Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Het kantelen van het monsterstadium biedt een eenvoudige en generaliseerbare manier om de oriëntatieverdeling van deeltjes tijdens cryo-EM-gegevensverzameling met één deeltje te vergroten. De uniforme verdeling van deeltjes die wordt verkregen als gevolg van het kantelen van het monsterstadium maakt de algehele kaartkwaliteit en interpreteerbaarheid mogelijk. Begin met het uitlijnen van de microscoop om parallelle verlichting van het monster te garanderen en coma-aberraties te minimaliseren.

Om de vierkanten te identificeren die geschikt zijn voor gegevensverzameling, neemt u een rasteratlas op zonder podiumkanteling of met podiumkanteling, die een overzicht geeft van de algehele rasterkwaliteit en een eerste indicatie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling. Inspecteer de vierkanten handmatig bij de vergroting die wordt gebruikt in het vierkante acquisitieknooppunt. Zoek naar de vierkanten waar de folie intact is, er niet uitgedroogd uitziet en een ideale ijsdikte heeft, en verplaats het monsterstadium naar een vierkant van belang.

Bepaal de eucentrische hoogte voor de podiumpositie met behulp van een alfa-wiebelaar op ongeveer 15 graden podiumkanteling en pas de Z-hoogte aan om het podium op eucentrische hoogte te brengen met behulp van het toetsenbordpaneel voor de microscoop. Zorg ervoor dat de beeldverschuiving minimaal is tijdens de alfa-wiebelroutine. Om een nauwkeurigere Z-hoogte te vinden, schat u deze in de focuserknoop op de vergroting die wordt gebruikt in de vierkante acquisitieknoop.

Pas de instellingen voor het focuserknooppunt aan en schakel de fijne Z-focusoptie in of uit tijdens de eerste wachtrij van vierkanten. Druk vervolgens op Simuleren. Kantel de monstertrap naar de gewenste kantelhoek voor gegevensverzameling op de ware eucentrische hoogte en plaats het podium indien nodig opnieuw.

Druk op Simuleren in het vierkante acquisitieknooppunt om te beginnen met het in de rij plaatsen van doelen voor blootstellingen aan hele acquisitieknooppunten. Selecteer vervolgens een Z-focusdoel en gebieden met gaten die geschikt zijn voor hoge vergrotingsbelichtingen en dien de doelen in de wachtrij in voor beeldvorming. Breng het monsterstadium terug naar de niet-gekantelde toestand en ga vervolgens naar het volgende vierkant.

Herhaal deze stappen totdat een voldoende aantal volledige blootstellingen in de wachtrij is geplaatst. Zodra alle vakjes in de wachtrij staan, gaat u naar het hele targetingknooppunt en drukt u op Doelen in wachtrij verzenden. Selecteer Toestaan voor gebruikersverificatie van geselecteerde doelen in knooppuntinstellingen en inspecteer handmatig de doelen die zijn geselecteerd door het acquisitieknooppunt met hoge vergrotingsbelichting om te testen of de geautomatiseerde EM-gatzoeker nauwkeurig de geschikte gebieden voor beeldacquisitie kan identificeren wanneer de monsterfase wordt gekanteld.

Zodra de gebruiker tevreden is met de nauwkeurigheid van de targeting, schakelt u de optie Gebruikersverificatie van geselecteerde doelen toestaan uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling. De representatieve beelden van het raster bij vierkante vergroting met verschillende kantelhoeken verzameld dichtbij en ver van de eucentrische Z-hoogte worden hier getoond. Het midden van de balk wordt aangegeven door het midden van de rode concentrische ringen en de groene pijl geeft het vierkant van belang aan.

Er is een gebroken rasterfunctie naast het vierkant van belang ter referentie. Hier worden de representatieve gatbelichtingen en 2D-klassegemiddelden verzameld bij 0 graden, 30 graden en 60 graden kantelhoeken. Hoewel de eiwitconcentratie onveranderd is over de verschillende kantelhoeken, zorgt een hogere kantelhoek ervoor dat het afgebeelde gebied drukker lijkt in termen van deeltjesconcentratie.

2D-klassegemiddelden die worden beïnvloed door overbevolking worden weergegeven in dit rode vak. De eenvoud van het protocol stelt elke standaardgebruiker van de microscoop in staat om eenvoudig een gekantelde strategie voor gegevensverzameling aan te passen.