Generatie van luchtwegepitheelcel lucht-vloeistof interfaceculturen uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol is nuttig omdat het gemakkelijk te volgen stappen biedt die de generatie van functionele luchtwegepitheelcellen mogelijk maken, die vervolgens kunnen worden gebruikt om verschillende aspecten van de luchtwegbiologie te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het vermogen om veel functionele luchtwegepitheelcelculturen te genereren en tegelijkertijd de moeilijkheden van het verkrijgen en kweken van primaire luchtwegcellen te vermijden. De procedure wordt gedemonstreerd door Taylor Matte, een afgestudeerde student van ons laboratorium.

Begin met het ontdooien van een voldoende volume 3D-matrix op ijs. Houd het op ijs tot het klaar is voor gebruik. Ontdooi een injectieflacon met eerder gecryopreserveerde eencellige suspensies van iBC's door het in een water- of kralenbad van 37 graden Celsius te broeden totdat er geen zichtbare bevroren media zijn.

Breng met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter de celsuspensie over naar een conische buis van 15 milliliter. Voeg zes tot 10 milliliter DMEM/F12 druppelsgewijs toe aan de celsuspensie. Meng en centrifugeer voorzichtig op 300 RCF gedurende vijf minuten om de cellen te pelleteren.

Adem het supernatant op en resuspendeer de celpellet in één milliliter Basal Cell Medium met een P1000 micropipette. Bereid een aliquot van 10 microliter voor en voer een celtelling uit. Centrifugeer de cellen op 300 RCF gedurende vijf minuten.

Aspirateer het supernatant en resuspendeer de cellen met een dichtheid van 4.000 cellen per microliter in de eerder ontdooide 3D-matrix met een P1000-micropipette. Voeg met een P200-micropipette een druppel van de matrixoplossing toe die overeenkomt met ongeveer 25 tot 50 microliter aan de basis van elke put van een met weefselkweek behandelde plaat met 12 putten. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten.

Voeg vervolgens voldoende basaal celmedium toe aan elke put om de druppel volledig onder te dompelen met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter. Breng de plaat terug naar een bevochtigde incubator. Voer cellen om de twee dagen met behulp van verse Basal Cell Medium.

Voeg vers medium toe aan de zijkant van de put met een serologische pipet van vijf milliliter en zorg ervoor dat de druppel van cellen niet wordt verstoord. Ontdooi een voldoende volume van de 3D-matrix op ijs. Houd het op ijs tot het klaar is voor gebruik.

Na ongeveer vijf tot zeven dagen broeden van kweekplaten, aspirateer het medium uit elke put en gebruik vervolgens een P1000 micropipette, voeg een milliliter dispase II rechtstreeks toe aan de sferoïden om te dissociëren van de druppel van de matrix. Plaats het bord in een incubator van 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Gebruik een P1000-micropipette om de dispase te mengen door twee keer op en neer te pipetteren, waardoor grote klonten van de 3D-matrix worden gebroken.

Breng de plaat terug naar 37 graden Celsius gedurende nog eens 30 tot 40 minuten, zodat de matrix volledig kan oplossen. Wanneer de druppel van de 3D-matrix niet langer zichtbaar is onder de lichtmicroscoop, voegt u de vrij zwevende sferoïden toe aan een conische buis van 15 milliliter met behulp van een serologische pipetpunt van vijf milliliter. Voeg DMEM/F12 toe voor een eindvolume van 10 milliliter per conische buis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 200 RCF om de sferoïden te pelleteren.

Aspirateer het supernatant en voeg één milliliter van 0,05% trypsine toe voor elke initiële gedissocieerde druppel. Incubeer bij 37 graden Celsius en tritureer het om de twee tot drie minuten. Evalueer de oplossing om de paar minuten met de lichtmicroscoop.

Wanneer meer dan 90% van de sferoïden is gedissocieerd aan enkele cellen, voeg dan 10% foetaal runderserum toe aan het trypsine. Filter de cellen door een celzeef van 40 micrometer en centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 RCF. Voer een celtelling uit en resuspensieer de cellen gelijkmatig met een dichtheid van 400 cellen per microliter ontdooide 3D-matrix.

Vermijd het introduceren van luchtbellen. Resuspendeer zoveel druppels als nodig is voor downstream-toepassing. Herhaal dit proces voor elke put.

Na 10 tot 14 dagen van de meest recente passage, dissociëren de sferoïden naar een eencellige suspensie zoals eerder aangetoond en voer een celtelling uit. Resuspendeer de cellen in sorteerbuffer. Dit zal de belangrijkste populatie zijn.

