Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Dit protocol beschrijft de fabricage van microgelstaven die met elkaar verbonden zijn tot microporiënsteigers. Deze steigers kunnen worden gebruikt in combinatie met cellen die de benodigde ruimte bieden voor efficiënte celinteractie. De twee verschillende soorten microgelstaven kruisen elkaar bij contact.

Bij de hoge beeldverhouding leidt dit tot grotere poriën met behoud van de stabiliteit van de steiger met minder synthetisch materiaal in vergelijking met bolvormige microgels. Microporiën scaffolds zouden de infiltratie en interactie van endogene cellen aanzienlijk verbeteren om beschadigd weefsel te herstellen. De grote poriën zullen de vorming van bloedvaten vergemakkelijken om voedingsstoffen uit te wisselen naar het groeiende weefsel.

De reductie van steigermateriaal is gunstig omdat er meer open ruimtes zijn voor weefselvorming, wat belangrijk is voor zowel in vitro als in vivo toepassingen. Een cruciaal aspect is de microfitische chipulatietechniek. Om een continue productie van microgelstaven te garanderen, moet het product effectief uit de buis worden getransporteerd zonder verstopping.

Om te beginnen steekt u de naalden in de polyethyleenbuizen en verwijdert u het gas uit de spuit en de buis. Steek vervolgens een extra polyethyleenbuis in de uitlaat voor productverzameling. Plaats vervolgens alle glazen spuiten en de spuitpompen en steek elk uiteinde van de slang in de overeenkomstige inlaat.

Richt vervolgens de microscoop op de doorsnede van het oliewater. Start de eerste oliespuitpomp om het kanaal eerst met olie te vullen, om te voorkomen dat het kanaal bevochtigt door de gedispergeerde fase. Verlaag vervolgens het eerste oliedebiet tot 30 microliter per uur en start de pomp van de pre-polymeerspuit totdat de gedispergeerde waterige fase bij de doorsnede kan worden waargenomen.

Stel vervolgens het pre-polymeerdebiet in op 30 microliter per uur en richt de microscoop op de uitlaat. Start vervolgens de tweede oliespuitpomp en wacht tot het stroomregime stabiel is. Plaats de uitlaatbuis in een opvangbak en stel het UV-bestralingssysteem zo in dat de instralingssterkte tussen 900 en 1000 milli watt per vierkante centimeter ligt.

En de bestralingsplek is het rechte kanaalgedeelte voor de uitlaat. Pas vóór uv-bestraling de stroomsnelheden van het prepolymeer en de eerste olie aan om de gewenste beeldverhouding in het bereik van 3,0 tot 4,5 te bereiken en stel de bestralingstijd van de gedispergeerde fase in op ongeveer 2,3 seconden, afhankelijk van de grootte van de bestralingsplek. Start vervolgens uv-bestraling en pas indien nodig de stroomsnelheden opnieuw aan volgens de vorige subsectie.

Wijzig vervolgens de verzamelcontainer en noteer de begintijd en stroomsnelheden van de productverzameling. Als u de verzameling wilt beëindigen, verwijdert u de verzamelcontainer met vermelding van de tijd. Stop daarna met bestraling en alle spuitpompen.

Was het product vervolgens vijf keer elk met n-Hexaan, isopropanol en gedeïoniseerd water. Verwijder vervolgens het supernatant na staafbezinking. Breng de eerste componentdispersie over in een conische transparante injectieflacon van 1,5 of twee milliliter.

Voeg vervolgens het tweede onderdeel op een gecontroleerde manier toe in een continue bewerking met een pipet van 100 microliter en meng de inhoud direct met behulp van de pipet om vloeistof op te nemen en opnieuw toe te voegen. Voeg vervolgens G R G D S P C-oplossing toe aan de onderling verbonden structuur om alle resterende epoxygroepen te wijzigen met het cellijmpeptide met een vrije amine en thyal en laat het 's nachts bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de niet-gereageerde moleculen door te wassen met gedeïoniseerd water en verwijder het supernatant.

Nadat u het waterniveau hebt verlaagd, opent u de injectieflacon en roeit u uit met UV-licht van golflengte, 250 tot 300 nanometer. Sluit vervolgens de injectieflacon en breng de injectieflacon over op een schone bank. Daarna wassen met steriel water.

Vervang het water in de injectieflacon door celkweekmedia en laat gedurende vijf minuten equilibratie toe. Breng vervolgens de macro poreuze steiger over in een celkweekputplaat voor het experiment door een spatel te gieten of te gebruiken. Confocale microscopie onthulde dat het 3D macro poreuze construct was samengesteld uit onderling verbonden amine en epoxy gefunctionaliseerde microgelstaven.

De constructie vertoont een compacte geometrie van ongeveer 10.000 microgelstaven die binnen twee of drie seconden zijn gevormd. Effectieve Young's modulus van amine en epoxy microgel staafjes samen met amine en epoxy micro gel bollen wordt gemeten door nano-inkeping. Om actieve functionele groepen te detecteren, kan fluoresceïne-isothiocyanaat worden gebruikt om primaire aminogroepen te visualiseren en fluoresceïne-amine-isomeer kan worden gebruikt om epoxygroepen te labelen.

De amine microgelstaven hebben afmetingen met een gemiddelde lengte van 553 micrometer en een gemiddelde breedte van 193 micrometer in gedeïoniseerd water, wat resulteert in een beeldverhouding van ongeveer 3,0. De gemiddelde waarden van de macroporiën en de steigers samengesteld uit microgelstaven zijn 100 micrometer, waarbij 90% van de poriegroottes varieert van 30 micrometer tot meer dan 150 micrometer. De bol als microgels resulteert in clusters met poriegroottes tussen ongeveer 10 en 55 micrometer, met een gemiddelde waarde van ongeveer 22 micrometer.

De beschreven microgelstaven zijn ontworpen om onderling verbonden microporiënsteigers te produceren door willekeurige menging. Een gecontroleerd mengproces zou in de toekomst de fabricage van meer op maat gemaakte steigergeometrieën mogelijk kunnen maken. De stijfheid van de microgels en de biochemische signalen kan worden gevarieerd op basis van de verkoopvereisten.

Door verschillende bouwstenen te combineren kan binnen één steiger een grote verscheidenheid aan geometrieën en eigenschappen worden bereikt. Op deze manier kunnen we specifieke cellen efficiënt targeten om meercellige weefsels te vormen.