen als modellen voor verschillende biologische toepassingen.
- Standaardisatie van organoïdcultuurprotocollen is cruciaal voor reproduceerbaarheid.
- Technieken omvatten isolatie, onderhoud en oogsten van organoïden.
- Begrip van organoïdgroeidynamiek is essentieel voor hun toepassing in onderzoek.
Doel van het Onderzoek
- Betrouwbare protocollen vaststellen voor hondenintestinale en leverorganoïde culturen.
- Biobanking en het nieuw leven inblazen van organoïdmonsters faciliteren.
- De groei en gezondheid van organoïden onder verschillende omstandigheden beoordelen.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van chelerende oplossingen en celcultuurplaten.
- Isolatie en fijnhaksel van weefselmonsters.
- Incubatie van monsters met specifieke oplossingen om groei te bevorderen.
- Beoordeling van de gezondheid van organoïden door middel van morfologische metingen.
Belangrijkste Resultaten
- Hondenorganoïde protocollen leveren 50.000 tot 150.000 cellen per putje op.
- Organoïden vertonen verschillende groeifasen en markerexpressie.
- Overlevingspercentages van organoïden variëren op basis van omgevingsomstandigheden.
- Incubatietijden hebben een significant effect op de groeiresultaten van organoïden.
Conclusies
- Standaardiseerde protocollen verbeteren de betrouwbaarheid van hondenorganoïde culturen.
- Begrip van groeidynamiek is essentieel voor succesvolle toepassingen.
- Toekomstige studies kunnen deze organoïden gebruiken voor medicijntesten en ziektemodellering.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Standardized 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures provide a reproducible, scalable platform for translational drug discovery and toxicology assessment. These organoid systems enable predictive modeling of complex disease biology, supporting mechanistic de-risking and target validation in large animal models relevant to human medicine. Biobanking and maintenance protocols further enhance portfolio continuity and reduce reliance on continuous tissue harvesting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant canine models.
- Supports mechanistic de-risking by modeling multifactorial disease pathways in vitro.
- Facilitates functional target validation through quantitative marker expression and morphological assessment.
- Provides a platform for predictive confidence in early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible organoid cultures for downstream compound screening.
- Enables quantitative assessment of organoid health via 2D ellipse area and circumference measurements.
- Supports assay scalability and platform reuse through biobanking and indefinite sub-culturing.
- Improves reliability of drug permeability and toxicology testing in a controlled system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling canine diseases analogous to human conditions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation using biobanked organoid lines.
- Reduces biological risk by providing a robust, disease-relevant preclinical model.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on organoid viability and marker expression data.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position canine organoid cultures as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in a scalable, reusable format.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking via marker expression and morphological metrics.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organoid systems for compound evaluation and toxicology assessment.
- Analytics: Enables quantitative readouts such as cell yield, viability, and marker expression for condition comparison.
- Translational Research: Supports preclinical continuity and biomarker alignment in disease-relevant canine models.
- Enterprise Reuse: Biobanking protocols allow for long-term storage and repeated use across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports scalable culture expansion.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates using robust, reproducible data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and aseptic technique for reliable organoid isolation and maintenance.
- Demands access to specialized instrumentation, including biosafety cabinets, incubators, and imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or disease models within the canine system.
- Limitations include sensitivity to incubation times and environmental conditions affecting organoid viability.