Breng een kleine aliquot van 25 tot 50 microliter over op een aparte buis. Dit zal de kleine populatie zijn. Voeg geconjugeerd anti-NGFR-antilichaam toe aan de hoofdcelpopulatie.

Voeg isotype controle antilichaam toe aan de kleine celpopulatie. Bescherm de cellen tegen licht en houd ze 30 minuten op ijs met tussenpozen Triturateer de cellen om pelletvorming te voorkomen. Voeg na 30 minuten de sorteerbuffer toe aan elke buis cellen.

Centrifugeer cellen op 300 RCF gedurende vijf minuten. Aspirateer het supernatant, resuspenseer de gepelletiseerde cellen in de sorteerbuffer en voeg levende of dode celvlek toe. Gebruik een geschikte NGFR-positieve gatingstrategie om voldoende NGFR-positieve cellen te sorteren voor noodzakelijke downstream-toepassingen.

Bereid poreuze membraaninzetstukken van 6,5 millimeter voor door een matrix van 200 microliter aan de apicale kamer toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant. Plaats het op 37 graden Celsius gedurende ten minste twee uur voordat het nodig is. Zuig de coatingmatrix uit de apicale kamer van de insert.

Voeg 500 microliter basaal celmedium toe aan de basolaterale kamer. Resuspendeer ten minste 30.000 gesorteerde NGFR-positieve cellen in 100 tot 200 microliter Basal Cell Medium en breng over naar de apicale kamer met behulp van een P200-micropipette. Herhaal dit voor de resterende putten.

Plaats de plaat in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius. In twee tot drie dagen aspirateer apische en basolaterale kamers en voeden met vers Basal Cell Medium. Controleer de apicale kamer dagelijks met lichtmicroscopie.

Wanneer cellen meer dan 80% confluentie bereiken, vervang dan Basal Cell Medium door ALI differentiatiemedium in zowel apicale als basolaterale kamers. Bescherm het ALI-differentiatiemedium tegen licht door mediacontainers in folie gewikkeld te houden en door waar mogelijk bovenlichten uit te schakelen. De volgende dag adem het medium uit de apicale kamer, waardoor het apicale oppervlak aan lucht wordt blootgesteld.

Vervang de ALI-differentiatiemedia in de basolaterale kamer om de twee tot drie dagen. Controleer het uiterlijk van de cultuur om de één tot twee dagen. Zuig zorgvuldig alle opgehoopte vloeistof uit de apicale kamer zonder de cellaag te verstoren.

Voeg voorzichtig 100 microliter PBS zonder calcium of magnesium toe aan de apicale kamer om vuil of slijm te verwijderen. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en adem pbs vervolgens voorzichtig op. Beoordeel de TEER op epitheliale integriteit.

Na zeven tot 10 dagen blootstelling aan de lucht, observeer voor het verschijnen van multicilia met behulp van lichtmicroscopie. Afhankelijk van het geplande experiment en de uitlezing kunnen cellen worden geanalyseerd na 14 tot 28 dagen blootstelling aan de lucht. Na 10 tot 14 dagen van de meest recente 3D-cultuurpassage, dissociëer de sferoïden naar eencellige suspensie zoals eerder aangetoond.

Voer een celtelling uit, resuspendeer de celsuspensie in cryopreservatiemedium in een cryoviaal. Plaats cryovialen in een container om een gestage daling van de temperatuur te garanderen. En breng over naar min 80 graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur, gevolgd door overdracht naar min 150 graden Celsius voor langdurige opslag.

Met deze gating-techniek was 28% van de levende enkelvoudige cellen NGFR-positief. Na twee dagen waren individuele cellen aanvankelijk gemakkelijk te identificeren en hadden ze een langwerpig spindelvormig uiterlijk. Na nog eens twee dagen vormden de cellen een confluente en losjes verpakte monolaag.

In de daaropvolgende dagen tot weken vormden de cellen een dicht opeengepakte, zeer cellulaire epitheellaag. En na zeven tot 10 dagen was er een duidelijke opkomst van kloppende trilharen en slijmproductie. De TEER van monsters werd gemeten en de resultaten waren vergelijkbaar met metingen van primaire luchtwegepitheelcelcontrolemonsters.

Daaropvolgende fixatie met paraform aldehyde en immunolabeling voor canonical airway epithelial cell markers werd uitgevoerd voor onder andere MUC5AC en geacetyleerd alfa-tubuline. Volgens dit protocol kunnen onderzoekers een groot aantal van de patiënt afgeleide luchtwegepitheelcelculturen genereren om verschillende uitlezingen te beoordelen, waaronder die welke de functies van basale, secretoire en multiciliated cellen in zowel ziekte als gezondheid testen.