Transplantatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide microglia in immunocompetente muizenhersenen via niet-invasieve transnasale route
31 mei 2022
Het hier gepresenteerde protocol maakt de transplantatie van geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide menselijke microglia (iPSMG) in de hersenen mogelijk via een transnasale route bij immunocompetente muizen. De methode voor de bereiding en transnasale transplantatie van cellen en de toediening van cytokinemengsel voor het onderhoud van iPSMG wordt getoond.
Dit protocol maakt een niet-invasieve transplantatie van iPSMG in immunocompetente muizenhersenen mogelijk door farmacologische aan/uit van een CSF1-receptorantagonist PLX5622 te combineren met transnasale transplantatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat iPSMG kan worden getransplanteerd zonder hersenschade te veroorzaken, zelfs bij immunocompetente muizen. Microgliale transplantatie kan dienen als een potentiële therapie om disfunctionele microglia uit te wisselen met functionele microglia bij verschillende neurodegeneratieve ziekten in de toekomst.
De procedure wordt gedemonstreerd door Bijay Parajuli, een onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin met het snel ontdooien van de bevroren geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide menselijke microgliacellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Draai de monsters totdat al het zichtbare ijs is gesmolten.
Voeg de ontdooide iPSMG toe aan de kweekmedia, opgewarmd tot 37 graden Celsius. Voeg één milliliter cellen toe aan 10 milliliter kweekmedia. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 300 maal g om een celkorrel te verkrijgen.
Verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Voeg het transplantatiemedium toe om een celconcentratie van 10 tot de vijfde cel per microliter te verkrijgen. Plaats de iPSMG op ijs en ga onmiddellijk over tot transplantatie.
Om muizen voor te bereiden op transnasale transplantatie, voedt u de mannelijke muizen met een dieet met PLX gedurende zeven dagen. Aan het einde van de zevende dag stopt u met het PLX-dieet en voedt u de muizen met een normaal dieet. Dien een uur voor transnasale transplantatie van iPSMG tweemaal 2,5 microliter hyaluronidase in PBS toe aan elk neusgat met behulp van een pipetpunt van 10 microliter om de permeabiliteit naar het neusslijmvlies te vergroten.
Plaats de muizen in rugligging na het aanbrengen van hyaluronidase. Dien 2,5 microliter hyaluronidase toe tien minuten voor de transnasale transplantatie van iPSMG. Breng 2,5 microliter celsuspensie aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 microliter.
Plaats de muis gedurende vijf minuten in rugligging voordat de celsuspensie aan het andere neusgat wordt toegediend. Dien de celsuspensie vier keer toe, waarbij een totaal volume van 20 microliter per dier wordt toegepast. Herhaal 48 uur na het stoppen van PLX-voeding de toediening van hyaluronidase en celsuspensie op dezelfde muizen.
Breng voor toediening van cytokines 2,5 microliter van het transplantatiemedium aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 microliter. Na twee maanden transnasale transplantatie kan het aantal getransplanteerde cellen worden bepaald door cellen te tellen die positief zijn voor zowel mensspecifieke als pan-microgliale markers. Endogene muismicroglia zijn alleen positief voor pan-microgliale marker.
Bij controlemuizen werden alleen muismicroglia gedetecteerd in zowel cortex als hippocampus. In de cortex van iPSMG getransplanteerde muizen werden alleen muismicroglia gedetecteerd, terwijl in de hippocampus iPSMG werden gedetecteerd. Bij het proberen van dit protocol is volledige verwijdering van supernatant essentieel om de verdunning van cytokines te voorkomen.
Het is cruciaal om cytokine elke 12 uur toe te passen voor de levensvatbaarheid van getransplanteerde cellen. Uitputting van endogene muismicroglia is vereist voor de transplantatie van iPSMG. Deze procedure maakt de transplantatie van iPSMG in een normaal of ziek muizenbrein mogelijk.
Zo kunnen de kenmerken van iPSMG en de respons op ziekte worden bepaald. Deze techniek is geschikt om de in vivo karakteristiek van iPSMG in het muizenbrein te bepalen. Het transplanteren van iPSMG in ziektemodelmuizen zal ons dus helpen de respons te begrijpen en kan de weg vrijmaken voor een nieuw therapeutisch doelwit.
Overzicht
Deze studie presenteert een niet-invasieve methode voor de transplantatie van uit geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide humane microglia (iPSMG) in de hersenen van immuuncompetente muizen via een transnasale route. Het protocol maakt gebruik van cytokinetoediening en de deletie van endogene microglia om een effectieve integratie van iPSMG mogelijk te maken, wat mogelijk de weg vrijmaakt voor therapeutische benaderingen bij neurodegeneratieve ziekten.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelonderzoek
- Microglia-biologie
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen worden gedifferentieerd tot functionele microglia.
- Microgliale dysfunctie is betrokken bij diverse neurodegeneratieve ziekten.
- Transnasale toediening biedt een nieuwe benadering voor celtransplantatie.
- Het toedienen van cytokinen is cruciaal voor de celviabiliteit na transplantatie.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor niet-invasieve transplantatie van microglia.
- Om de haalbaarheid van transnasale toediening bij het behoud van een normale hersenfunctie te beoordelen.
- Om het potentieel van iPSMG te evalueren bij het vervangen van dysfunctionele microglia.
Gebruikte methoden
- Het primaire platform omvat transnasale transplantatie van iPSMG in immuuncompetente muizen.
- Mannelijke muizen werden voorbehandeld met de CSF1-receptorantagonist PLX5622 en een hyaluronidase-oplossing om de nasale permeabiliteit te verhogen.
- Celsuspensies werden in meerdere doses toegediend over gespecificeerde tijdlijnen om een correcte integratie te waarborgen.
- Monitoring na transplantatie omvatte het beoordelen van de aanwezigheid en levensvatbaarheid van de getransplanteerde cellen.
Belangrijkste resultaten
- Getransplanteerde iPSMG werden succesvol geïntegreerd in de hippocampus van de muis zonder de endogene microglia te beschadigen.
- Toediening van cytokinen om de 12 uur was cruciaal voor het behoud van de celviabiliteit na transplantatie.
- Deze methode maakt het mogelijk om de respons van iPSMG te onderzoeken in zowel normale als ziektemodellen.
Conclusies
- Dit protocol faciliteert de in vivo studie van iPSMG, wat toekomstige gentherapieën voor neurodegeneratieve ziekten kan informeren.
- Inzicht in het gedrag van getransplanteerde microglia kan helpen bij het afbakenen van hun rol in de gezondheid van de hersenen.
- Deze aanpak kan nieuwe wegen openen voor innovatieve therapeutische doelwitten bij de behandeling van microglia-gerelateerde pathologieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Niet-invasieve transplantatie van menselijke iPSC-afgeleide microglia in de hersenen van immuuncompetente muizen maakt directe in vivo studie van de menselijke microgliale functie en ziekterespons mogelijk. Deze benadering overbrugt translationele kloven tussen microglia van knaagdieren en mensen, wat bijdraagt aan meer voorspellende preklinische modellen voor onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. Het protocol verbetert de validatie van targets en het mechanistische de-risking bij vroege ontdekkingsfasen en preklinische overgangspunten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt in vivo onderzoek naar de menselijke microgliabiologie binnen een mammale hersenomgeving mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door mensspecifieke microglia-responsen te onderscheiden van murine modellen.
- Faciliteert functionele validatie van targets voor neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve pathways.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd systeem voor het evalueren van de integratie en levensvatbaarheid van menselijke microglia in vivo.
- Maakt reproduceerbare kwantificering van getransplanteerde versus endogene microglia mogelijk met behulp van specifieke markers.
- Ondersteunt downstream screening van verbindingen die gericht zijn op de menselijke microgliële functie in een fysiologische context.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische modellen uit met de relevantie voor menselijke ziekten door menselijke microglia in muizenhersenen te integreren.
- Maakt beoordeling van de menselijke microgliale respons mogelijk in zowel gezonde muizen als muismodellen voor ziekten.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor de ontdekking van translationele biomarkers en het testen van therapeutische hypothesen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door functionele studies van menselijke microglia in vivo mogelijk te maken, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-compounds en translationele continuïteit.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over de rol van menselijke microglia bij hersenfysiologie en -pathologie.
- Screening: Levert kwantitatieve resultaten van celintegratie en levensvatbaarheid na transplantatie.
- Analyse: Maakt marker-gebaseerd onderscheid tussen menselijke en muismicroglia mogelijk voor een robuuste data-analyse.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert ziekterelateerde modellering door iPSMG te transplanteren in ziektemodelmuizen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van de menselijke microgliële functie in meerdere ziektecontexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert soortspecifieke ambiguïteit in onderzoek naar neuroinflammatie.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor niet-invasieve celtoediening en kwantificering voor reproduceerbaarheid tussen verschillende studies.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go beslissingen mogelijk voor therapeutica gericht op microglia door mens-relevante gegevens te verschaffen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor neurodegeneratieve ziekten door de getrouwheid van modellen te verbeteren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in iPSC-kweek, microgliadifferentiatie en in vivo transplantatietechnieken.
- Toegang tot farmacologische middelen voor depletie van endogene microglia en cytokinestuuning is noodzakelijk.
- Gestandaardiseerde protocollen voor celpreparatie, transplantatie en post-transplantatieanalyse zijn vereist.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van de afleverings- en depletieparameters vereisen.
- Continue cytokinetoediening is cruciaal voor de levensvatbaarheid van de getransplanteerde cellen, zoals ondersteund door het protocol.
